Akutt dissosiasjon av niøye Reticulospinal Axoner å Aktiver Opptak fra Release Face Membran av enkelte funksjons presynaptiske terminaler

Summary

Recording Ca²⁺ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca²⁺ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Abstract

Synaptisk overføring er en svært rask prosess. Aksjonspotensialet drevet tilførsel av Ca2 ⁺ inn i presynaptiske terminalen, gjennom spenningsstyrte kalsiumkanaler (VGCCs) plassert i utløser flens membran, er utløseren for vesikkelfusjon og nevrotransmitter-frigjøring. Avgjørende for hurtighet av synaptisk transmisjon er romlig og tidsmessig synkronitet mellom ankomsten av aksjonspotensialet, VGCCs og neurotransmitterfrigjørelse maskiner. Muligheten til å direkte spille Ca ^{2 +} strøm fra utgivelsen flens membran av individuelle presynaptiske terminaler er avgjørende for en presis forståelse av forholdet mellom presynaptiske Ca ^{2 +} og neurotransmitterfrigivning. Tilgang til den presynaptiske utgivelsen ansiktet membran for elektrofysiologisk registrering er ikke tilgjengelig i de fleste forberedelser og presynaptisk Ca ^{2 +} oppføring har blitt karakterisert ved hjelp av bildeteknikker og makroskopisk dagens måling avNTS – teknikker som ikke har tilstrekkelig tidsoppløsning for å visualisere Ca ^{2 +} oppføring. Karakterisering av VGCCs direkte på enkelt presynaptiske terminaler har ikke vært mulig i sentrale synapser og har så langt blitt oppnådd bare i beger-type synapse av dama stråle ganglion og i rotte calyces. Vi har nå løst dette problemet i den gigantiske reticulospinal synapse av niøye ryggmargen ved å utvikle en akutt dissociated utarbeidelse av ryggmargen som gir isolerte reticulospinal axoner med funksjonelle presynaptiske terminaler blottet for postsynaptiske strukturer. Vi kan fluorescently merke og identifisere individuelle presynaptiske terminaler og målrette dem for innspilling. Ved hjelp av dette preparatet har vi preget VGCCs direkte på utgivelsen ansiktet av individuelle presynaptiske terminaler ved hjelp av immunhistokjemi og elektrofysiologiske metoder. Ca ^{2 +} strøm er ført direkte på utgivelsen flens membran of individuelle presynaptiske terminaler, første slikt opptak kan utføres ved sentrale synapser.

Introduction

Synaptisk transmisjon er en ekstremt rask og nøyaktig prosess. Aksjonspotensial invasjon av den presynaptiske terminalen fører til åpning av VGCCs ligger i utgivelsen flens membran, den resulterende økningen i presynaptiske Ca ^{2 +} fungerer som trigger for vesikkelfusjon og neurotransmitterfrigivning ^en. Alle disse trinn forekommer innen flere hundre mikrosekunder ^2, og dermed krever stramme romlig kopling av VGCCs til vesikkel fusjons maskiner ^3. Presynaptiske Ca ^{2 +} flukser er først og fremst preget gjennom avbildning tilnærminger ved hjelp av Ca ^{2 +} sensitive fargestoffer ^fire. Innlemming av Ca ^{2 +} buffere som modulerer Ca ^{2 +} i presynaptiske nerveceller har blitt brukt for å karakterisere indirekte forholdet mellom presynaptisk kalsium og neurotransmisjon ^3. I tillegg moduler den presynaptiske gratis Ca ^{2 +} konsentrasjon av uncaging Ca ^{2 + 5} eller opptak macroscopic Ca ^{2 +} strømmer har vært brukt i forbindelse med målinger av vesikkel fusjon og / eller frigivelse; som for eksempel måling av kapasitans ⁶ eller postsynaptiske svar ² for å løse det samme spørsmålet. Men karakter Ca ^{2 +} strøm direkte på utgivelsen ansiktet, den spesialiserte delen av den presynaptiske membran der membran depolarisering er oversatt til Ca ^{2 +} strøm utløsende synaptisk vesikkelfusjon og neurotransmitterfrigivning, er integrert til å få en nøyaktig måling av Ca ^{2 +} Kravet for synaptisk vesikkel fusjon. I tillegg er evnen til direkte å karakterisere Ca ^{2 +} strømmer mot de enkelte presynaptiske terminaler, kombinert med nøyaktige samtidige målinger av vesikkelfusjon og frigjøring tillater en nøyaktig forklaring av tidsforholdet mellom tidsforløpet av aksjonspotensialet, presynaptisk Ca ^{2 +} strøm vesikkelfusjon og slipp. Tilgang til utgivelsen flens membraner ikke tilgjengelig i de fleste av presynaptiske terminaler grunn til å lukke apposition av de postsynaptiske dendritter. Denne utilgjengelighet har vært en stor hindring i karakterisering av VGCCs siden det hindrer direkte målinger av strøm på individuelle presynaptiske terminaler. Direkte karakterisering av presynaptiske Ca ^{2 +} strøm på individuelle presynaptiske terminaler har så langt ikke vært mulig i sentrale synapser og har bare blitt oppnådd i to calyceal typen presynaptiske terminaler; calyx-type synapse av chick stråle ganglion ^7-10 og rotte calyces ^11,12. I alle andre presynaptiske terminaler inkludert gigantiske reticulospinal synapse i niøye ryggmarg ^13, har mangelen på tilgang til den presynaptiske utgivelsen ansiktet membran nødvendiggjort bruk av indirekte tilnærminger som Ca ^{2 +} bildebehandling å studere presynaptiske Ca ^{2 +} flukser.

