Abstract
細胞は、偏光と呼ばれるプロセスで、かつ多くのタンパク質の細胞内局在を変化させることによって、彼らの丸い形状を失うことによる刺激ケモカインに応答します。古典的な画像化技術は、これらの現象を研究するために使用されてきた。しかしながら、それらは時間のかかる形態の定量化および細胞の数の染色の共局在続く多くの細胞の手動取得を必要とした。ここでは、迅速かつ強力な方法は、サイトメーターのものと顕微鏡の利点を組み合わせたイメージングフローサイトメトリー技術を用いて細胞数千からなるサンプルにこれらの現象を研究するために記載されている。 MHCクラスI分子および繊維状アクチンのためのCCL19及び染色で刺激したTリンパ球を使用して、ゲーティング戦略を同時に形状変化の程度及びCCL19シグナル伝達によって影響されるマーカーの共局在化の程度を測定するために提示されている。また、このゲーティング戦略はobservに私たちを許可E CXCL12刺激後の偏T細胞中で（フロントで）繊維状アクチンと（後方の）リン酸化されたエズリン - ラディキシンモエシン（リン酸化ERM）タンパク質の分離。 Par6 /非定型PKCシグナル伝達経路の変異体の薬理学的阻害剤と式でアクチン重合の阻害：この手法は、2つの異なる要素の偏光に遮断効果を観察することが有用であった。したがって、証拠は、この技術は、形態学的変化およびタンパク質の再分配の両方を分析するのに有用であることが示されている。
Introduction
ケモカインは、特殊な場所1に細胞を引き付ける小さな可溶性タンパク質である。したがって、それらは、組織中の細胞の正確な位置決め、発達および生理学において重要な機能に関与する。それは効果的な免疫応答を協調して作用する多くの異なる細胞型の作用に依存して、免疫系は、この規則の例外ではない。外来抗原が検出され、中和され得る前に、所定の状態でつの免疫細胞型の特定の位置を制御することによって、ケモカインは、予め求められている。
特に、Tリンパ球において、ケモカインは、T細胞の運動2,3を支持し係合すると、多くの細胞内シグナルを誘発する、特異的な表面受容体（カルシウム上昇、ERKリン酸化のRho GTPアーゼ活性化、インテグリン親和性および細胞骨格の変化の増加）に結合する。細胞レベルでは、人は、ケモカイン刺激により誘発される形態学的変化を観察することができる。細胞形状の変化はT細胞に特に劇的である：血流中に移動するとき、休止T細胞は、ビーズ状の丸い形態を持っている。前方に前縁しかしながら、炎症部位において又はリンパ系器官の近傍でのケモカインの存在の検出は、現在のバイポーラ形からなる典型的な「ハンドミラー」形態を採用するT細胞の形状を変更しようとしているそしてバック4で立ち下がりエッジ、または腹肢、。また、細胞内成分は、マイグレーションを維持するために、偏T細胞のこれらの二つの対向領域に分離することができる。例えば、ケモカイン刺激5と重合アクチン時アクチンフィラメントの重合増加が偏T細胞2の前面に蓄積する。一方、皮質F-アクチン細胞骨格を血漿膜にリンクエズリン - ラジキシン、モエシン（ERM）ファミリーのリン酸化タンパク質のようないくつかのタンパク質は、偏光の腹肢に再局在化するT細胞を6。興味深いことに、本発明者らおよび他のこの分極処理は、T細胞の遊走に必要とされることを示した。確かに、偏光と干渉する任意の治療は、細胞の運動性を阻害します。例えば非定型プロテインキナーゼC（PKC）ファミリー、PKCζおよびPKCιブロックT細胞分極および樹状細胞7のそれらの遊走スキャン処理のメンバーの活性の阻害。 T細胞の分極ものRho GTPアーゼによって調節される。我々は、最近記載Fam65bタンパク質によるRhoAの活性の調節は、T細胞の形態の変化及びトランスウェルアッセイ6中を移動する能力を妨害することを示している。分極は、細胞の運動性の前提条件のステップであるとして、それはケモカイン応答の主要な読み出しとして定量化することができるようにすることが重要である。細胞形状の変化は、以前に手動8を測定した。しかし、定量化のこの種は、非常に時間のかかるであり、その通常は数そう細胞の数が考慮される。
