Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.
Синаптической передачи является чрезвычайно быстрый процесс. Действие потенциал приводом приток Са 2 + в пресинаптических окончаний, через напряжения закрытого кальциевых каналов (VGCCs), расположенных в релизе лица мембраны, является триггером для слияния пузырьков и высвобождение нейромедиаторов. Решающее значение для быстроты синаптической передачи является пространственная и временная синхронизация между прибытием потенциала действия, VGCCs и высвобождение нейромедиатора машин. Возможность напрямую записывать Ca 2 + токи от выпуска номинальной мембраны отдельных пресинаптических окончаний необходимо для точного понимания взаимосвязи между пресинаптической Са 2 + и высвобождения нейромедиатора. Доступ к пресинаптической релиз лица мембраны для электрофизиологические записи не доступен в большинстве препаратов и пресинаптической Са 2 + запись была охарактеризована с помощью методов визуализации и макроскопического тока MeasureMeНТС – методы, которые не имеют достаточного временное разрешение для визуализации запись Ca 2 +. Характеристика VGCCs непосредственно на отдельных пресинаптических окончаний не удалось в центральных синапсах и до сих пор успешно достигнуто только в чашечки типа синапса куриного мерцательной ганглии и в крысиных чашечек. Мы успешно решили эту проблему в гигантском ретикулоспинальных синапса миноги спинного мозга, разработав остро диссоциированную подготовку спинного мозга, что дает отдельные ретикулоспинальных аксоны с функциональными пресинаптических окончаниях, лишенных постсинаптических структур. Мы можем флуоресцентно маркировать и идентифицировать отдельные пресинаптические терминалы и нацелить их для записи. Использование этого препарата, мы охарактеризовали VGCCs непосредственно на выпуск лице отдельных пресинаптических терминалов, использующих иммуногистохимии и электрофизиологии подходы. Ca 2 + токи были записаны непосредственно на выпуск лица мембраны OF отдельные пресинаптические терминалы, первый такой записи будет осуществляться в центральных синапсах.
Синаптической передачи является чрезвычайно быстрый и точный процесс. Действие потенциал вторжение в пресинаптических окончаний приводит к открытию VGCCs расположенных в релиз лица мембраны, что привело к росту пресинаптической Са 2 +, действующей в качестве триггера для слияния пузырьков и высвобождение нейромедиаторов 1. Все эти шаги происходят в течение сотен микросекунд 2, и, следовательно, требуют жесткой пространственной сцепление VGCCs в слияния пузырьков машин 3. Пресинаптические Са 2 + потоки были, прежде всего, характеризуется через визуализации подходов с использованием Са 2 + чувствительные красители 4. Включение Са 2 + буферы, которые модулируют Са 2 + в пресинаптических нейронов был использован, чтобы косвенным образом характеризует соотношение между кальцием и пресинаптических нервных импульсов 3. Кроме того, модуляции пресинаптическое бесплатно Ca 2 + концентрации по uncaging Са 2 + 5 или записи macroscopiС Са 2 + токи были использованы в сочетании с мерами слияния пузырьков и / или высвобождения; такие как измерения емкости 6 или постсинаптические ответы 2 для решения тот же вопрос. Однако, характеризуя Ca 2 + токи непосредственно на выпуск лица, специализированный раздел пресинаптической мембраны, где деполяризация мембраны переводится в Са 2 + токи вызове синаптических везикул слияние и высвобождение нейромедиаторов, является неотъемлемой точно измерить в Са 2 + Требование синаптических пузырьков слияния. Кроме того, способность непосредственно характеризуют Ca2 + токи на отдельных пресинаптических окончаний, в сочетании с точной одновременных измерений слияния пузырьков и выпуска позволяет точным выяснение временной зависимости между временем ходе потенциала действия, пресинаптического Ca2 + тока, слияния пузырьков и релиз. Доступ к релиз лица мембраныне доступен в большинстве пресинаптических окончаний за счет близко друг к другу на постсинаптических дендритов. Это недоступность является одним из основных препятствий в характеристике VGCCs так как это предотвращает прямые измерения тока на отдельных пресинаптических окончаний. Прямая характеристика пресинаптических Ca 2 + токов в отдельных пресинаптических окончаний до сих пор не удалось в центральных синапсах и удалось осуществить только в двух пресинаптических окончаний calyceal типа; Чашечка типа синапса из куриных мерцательная ганглий 7-10 и крысы чашечек 11,12. Во всех других пресинаптических окончаний включая гигантского ретикулоспинальных синапса в миноги спинного мозга 13, отсутствие доступа к пресинаптической релиз лица мембраны потребовало использование непрямых подходов, таких как изображения Ca 2 + до изучения пресинаптические Ca 2 + потоков.
<img alt="Рисунок 1" fо: содержание-ширина = "5 дюймов" src = "/ файлы / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" ширина = "500" />
Рис.1 миноги гигант ретикулоспинальных синапс. (А) Сечение миноги спинного мозга с указанием Dorso-вентральной ориентацию. Ретикулоспинальных аксоны выделены зеленым звездочкой. (Б) 3-D реконструкция ретикулоспинальных синапса в миноги спинного мозга, показывая пресинаптическое ретикулоспинальных аксон делает многочисленные мимоходом контактов (отмечены зелеными стрелками) на постсинаптического нейрона 13. Пресинаптические терминалы были помечены с Alexa Fluor 488 гидразида с сопряженными фаллоидином (зеленый), в то время как постсинаптического нейрона была заполнена Alexa Fluor 568 гидразида (красный).
Минога гигантские ретикулоспинальных аксоны, расположенные в брюшной области спинного мозга параллельно ростральной-каудальной оси рисунке 1a, образованию многочисленных мимоходом синаптических контактов на нейронахспинного вентральной рог 14 Рисунок 1б 13. Макроскопическая цельноклеточные Са 2 + токи были записаны с ретикулоспинальных аксонов в неповрежденной спинного мозга 13,15. Тем не менее, предыдущие слепые попытки прямого измерения Са 2 + токи в ретикулоспинальных аксонов в неповрежденной миноги спинного мозга с использованием методики патч зажим клеток-прилагается оказались безуспешными 13 в связи с отсутствием доступа к пресинаптической релиз лица мембраны вследствие противостоящих постсинаптических процессов Рисунок 1б. Высвобождение лицо мембраны были ранее доступны удалением постсинаптического нейрона 11, механическое возмущение синапсе перед записью 12 или ферментативной обработки в сочетании с механической диссоциации 16. Учитывая сложный организация спинного мозга, было бы оказаться чрезвычайно трудно определить постсинаптического нейрона и убрать его механически или возмутить гоэ синапс. Таким образом, мы решили использовать ферментативную обработку 17 с последующим механической диссоциации.
Используя этот подход, мы разработали остро диссоциированную подготовку миноги спинного мозга, что дает жизнеспособные изолированных ретикулоспинальных аксоны с функциональными пресинаптических окончаниях, лишенных любых постсинаптических процессов, тем самым обеспечивая неограниченный доступ к отдельным пресинаптических окончаний. В сочетании со стандартным перевернутый микроскоп и флуоресцентных изображений, это позволяет нам выявить и против отдельных флуоресцентно-определены пресинаптические терминалы, с помощью патча пипетки, содержащую раствор записи, который изолирует Ca 2 + токи Фиг.4С и рисунок 4d, для записи с помощью сотового прилагается метода фиксации. Са 2 + токи были записаны непосредственно на пресинаптической релиз лица мембраны индивидуального пресинаптических окончаний рисунке 4е. Это significaнт прорыв в области синаптической передачи, так как это первый такой записи будет осуществляться в центральных синапсах.
Наш протокол диссоциации Показательно, уступая изолированных ретикулоспинальных аксоны лишенные постсинаптической прогнозы рис 2F, но которые тем не менее сохраняют функциональную пресинаптическое терминалы Рисунок 4с и рисунок 4d. Отсутствие постсинаптич…
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA.
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.2 µm syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
22×60 mm coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
Antifreeze | Prestone | ||
Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
High vacuum grease | Dow-Corning | ||
Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
Industrial grade Nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
Petri dish 100×15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
Petri dish 35×10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300000 |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
Primary antibodiesR-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
Protease Type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
Schot Duran Preesure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
Slicing chamber | Leica Biosystems | 1.4046E+10 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium hydroxide | S8045 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
Xenon lamp | Nikon |