<img alt="Figur 1" fo: content-width = "5in" src = "/ filer / Ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" width = "500" />
Figur 1. Lamprey giganten reticulospinal synapse. (A) Tverrsnitt av niøye ryggmarg indikerer dorso-ventral orientering. Reticulospinal axoner er markert med grønn asterix. (B) 3-D rekonstruksjon av reticulospinal synapse i niøye ryggmargen viser presynaptisk reticulospinal axon gjør mange en passant kontakter (markert med grønne piler) på den postsynaptiske nevron ^13. Presynaptiske terminalene har blitt merket med Alexa Fluor 488 hydrazid konjugert phalloidin (grønn), mens den postsynaptiske nevron har vært fylt med Alexa Fluor 568 hydrazid (rød).

Niøye gigantiske reticulospinal axoner, som ligger i den ventrale delen av ryggmargen parallelt med rostral-caudal aksen Figur 1a, skjema multiple en passant synaptiske kontakter på nevronene ispinal ventral horn ¹⁴ Figur 1b ^13. Makroskopisk hel-celle Ca ^{2 +} strøm har blitt registrert fra reticulospinal axoner i intakt ryggmargen ^13,15. Men tidligere blinde forsøk på direkte måling av Ca ^{2 +} strøm i reticulospinal axoner i intakt niøye ryggmargen ved hjelp av celle-festet patch clamp teknikken har vist seg mislykket ¹³ på grunn av mangel på tilgang til den presynaptiske utgivelsen ansikt membran på grunn av de motstridende postsynaptiske prosesser Figur 1b. Frigjørings flens membran har tidligere blitt gjort tilgjengelig ved fjernelse av den postsynaptiske nevroner ^11, mekanisk forstyrrelse av synapsen før opptak ¹² eller enzymatisk behandling kombinert med mekanisk dissosiasjon ^16.. Gitt den komplekse organiseringen av ryggmargen, ville det vise seg svært vanskelig å identifisere den postsynaptiske nevron og trekke den mekanisk eller forurolige the synapse. Derfor bestemte vi oss for å bruke enzymatisk behandling ¹⁷ etterfulgt av mekanisk dissosiasjon.

Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vi utviklet en akutt dissociated utarbeidelsen av niøye ryggmargen som gir levedyktige isolerte reticulospinal axoner med funksjonelle presynaptiske terminaler blottet for enhver postsynaptiske prosesser, og dermed gi ubegrenset tilgang til individuelle presynaptiske terminaler. I forbindelse med en standard invertert mikroskop og fluorescens bildebehandling, det gjør oss i stand til å identifisere og målrette individuelle fluorescently-identifisert presynaptiske terminaler, med en patch pipette inneholder en opptaksløsning som isolerer Ca ^{2 +} strøm Figur 4c og figur 4D, for opptak ved hjelp av celle- festet spenningsklemmeteknikken. Ca ^{2 +} strøm er ført direkte på den presynaptiske utgivelsen ansiktet membran av individuelle presynaptiske terminaler Figur 4f. Dette er en significant gjennombrudd innen synaptisk transmisjon siden den er den første opptaks å bli utført ved sentrale synapser.

Protocol

1. Utarbeidelse av Poly-D-lysin Hydrobromide Forbered 1 mg / ml poly-D-lysin-hydrobromid i 0,1 M boratbuffer (pH 8,5). Delmengde og oppbevar ved -20 ° C. 2. Poly-lysin Coating av Dekk Merk: Utfør alle rengjøring og belegg trinn i en laminær kammer. Plasser Dekk i en petriskål inneholdende 1 N saltsyre (HCl) i 2 timer. Aspirer all HCl og skyll med 70% etanol (EtOH) 2-3 x. La i 70% EtOH i 1 time. <…

Representative Results

Denne dissosiasjon protokoll Rentene sunne og funksjonelle isolerte reticulospinal axoner blottet for postsynaptiske anslag Figur 2f, men som likevel beholde funksjonelle presynaptiske terminaler som kan fremkalt synaptisk vesikkel exo-og endocytose Figur 4c og Figur 4d. Deler av de isolerte regioner av reticulospinal axoner klart kan identifiseres i henhold lysmikroskopi å være klar over eventuelle andre nevrale prosesser tillate ubegrenset tilgang til reticulo…

Discussion

Vår dissosiasjon protokollen er betydelig ved å gi etter isolerte reticulospinal axoner blottet for postsynaptiske anslag Figur 2f, men som likevel beholde funksjonell presynaptiske terminaler Figur 4c og Figur 4d. Fraværet av postsynaptiske prosesser motstående den presynaptiske terminalen tillater direkte opptak tilgang til den presynaptiske frigjøring flens membran ved enkle presynaptiske terminaler, som tidligere ikke mulig i sentrale synapser og hell oppnådd …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
0.2 µm syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22×60 mm coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade Nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100×15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35×10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodiesR-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Preesure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	1.4046E+10
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon