Abstract
خلايا تستجيب لchemokine التحفيز عن طريق فقدان شكلها جولة في عملية تسمى الاستقطاب، وعن طريق تغيير توطين التحت خلوية من العديد من البروتينات. وقد استخدمت تقنيات التصوير الكلاسيكية لدراسة هذه الظواهر. ومع ذلك، أنها تتطلب اكتساب اليدوي من العديد من الخلايا تليها تستغرق وقتا طويلا الكمي من التشكل وشارك في توطين تلطيخ عشرات الخلايا. هنا، يتم وصف طريقة سريعة وقوية لدراسة هذه الظواهر على عينات تتكون من عدة آلاف من الخلايا باستخدام التدفق الخلوي التصوير التكنولوجيا التي تجمع بين مزايا المجهر مع تلك من عداد الكريات. استخدام الخلايا الليمفاوية T حفز مع CCL19 وتلطيخ لجزيئات MHC من الدرجة الأولى والأكتين الخيطية، وتقدم استراتيجية النابضة لقياس في وقت واحد درجة التعديلات شكل ومدى التعاون توطين علامات التي تتأثر CCL19 الإشارات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الاستراتيجية النابضة سمحت لنا observه الفصل بين الأكتين الخيطية (في الجبهة) وفسفرته Ezrin-Radixin-Moesin (الفوسفات-ERM) البروتينات (في العمق) في خلايا T الاستقطاب بعد التحفيز CXCL12. وكانت هذه التقنية مفيدة لمراقبة تأثير حظر على الاستقطاب من عنصرين مختلفين أيضا: تثبيط الأكتين البلمرة التي كتبها مثبط الدوائية والتعبير عن المسوخ من Par6 / شاذة PKC يشير المسار. وهكذا، يظهر دليل على أن هذه التقنية مفيدة لتحليل كل التعديلات الشكلية وإعادة التوزيع البروتين.
Introduction
كيموكينات هي بروتينات قابلة للذوبان الصغيرة التي تجذب الخلايا لمواقع متخصصة 1. ولذلك، فإنها تشارك في الموضع الصحيح من الخلايا في الأنسجة، وهي وظيفة حاسمة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء. الجهاز المناعي ليست استثناء لهذه القاعدة لأنها تعتمد على عمل العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تعمل في تناسق لجبل استجابة مناعية فعالة. من خلال التحكم في موقع معين من نوع واحد الخلايا المناعية في حالة معينة، كيموكينات هي المطلوبة مسبقا قبل أن يتم الكشف عن المستضدات الأجنبية وتحييدها.
في الخلايا الليمفاوية T على وجه الخصوص، كيموكينات تربط لمستقبلات محددة السطح والتي، على المشاركة، وانتزاع العديد من الإشارات بين الخلايا (ارتفاع الكالسيوم، ERK الفسفرة، وتفعيل رو GTPases، وزيادة في integrins تقارب وهيكل الخلية التعديلات) التي تفضل T خلية حركية 2،3. على المستوى الخلوي، ويمكن للمرء أن يلاحظ التغيرات المورفولوجية أثار chemokine على التحفيز.هذه التغيرات في الأشكال خلية مثيرة خصوصا في خلايا T: يستريح خلايا T لها مورفولوجيا مستديرة تشبه حبة عند السفر في مجرى الدم. ومع ذلك، فإن الاستشعار عن وجود كيموكينات في مواقع التهابات أو على القرب من الأجهزة اللمفاوية هو الذهاب الى تغيير شكل خلايا T التي تعتمد الآن على "اليد مرآة" مورفولوجيا نموذجية تتكون من شكل ثنائي القطب: حافة الرائدة في الجبهة وميزة زائدة، أو قدم ذنبية، في الجزء الخلفي 4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمكونات داخل الخلايا تفصل في هذه المناطق المعاكس اثنين من خلية T المستقطبة للحفاظ على الهجرة. على سبيل المثال، ويزيد من خيوط الأكتين البلمرة على chemokine التحفيز 5 و الأكتين بلمرة تتراكم في الجزء الأمامي من T خلية الاستقطاب 2. من ناحية أخرى، والعديد من البروتينات، مثل البروتينات فسفرته من Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) الأسرة التي تربط بين غشاء البلازما إلى القشرية الهيكل الخلوي F-الأكتين، وإعادة توطين في قدم ذنبية من الاستقطابخلايا T 6. ومن المثير للاهتمام، نحن وغيرنا قد أظهرت أن هناك حاجة لهذه العملية الاستقطاب T الهجرة الخلية. والواقع أن أي علاج الذي يتداخل مع الاستقطاب تمنع الحركة الخلوية. على سبيل المثال، وتثبيط لنشاط أعضاء من البروتين غير نمطية تحركات C (PKC) أسرة، وكتل PKCζ وPKCι T الاستقطاب الخلية ولها عملية المسح المهاجرة من الخلايا الجذعية 7. وينظم T خلية الاستقطاب أيضا رو GTPases. لقد أظهرنا أن تعديل النشاط RhoA من البروتين Fam65b وصف مؤخرا يتداخل مع التغيرات الخلايا التائية في التشكل وقدرتها على الهجرة في مقايسة Transwell 6. كما الاستقطاب هو خطوة شرط أساسي لحركية الخلوية، وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على تحديد بأنها قراءات الرئيسية من الردود chemokine. تم إجراء تعديلات شكل خلية قياس سابقا يدويا 8. ومع ذلك، هذا النوع من القياس الكمي هو جدا تستغرق وقتا طويلا، بحيث عادة سوى عدد قليلتؤخذ عشرات الخلايا في الاعتبار.
هنا، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس بسرعة درجة التعديلات شكل من الخلايا الليمفاوية T تتعرض لchemokine التحفيز. تدفق التصوير الخلوي التكنولوجيا (انظر الجدول من الكواشف محددة / معدات) يستخدم، والذي يجمع بين مزايا تدفق عداد الكريات والمجهر 9 لقياس كفاءة كمية من الخلايا الاستقطاب في ظروف مختلفة من التحفيز chemokine. بالإضافة إلى تقدير حجم التعديلات الشكلية التي يمكن للمرء أن قياس بقوة مع هذه التكنولوجيا، فمن الممكن أيضا لتقييم التغيرات في توطين التحت خلوية من بعض البروتينات على chemokine الإشارات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الخلايا اللمفاوية T
- إعداد الماوس الأساسي أو خلايا T الإنسان كما هو موضح 10،11.
- زراعة خلايا T الإنسان في كامل المتوسطة RPMI مع المصل البشري 10٪ AB في مناطق ذات كثافة من 2-3 × 10 6 خلية / مل.
ملاحظة: استخدام مصل الجنين العجل (FCS) بدلا من المصل البشري يمكن أن تثير الاستقطاب عفوية لجزء كبير من الخلايا T الإنسان في الثقافة. تبقى هذه الخلايا في الثقافة لمدة 4 - 5 ايام وعملية أخرى لهم في أي وقت خلال هذه الفترة. - الحفاظ على خلايا فأر T في كامل المتوسطة RPMI تستكمل مع 10٪ FCS في مناطق ذات كثافة خلية مماثلة. استخدام على الفور أو في اليوم التالي، وبعد O / N الثقافة عند 37 درجة مئوية في ظل وجود 10 نانوغرام / مل IL7.
- زراعة T خط الخلية CEM الإنسان في استكمال كامل RPMI مع 10٪ FCS.
2. تحفيز Chemokine
- غسل 5 × 10 5 خلايا لكل حالة تجريبية في المتوسط الدافئة HBSS تستكمل مع 10 ملي Hepeالصورة. وبالنسبة لبعض التجارب، وشارك في بالنقل خلايا T الإنسان الأساسي في اليوم السابق مع 2 ميكروغرام pmaxGFP و 8 ميكروغرام pcDNA3.1 + (ناقلات الفارغة، والسيطرة)، PKCζ كيناز الميتة، أو البلازميدات Par6 N-الطرفية.
- resuspend الكرية خلية في المتوسط الدافئة HBSS-HEPES (استخدام 0.3 مل × عدد الظروف التجريبية).
- توزيع الخلايا في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
ملاحظة: ولذلك، فإن أنبوب واحد المقابلة لحالة تجريبية واحدة تحتوي على 5 × 10 5 الخلايا في 0.3 مل HBSS-HEPES المتوسطة. وبالنسبة لبعض التجارب، وإضافة 500 نانومتر Latrunculin A أو السيارة (DMSO)، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة قبل التحفيز chemokine. - إضافة 10-500 نانوغرام / مل CCL19 أو CXCL12 chemokine في كل أنبوب.
ملاحظة: نحن عادة استخدام 10-200 نانوغرام chemokine مل / للخلايا T الإنسان. خلايا CEM لا تعبر عن مستقبلات CCR7 التي تربط CCL19. ولذلك، فإن خلايا CEM تكون قادرة على الاستجابة لتحفيز CXCL12 فقط. وعلاوة على ذلك، استخدام تركيزات أعلى chemokine (300-500 نز / مل) إلى استقطاب خلايا فأر T. - الوجه الأنابيب عدة مرات، واحتضان لهم في 37 ° C حمام الماء لمدة 8 أو 10 دقيقة للخلايا T الابتدائية أو CEM، على التوالي.
- إيقاف عملية الاستقطاب عن طريق إضافة إلى كل أنبوب 0.3 مل من محلول دافئ يحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) و10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. الوجه الأنابيب واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. Stainings
- نقل الخلايا من أنابيب microcentrifuge في التدفق الخلوي الأنابيب.
- ملء أنابيب تماما مع حل RT تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني.
- أنابيب الطرد المركزي في 460 x ج لمدة 4 دقائق.
- تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من حل RT تحتوي على 5٪ FCS في برنامج تلفزيوني.
- إضافة 5 ميكرولتر من FITC المضادة للHLA-ABC في كل أنبوب، دوامة لهم، واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT، بعيدا عن الضوء.
- غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ FCS، وهوND مرة واحدة مع PBS فقط.
- في RT: إضافة 500 ميكرولتر 1٪ PFA، واحتضان لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل الخلايا مع محلول يحتوي على 1٪ BSA، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني.
- تجاهل طاف، وملء أنابيب تماما بمحلول PBS تحتوي على 0.2٪ BSA، 0.1٪ سابونين، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES (العازلة permeabilization).
- غسل الخلايا مرتين في هذه الوسيلة.
- الوجه الأنابيب لإزالة المتوسطة ودوامة لهم لفصل بيليه الخلية.
- إضافة 0.25 ميكروغرام / مل TRITC-Phalloidin و / أو 1: 100 التخفيف من مكافحة P-ERM الأجسام المضادة لكل أنبوب، دوامة لهم واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
- غسل الخلايا مع المخزن المؤقت permeabilization. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري إذا لزم الأمر.
- resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر PBS ونقلها إلى أنابيب microcentrifuge.
ملاحظة: خلايا جاهزة للشراء. بدلا من ذلك، مع الحفاظ على حجم الحد الأقصى لمجموع 200 ميكرولتر في الأنبوب، إضافة المركزة PFA إلى النهائي 1٪تركيز من أجل الحفاظ على stainings إذا لم يتم استخدام خلايا في نفس اليوم لمزيد من المعالجة.
4. الصور اقتناء وتحليل
- التبديل على جهاز (انظر الجدول من الكواشف محددة / المعدات) والسماح لها معايرة نفسه وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: تم استخدام البرنامج INSPIRE مع الهدف 40X (0.75 NA). تم استخدام IDEAS 3.0 برامج لجميع quantifications المبلغ عنها. - إعداد سلسلة من النوافذ الاستحواذ والتي يمكن حفظها في قالب للتجارب المستقبلية. رسم رسوم بيانية أن تحديد القيم التدرج RMS. من "تحت المجهر" السكان، واختيارهم على الرسم البياني RMS التدرج، delimitate "خلية واحدة" السكان على الرسم البياني للمنطقة. مرة واحدة وقد تم إدخال أنبوب microcentrifuge في الجهاز، وضبط قوة الليزر، بوابة على الخلايا الفردية واكتساب 5،000 اللمفاويات التائية.
- في الأفكار الناعمةوير، فتح ملف اقتناء وإنشاء الرسم البياني التي سوف تظهر قيمة قيمة RMS التدرج للصور المجال مشرق (القناة 1) التي تم الحصول عليها لكل خلية على حدة. رسم بوابة على الرسم البياني التدرج RMS التي تعتبر الخلايا العارضة RMS قيمة التدرج فوق 57.
ملاحظة: التدرج RMS يسمح مع الأخذ بعين الاعتبار في التحليل فقط الخلايا الليمفاوية T التي هي في المستوى البؤري. لقد تحدد تجريبيا أن الخلايا الفردية واظهار قيمة التدرج RMS متفوقة على 57 هي في المستوى البؤري، ويمكن اعتبارها بشكل دقيق. - في / القائمة أقنعة تحليل، وخلق قناع جديد، ودعا تآكل (M01،2) من قناع التشكل على الصور brightfield M01، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة للمنطقة، وتحسب على تآكل (M01،2) قناع. من الخلايا المحددة في البوابة السابقة، فتح الرسم البياني يبين مجال الخلايا باستخدام هذا القناع تم إنشاؤه حديثا.
أقنعة والتشكل التي تتوفر حسب: ملاحظةالافتراضية هي أكبر بكثير من الحجم الفعلي للخلية. وبالتالي، فمن أكثر دقة لتآكل ليصل إلى 2 بكسل. - رسم بوابة على خلايا T الفردية، باستثناء الخرز المعايرة والحطام (المنطقة الصغيرة) والحلل (المنطقة الكبيرة). ضبط هذه البوابة في كل الاستحواذ.
ملاحظة: سوف الاختلافات في حجم الخلية يؤثر على موقف البوابة. كما خلايا فأر T هي أصغر من خلايا T الإنسان التي هي نفسها أصغر من خلايا CEM، فإن مساحة كل نوع من الخلايا تكون متناسبة مع حجمها. - النظر في واحدة، في تركيز الخلايا التي تم بوابات في الخطوات السابقة، فتح مؤامرة نقطة تتكون من الخام ماكس بكسل على تلطيخ HLA-ABC (القناة 2، محور س) بوصفها وظيفة من الخام ماكس بكسل على phalloidin تلطيخ (قناة 4، محور Y). إنشاء بوابة لاستبعاد الأحداث فلوري غير ملوثين أو المشبعة. فتح اثنين من رسوم بيانية تبين الخام ماكس بكسل لHLA-ABC (قناة 2) وphalloidin (قناة 4) stainings.
- في تحليل / القائمة أقنعة، يخلقعصام قناع جديد، ودعا تآكل (M02،2) من قناع مورفولوجيا الخلايا HLA-ABC الملون (قناة 2)، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة تتألف من المعلمة الاستدارة، وتحسب على تآكل (M02،2).
ملاحظة: يقيس هذا المعامل انحراف شكل خلية من دائرة. ولذلك، فإن خلية T مستديرة تماما يكون لها قيمة عالية دائرية في حين أن الخلايا الاستقطاب ممدود سوف يحمل الرقم القياسي دائرية منخفضة. - وفي وقت لاحق، وخلق الرسم البياني آخر من شأنه أن يقدم تقريرا قيم ميزة الاستدارة من الخلايا المغلقة سابقا. استخدام هذا الرسم البياني لرسم مباشرة توزيع الفرد والسكان خلية في التركيز وفقا لقيمة الاستدارة لكل خلية على حدة.
- وعند النظر إلى شكل الرسم البياني للخلايا غير حفز، رسم بوابة للخلايا الاستقطاب، ابتداء من الساعة قيمة أدنى دائرية يصل إلى قيمة الحد دائرية، حيث ان معظم الخلايا غير حفزيتم رسم. نظرة على عرض إحصاءات عن النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب بين السكان بوابات (٪ بوابات).
ملاحظة: لقد حددت هذه البوابة للقيم مؤشر الاستدارة أقل من 13. - من أجل أن ننظر إلى الاستقطاب من تلطيخ الأكتين في الخلايا، رسم بياني لتفاصيل مشرق قيمة التشابه R3، مقارنة تلطيخ HLA-ABC (قناة 2) وتلطيخ phalloidin (قناة 4).
ملاحظة: أكبر قيمة من هذه الميزة، وأكثر فرضه stainings هما. - باستخدام استراتيجية النابضة نفسها كما كان من قبل، رسم بوابة على الخلايا غير حفز لتلطيخ فصل يبين النسبة المئوية للخلايا مع المستقطب الأكتين تلطيخ.
- عند الانتهاء، وتظهر النسبة المئوية للخلايا واظهار الفصل في توزيع الدرجة الأولى MHC وstainings phalloidin، النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب جنبا إلى جنب مع القيم المتوسطة من الاستدارة والتشابه مؤشرات جميع خلايا ± SD في الموافقوحات إحصاءات onding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المثال الأول المختار هنا يتعلق باستخدام الخلايا الليمفاوية T الأساسي الإنسان حفز مع CCL19. ومع ذلك، فإن الاستراتيجية ذاتها يمكن استخدامها مع خلايا T الماوس الابتدائي، خطوط الخلايا T أو أي نوع من الخلايا الأخرى استجابة لتحفيز chemokine. استراتيجية النابضة المعروضة هنا تشمل سلسلة من نوافذ يمكن تحديد أحداث مركزة، ثم الخلايا واحدة. وأخيرا تم اتباع مجموعة من كثافة مضان هنا كمثال على اثنين من علامات: وMHC من الدرجة الأولى HLA-ABC والأكتين الخيطية ليستريح (الشكل 1) أو حفز CCL19 (الشكل 2) T الليمفاوية.
أولا، يتم قياس مؤشر الاستدارة في غير المعالجة (الشكل 1) أو حفز CCL19 (الشكل 2) T الليمفاوية. حقيقة أن الخلايا يستريح لها ذروة واحدة كبيرة مع قيمة مؤشر الاستدارة عالية تشير إلى أن معظم الخلايا هي قريبة من جولة. ومع ذلك، فمن الواضح أن التحفيز CCL19 يتسبب في ظهور ساتحاد كرة القدم حيوانية الثاني من الخلايا مع مؤشر الاستدارة منخفضة. هذا يشمل خلايا حيوانية التي اعتمدت مورفولوجيا الاستقطاب. أيضا، عندما يمثل مؤشر التفاصيل مشرق التشابه بين HLA-ABC وتلطيخ F-الأكتين، يمكن للمرء أن نلاحظ أن بعض الخلايا يحمل انخفاض في قيمة هذا المؤشر على العلاج CCL19، مشيرا إلى أن كلا من علامات تظهر على درجة أقل من شارك في التعريب . ومن المثير للاهتمام، من الدوت المؤامرات قدمت سابقا، يمكن للمرء أن وضع القاذف على أي نقطة معينة للحصول على صورة للخلية تتكون من صورة brightfield وصورة لكل من stainings يؤديها الشكل 3 وبالتالي يقدم أمثلة على CCL19 حفزت T الخلايا الليمفاوية التي تقع في باب عدم الاستقطاب (الشكل 3A) أو الاستقطاب (الشكل 3B) الخلايا. يمكن للمرء أن تصور بوضوح الاختلافات في التشكل بين كل من القطعان. من جداول الإحصاءات أسفل المدرج الاحصائي الاستدارة من الأرقام 1 و2، يمكن للمرء رسم النسبة المئوية للخلايا التي تدخل في باب الاستقطاب في غياب أو وجود CCL19 (الشكل 3C). كما هو متوقع، فمن الواضح أن التحفيز chemokine يزيد من نسبة الخلايا T الاستقطاب (من 11.2٪ إلى 50.6٪). يمكن للمرء أيضا رسم مؤشر الاستدارة متوسط من السكان خلية كاملة التي تم الحصول عليها في كل الظروف (الشكل 3D). التحفيز CCL19 يثير انخفاض هذا المؤشر. لكن، وكما سوى نصف الخلايا الاستقطاب، والتغير في مؤشر الاستدارة متوسط وحظ على التحفيز CCL19 صغير.
وبالمثل، يمثل الشكل 4 أمثلة من خلايا حفز CCL19، حيث كل من HLA-ABC وF-أكتين stainings تفعل (الشكل 4A) أو لا colocalize (الشكل 4B). من جداول الإحصاءات تحت مشرق التفاصيل رسوم بيانية التشابه هو مبين في الشكلين 1 و 2، يمكن للمرء الحصول على نسبةمن الخلايا التي تظهر قيمة المؤشر أقل من 1.5، وهو ما يمثل الخلايا التي تظهر على درجة منخفضة جدا من شارك في التعريب بين HLA-ABC وF-الأكتين. ويبين الشكل 4C أن جزء من الخلايا التي تقع في هذه البوابة يزيد على التحفيز CCL19 ( من 3.4٪ إلى 13.9٪). جمع قيم المؤشر لكل خلية فردية، يمكن للمرء أيضا رسم التفاصيل مشرق مؤشر تشابه متوسط من السكان خلية كاملة التي تم الحصول عليها في كل الظروف (الشكل 4D). CCL19 يثير انخفاض في المؤشر، ولكن، للأسباب نفسها كما في السابق، والتغيرات صغيرة. من خلال النظر في الصور من الخلايا المقابلة، يبدو أن هذا الانخفاض في HLA-ABC - F-الأكتين شارك في توطين ويرجع ذلك أساسا إلى تجميع F-الأكتين في قطب واحد من الخلية. وفي المقابل، لا يبدو أن توزيع التحت خلوية من جزيئات HLA-ABC MHC من الدرجة الأولى أن تتأثر بشكل صارخ عن طريق تحفيز CCL19.
وهذا هو السبب قررنا المقبل لمواصلة اختبارمنهجية من خلال تحليل اثنين من علامات (F-الأكتين والفوسفات-ERM) المعروف لفصل في أقطاب T خلايا حفز chemokine معارضة. خلايا T الإنسان حفز مع CXCL12 الاستقطاب بقوة، وكميا في الشكل 5A مع استراتيجية النابضة نفسها من ذي قبل (من 5.95٪ إلى خلايا الاستقطاب 79.10٪ بعد 8 دقائق من التحفيز مع 50 نانوغرام / مل CXCL12). في هذه الظروف، هناك انخفاض قوي في التفاصيل مشرق مؤشر تشابه يعني كما هو مبين في الأرقام 5B و5D، وهذا يعني أن F-الأكتين والفوسفات-ERM colocalize أقل بعد التحفيز CXCL12. كما هو متوقع، فإن النسبة المئوية للخلايا واظهار الفصل بين علامات المختار هنا هو أعلى (48٪، الشكل 5C) بالمقارنة مع تلك التي درست سابقا (14٪، الشكل 4C). وفقا لذلك، وانخفاض في متوسط مؤشر تشابه كل حالة هو أيضا أكثر وضوحا (الشكل 5D). ولذلك، فإن تقنية التدفق الخلوي التصوير المقدمة هنا هي سوitable لقياس درجة شارك في توطين اثنين stainings في بيئات مختلفة.
وأخيرا، قررنا توضيح إلى أي مدى اضطراب بعض العناصر هيكل الخلية أو مسار الإشارات المعروفة بتأثيرها على التغيرات في الخلايا التائية التشكل على التحفيز chemokine، يمكن أن تقاس التصوير التدفق الخلوي. الخلايا السيطرة T تم لأول مرة مقارنة مع بعض سابقة التجهيز مع المخدرات تعطيل الأكتين latrunculin ألف (الشكل 6A). وقد حفز الخلايا مع CXCL12، ملطخة phalloidin الفلورسنت وتحليلها بواسطة التصوير التدفق الخلوي. يتم عرض رسوم بيانية تبين كثافة الخام ماكس بكسل من تلطيخ F-أكتين لكل من السكان الخلية (6A الشكل، أعلى). كما هو متوقع من النشاط قطع من latrunculin ونحو خيوط الأكتين، وشدة تلطيخ phalloidin أقل في هذه الخلايا (اللوحة اليمنى) مقارنة للسيطرة على الخلايا الليمفاوية T تعامل مع السيارة DMSO (اللوحة اليسرى). وعلاوة على ذلك، latrunculin A-TRخلايا T عتيد يحمل الرقم القياسي أكبر الاستدارة مشيرة إلى أنها لا تزال مستدير من الخلايا السيطرة (الشكل 6A، أسفل). وهذا يمكن أن يكون كميا عن طريق بوابة تعيين على رسوم بيانية لقياس نسبة الخلايا التي تظهر التعديلات الشكلية. على الرغم من أن 32٪ من الخلايا السيطرة الحصول على الاستقطاب في هذه الحالة، 10٪ فقط من latrunculin والمعالجة بالإثير الخلايا اللمفية تي المعرض أية تغييرات الشكل (الشكل 6B). ولذلك، فإنه يظهر هنا أن تدفق التصوير الخلوي التكنولوجيا هو مناسبة لقياس الاختلافات في التعديلات الشكلية عند واحد يدرس التأثير المحتمل لبعض العناصر هيكل الخلية في هذه الظاهرة.
ثانيا، إن الاستحواذ على عدد كبير من الخلايا مع هذا الأسلوب أيضا يفتح إمكانية لتحليل مجموعات فرعية صغيرة بسرعة الخلايا الحالية كأقلية. في الشكل 7، يتم تقديم مثال حيث يقتصر تحليلنا على وجه التحديد إلى سلوك الخلايا T شارك في بالنقلإد مع GFP جنبا إلى جنب مع البلازميدات ترميز لالمسوخ السلبية السائدة في مجمع قطبية Par6 / PKCζ. الرسم البياني المقابلة لخلايا غير transfected وقد سمح لنا لبوابة تحديدا على GFP ذات الصلة + خلايا T (الشكل 7A، يسار). كثافة GFP يقاس رسوم بيانية أن تحديد توزيع كثافة مضان من القناة 2 ويظهر الواقع أنه ليس هناك سوى جزء صغير من السكان خلية كاملة تم transfected (الشكل 7A). درجة الاستقطاب الصرفي من هذه الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل ثم كميا عن طريق قياس فقط مؤشر الاستدارة من GFP + الخلايا (الشكل 7B). بوابة إضافية للخلايا T واظهار القيم المنخفضة من الاستدارة سمحت تقدير النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب في كل حالة (الشكل 7C). وتظهر النتائج أن تعطل وظيفة مسار Par6 / PKCζ يشير مستعمل T polarizati خليةعلى حد سواء الناجم عن CCL19 وCXCL12 كيموكينات، وذلك تمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها السابقة 7.
الشكل 1. النتائج تلطيخ غير حفز التمثيلية على الخلايا البشرية T الأولية. وتظهر اللوحة اليسرى العليا لإعادة تقسيم الرسم البياني للالتدرج RMS محسوبة مع قناع M01 على الصور الحقل مشرق (القناة 1). وتظهر اللوحة اليمنى العليا مجال قناع M01 تآكل من 2 بكسل، استنادا إلى الصور brightfield (القناة 1) من الخلايا تحت المجهر بوابات من المؤامرة السابقة. وتظهر الألواح الوسطى القيم الخام ماكس بكسل من كل من HLA-ABC وPhalloidin stainings (القنوات 2 و 4 على التوالي) إما نقطة مؤامرة (اللوحة اليسرى) أو رسوم بيانية (وسط والألواح اليمنى) للفرد وأثناءها تركيز الخلايا المحددة في الخطوة السابقة. من هذه الفئة من السكان من الفردية، في التركيز الخلايا مع تلطيخ الصحيح، يتم احتساب الميزة الاستدارة على القناع M02 تآكل من 2 بكسل للتلطيخ HLA-ABC (اللوحة السفلى اليسرى) والتفاصيل مشرق ميزة تشابه R3 (اللوحة السفلى اليمنى) تبين درجة التشابه بين HLA-ABC وstainings Phalloidin . لهذين أحدث المؤامرات، والإحصاءات تشير إلى إعادة تقسيم السكان (٪ بوابات، يعني من هذه الميزة، SD) مبينة في الجدول أدناه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج تلطيخ التمثيلية على خلايا T الإنسان الأساسي حفز مع 200 نانوغرام CCL19 مل / دقيقة لمدة 8 استراتيجية تخطيط لوحة والنابضة متطابقة إلى الشكل 1.JPG "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القياس الكمي للوضع الصرفي من الخلايا الليمفاوية T تحفزها CCL19. (A، B) أمثلة على الخلايا من الشكل 2 خارج أو في "الاستقطاب" البوابة، على التوالي (C) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا T الاستقطاب التي تم الحصول عليها في حالة عدم وجود CCL19. (الشكل 1، -) أو مع 200 نانوغرام / مل CCL19 (الشكل 2، +) (D) الرسم البياني الذي يمثل القيم المتوسطة للمؤشر دائرية ± SE في الفرد، والسكان في تركيز خلية في الغياب. (-) أو وجود (+) من CCL19. *** P <0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الكمي لدرجة شارك في التعريب بين HLA-ABC وstainings phalloidin. (A، B) أمثلة على الخلايا من الشكل 2 خارج أو في "لا colocalized" البوابة من التفاصيل مشرق تشابه الرسم البياني، على التوالي. (C) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا T واظهار أي المشارك توطين بين كلا علامات في بادئة حفز (-). أو (+) ظروف حفز CCL19 (D) الرسم البياني الذي يمثل القيم المتوسطة للمؤشر تشابه ± SE في الفرد، والسكان في تركيز خلية في غياب (-) أو وجود (+) من CCL19. *** P <0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ف together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 5. تحليل F-الأكتين - الفوسفات-ERM الإقصاء على CXCL12 تحفيز خلايا T الابتدائية الإنسان. (A) النسبة المئوية للخلايا T الاستقطاب في غياب أو وجود CXCL12 (10 أو 50 نانوغرام / مل). (ب) تدفق التصوير الخلوي رسوم بيانية تبين إعادة تقسيم للفرد، والسكان خلية في التركيز وفقا لمؤشر تشابه التفاصيل مشرق أن يقارن مدى شارك في التعريب بين الفوسفات-ERM وphalloidin stainings، في غياب CXCL12 أو مع 10 نانوغرام / مل أو 50 نانوغرام / مل CXCL12. (C) الكمي لنسبة الخلايا العارضة لا شارك في توطين بيرم وstainings phalloidin في الخلايا T حفز أم لا مع CXCL12. (D) الكمي من متوسط قيم مؤشر تشابه ± SE في كل حالة. *** P <0.001.تحميل / 52140 / 52140fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. تأثير الأكتين البلمرة على T خلية الاستقطاب. (A) F-أكتين كثافة تلطيخ (لوحات العليا) والاستدارة (لوحات أقل) من خلايا T الإنسان الأساسي تعامل مع Latrunculin ألف (500 نانومتر و 30 دقيقة) أو DMSO ومن ثم حفز مع 100 نانوغرام / مل CXCL12 لمدة 8 دقائق. ( B) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا T الاستقطاب تعامل مع DMSO أو Latrunculin وبعد 8 دقائق من التحفيز مع CXCL12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. التعبير عن PKCζ-كيناز الميتة متحولة أو متحولة N-محطة كتل Par6 T خلية الاستقطاب بعد CCL19 أو CXCL12 العلاج. (A) تدفق التصوير الخلوي رسوم بيانية تبين كثافة التعبير عن GFP، في خلايا غير transfected T الأساسي أو خلايا T الأساسي شارك في transfected مع GFP وناقلات الفارغة (التحكم) أو متحولة-كيناز الميتة من PKCζ أو N-الطرفية جزء من Par6 (B) التدفق الخلوي التصوير رسوم بيانية تمثل مؤشر الاستدارة من السكان خلية GFP إيجابية تعبر عن ثوابت مختلفة على المستوى القاعدي (NS: لا التحفيز). أو بعد CCL19 أو التحفيز CXCL12 (100 نانوغرام / مل لمدة 8 دقيقة ). (C) الكمي من النسبة المئوية للخلايا T الاستقطاب شكليا معربا عن بنيات مختلفة على المستوى القاعدي أو بعد CCL19 أو CXCL12 التحفيز. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الاصدارسيون من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام تقنية حديثة من تدفق التصوير الخلوي، ووضع استراتيجية النابضة سريعة ومفيدة لتحليل الأحداث الخلوية والجزيئية الناجم عن التحفيز chemokine يرد. من تجربة واحدة، يمكن للمرء الحصول على نوعين رئيسيين من المعلومات: التغييرات في مورفولوجية الخلايا الناجم عن التحفيز chemokine وتوزيع التحت خلوية من البروتينات المختلفة أثناء عملية الاستقطاب. ومن المثير للاهتمام، وتقدم الأدلة أيضا على إمكانية تحليل عدد كبير من الخلايا، والذي يسمح متانة الإحصائية والتحليلات ذات الصلة لجزء صغير من السكان خلية كاملة. كما ذكرت، هذه التقنية يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل الأحداث إعادة توزيع الجزيئية في سياق المشبك المناعي (12). وبالإضافة إلى ذلك، فقد تم استخدام مجموعة مماثلة تصل للخلايا T-حفز SDF1 لكن لم يقدم أي تحليل لدرجة شارك في التعريب بين اثنين من علامات 13.