ここでは、新たな方法を迅速にケモカイン刺激にさらされるTリンパ球の形状変化の度合いを定量化するために提示される。イメージングフローサイトメトリー技術（ 具体的な試薬/機器の表を参照）、フローサイトメーターの利点を組み合わせた、使用され、ケモカイン刺激の異なる条件で効率的に偏光した細胞の量を定量する顕微鏡9。一つは、この技術でロバスト測定できる形態変化の定量化に加えて、ケモカインシグナリングの際にいくつかのタンパク質の細胞内局在の変化を評価することも可能である。
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Protocol
Tリンパ球の調製
- 10,11を説明したように一次マウスまたはヒトT細胞を準備します。
- 3×10 6細胞/ mlの- 2の密度で、10％ヒト血清ABを含む完全RPMI培地中のヒトT細胞を養う。
注：代わりに、ヒト血清のウシ胎児血清（FCS）を使用すると、培養中のヒトT細胞の大部分の自発分極を誘発することができる。 4培養におけるこれらの細胞を維持 - 5日、さらに、この期間中にいつでもそれらを処理。 - 類似の細胞密度で、10％FCSを補充した完全RPMI培地中でマウスT細胞を維持する。 10ng / mlのIL7の存在下で、37℃でO / N培養した後、次の日すぐに使用するか。
- 完全RPMI中CEMヒトT細胞株を育成10％FCSを補充した。
2.ケモカイン刺激
- 10 mMのHEPEを補足した暖かいHBSS培地で実験条件あたり5×10 5細胞を洗浄S。いくつかの実験のために、2μgのpmaxGFP及び8μgのをpcDNA3.1 +（空ベクター対照）、デッドPKCζキナーゼ、またはN末端Par6プラスミドで前日初代ヒトT細胞を共トランスフェクトする。
- 温かいHBSS-Hepes緩衝培地中で細胞ペレットを再懸濁し（実験条件0.3mlのxの番号を使用する）。
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞を配布します。
注：したがって、単一の実験条件に対応する1管は0.3ミリリットルHBSS-HEPES培地中で5×10 5個の細胞が含まれています。いくつかの実験では、500 nMのラトランクリンAまたは媒体（DMSO）を追加し、ケモカイン刺激の前に30分間細胞をインキュベート。 - 各チューブに10から500 / mlのCCL19またはCXCL12ケモカインを追加します。
注： - ヒトT細胞のための200 / mlのケモカイン我々は通常、10を使用しています。 CEM細胞は、CCL19に結合するCCR7受容体を発現しない。そのため、CEM細胞だけCXCL12刺激に反応することができるようになります。 500 n - でまた、より高いケモカイン濃度（300を使用グラム/ ml）をマウスのT細胞を分極する。 - チューブを数回反転し、それぞれ、一次T細胞またはCEM 8または10分間37℃の水浴中でそれらを培養する。
- 各チューブに2％パラホルムアルデヒド（PFA）及びPBS中10mMのHepesを含む温かい溶液0.3mlを加えて分極処理を停止する。チューブを反転し、5分間37℃でそれらをインキュベートする。
3.染色は
- チューブフローサイトメトリーマイクロチューブから細胞を転送します。
- 1％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.5mMのEDTA、PBS中の10mMのHepesを含むRT溶液で完全にチューブを埋める。
- 4分間460×gでチューブを遠心。
- 上清を捨て、PBS中の5％FCSを含有するRT溶液100μlで細胞を懸濁します。
- 離れて光から、渦それらを、各チューブに、FITC抗HLA-ABCの5μl加えて、室温で30分間、それらをインキュベートする。