رغم أنوبالتالي يمكن لهذه التقنية تكون مناسبة لكثير من أنواع الخلايا، والخلايا الملتصقة لا يمكن تحليلها بشكل مباشر والخلايا في تعليق تحتاج إلى أن تكون ثابتة قبل عملية الاستحواذ. وبالإضافة إلى هذه القيود الجوهرية للآلة، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية عند تحفيز لهم. درجة الحرارة هو في الواقع رئيسية لتحقيق السليم T خلية الاستقطاب منذ التغييرات هيكل الخلية، مثل البلمرة الأكتين الذي يدفع يتغير شكل، تعتمد جدا على درجة الحرارة. لدينا تجارب مع latrunculin والخلايا المعالجة تؤكد أن إعادة عرض الأكتين السليم الناجم عن التحفيز chemokine هو في الواقع حاسما لخلية لتحقيق دولته الاستقطاب بالكامل. وبالإضافة إلى البيانات المقدمة هنا مع هذا الدواء، كما اختبرنا التصوير تكنولوجيا التدفق الخلوي مع الخلايا الليمفاوية T الأساسي الإنسان transfected مع بروتينات متحولة التي تمنع يشير مسار Par6 / PKCζ. باستمرار مع شركائنا في النتائج المنشورة سابقا 7، فإنه يظهر هنا أن هذا قطبية مجمع وavors T خلية الاستقطاب.
chemokine على التحفيز، وخلايا T يفقد مورفولوجيا جولة على اعتماد شكل الاستقطاب. لقد وجدنا المعلمة الاستدارة ليكون الأكثر دقة لتحديد تلك التعديلات الشكلية. ومع ذلك، يقترح غيرها من المعالم التي تصف التغيرات شكل من برامج التحليل، مثل نسبة الارتفاع أو استطالة. لذلك، يمكن للمرء بسهولة اختبار مساهمة مسار الإشارات معين أو بروتين معين في هذه العملية.
في هذه الدراسة، لاحظنا دائما أن النسبة المئوية للخلايا واظهار الاستقطاب الصرفي أعلى من واحد لالاستقطاب الجزيئي. وهذا يدل على أن جزءا من الخلايا التي تبني تغيير في التشكل لا تقدم إعادة التوزيع الجزيئية كبيرة من علامات درس. هذا يمكن أن تنشأ من حقيقة أن بعض الخلايا تفقد شكلها مستدير بحيث تظهر مؤشر الاستدارة أقل على الرغم من أنها لا تظهر بوضوح الشجريةز حافة وقدم ذنبية. هذه الخلايا T الاستقطاب جزئيا يمكن أن لا تزال تقع في باب خلايا T الاستقطاب شكليا دون تقديم إعادة التوزيع الجزيئية واضحة من علامات نموذجية. وعلاوة على ذلك، فإن الاختلافات في عتبة يشير chemokine التي يمكن أن تكون أعلى لإعادة توزيع الثروة من علامات لإجراء تعديلات الشكل ويمكن أيضا تفسير هذه الاختلافات.
فإنه يظهر هنا أيضا أن علامة HLA-ABC لا relocalized في الخلايا T الاستقطاب وليس هناك تغيير في شدة هذه تلطيخ على التحفيز CCL19. على العكس من ذلك، يتم توفير تأكيدا هنا أن الزيادات تلطيخ F-أكتين على العلاج CCL19 (الشكلان 1 و 2) كما هو معروف بالفعل، منذ التحفيز chemokine ينشط الأكتين البلمرة 5. وعلاوة على ذلك، فإنه يظهر أن خيوط الأكتين الحصول على relocalized في الجزء الأمامي من خلايا الاستقطاب. وبالتالي، فإن مؤشر التفاصيل مشرق التشابه الذي يقيس مدى شارك في التعريب بين كلا أماهrkers تميل إلى الانخفاض على التحفيز CCL19. وعلى سبيل المقارنة، يتم توفير مثل هذا التحليل هنا للحصول على درجة F-الأكتين شارك في التعريب مع البروتينات الفوسفات-ERM التي تحصل على استبعادها من أمام الزنزانة. النسبة المئوية للخلايا T-حفز chemokine العارضة F-الأكتين - MHC من الدرجة الأولى الفصل هي أقل بكثير من واحد لF-الأكتين - الفوسفات-ERM (14٪ مقابل 48٪، على التوالي) منذ relocalizes F-الأكتين في الجبهة و البروتينات الفوسفات-ERM في الجزء الخلفي من خلايا T الاستقطاب، بينما لا يتأثر إعادة تقسيم جزيئات MHC من الدرجة الأولى عن طريق تحفيز chemokine. ويمكن بالتالي هذا مؤشر تشابه التفاصيل مشرق استخدامها بشكل منتظم لمقارنة توزيع اثنين علامات في الخلايا T الاستقطاب. لذلك، هذا الأسلوب هو مناسبة جدا لقياس درجة شارك في التعريب أو زملاء استبعاد اثنين من علامات مختلفة على عدد كبير من الخلايا أو ربما على الأحداث النادرة الحالية في السكان الخلية واسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
الكتاب يعترف كثيرا بيير Bourdoncle، توماس غيلبير ولويز Rimbault مرفق كوشين التصوير. وأيد هذا العمل من قبل INSERM، CNRS والدوري الفرنسي الوطني مناهضة جنيه السرطان (إيكيب labellisée).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