- PBSで5％FCS、Aを含むで細胞を1回洗浄する一度PBSでのみND。
- RTで：1％のBSA、0.5mMのEDTA、PBS中10mMのHEPESを含む溶液で細胞を洗浄し、10分間インキュベートし、500μlの1％PFAを加える。
- 上清を捨て、0.2％BSA、0.1％サポニン、0.5mMのEDTAおよび10mMのHepes（透過化緩衝液）を含むPBS溶液で完全にチューブを埋める。
- この培地中で細胞を2回洗浄する。
- 培地を除去し、細胞ペレットを解離するためにそれらをボルテックスするチューブを裏返し。
- 、各チューブに抗P-ERMの抗体の100倍希釈渦にそれらを、室温で30分間インキュベート：0.25 / mlのTRITCファロイジンおよび/または1を追加します。
- 透過化バッファーで細胞を洗浄。必要に応じて、蛍光二次抗体とインキュベートします。
- 200μlのPBSに細胞を再懸濁し、マイクロチューブに転送。
注：細胞を取得するための準備ができている。また、チューブあたり200μlの最大総量を維持しながら、最終的に1％に濃縮されたPFAを追加細胞は、さらなる処理のために同じ日に使用されるべきではない場合染色を保存するために集中。
4.イメージの取得と分析
- 装置のスイッチを入れ（ 特定の試薬/機器の表を参照）、それはメーカーの指示に従って、それ自体を校正しましょう。
NOTE：INSPIREソフトウェアは対物レンズ40倍（0.75 NA）で使用した。 IDEAS 3.0ソフトウェアは、報告されたすべての定量化のために使用された。 - 将来の実験のためのテンプレートに保存することができます取得一連のウィンドウを準備します。 RMS勾配値を定量化ヒストグラムを描画します。 RMS勾配ヒストグラム上で選択し「フォーカスでは「集団から、エリアのヒストグラムの「単一セル」の人口をdelimitate。マイクロ遠心チューブが機械内に挿入された後、個々の細胞上にゲートをレーザーパワーを調整し、5000 Tリンパ球を取得する。
- アイデアでソフトウェアは、取得ファイルを開き、個々のセルに対して得られた明視野画像（チャンネル1）のための勾配RMS値の値が表示されたヒストグラムを作成します。 57より上のRMSの勾配値を示す細胞を考慮RMS勾配ヒストグラムにゲートを描きます。
注：RMS勾配分析において考慮焦点面内にある唯一のTリンパ球を取ることができる。我々は、57よりも優れたRMS勾配値を示す個々の細胞を焦点面にあり、正確に考慮することができることを実験的に決定している。 - 解析/マスクは、メニューでは、2画素の侵食された明視野画像M01、上の形態学のマスクから（M01,2）を侵食すると呼ばれる、新しいマスクを作成します。その後、分析に/むしばむ（M01,2）マスク上の計算されたエリアの新機能を、作成し、メニューを用意しています。前のゲートに選択された細胞から、この新しく作成されたマスクを使用してセルの面積を示すヒストグラムを開きます。
注：によって利用可能な形態学マスクデフォルトでは、セルの実際のサイズよりもはるかに大きいです。これにより、2ピクセルにそれを侵食することがより正確である。 - キャリブレーションビーズや破片（小エリア）とダブレット（大面積）を除く、個々のT細胞上にゲートを描きます。各取得時にこのゲートを調整します。
注：セルサイズの変動は、ゲートの位置に影響を与える。マウスT細胞はCEM細胞より小さい自体、ヒトT細胞よりも小さいように、各細胞型の領域は、その大きさに比例する。 - 前のステップでゲートしたシングル、焦点の合った細胞を考慮すると、ファロイジンでのRAWマックス·ピクセルの関数として、HLA-ABC染色に直接上限·ピクセルからなるドットプロット（チャネル2、X軸）を開く染色（チャンネル4、Y軸）。無染色または飽和蛍光イベントを除外するためにゲートを作成します。 HLA-ABC（チャネル2）とファロイジン（チャンネル4）染色のために直接上限画素を示すオープンつのヒストグラム。
- 解析/マスクメニュー、レコード生成で2画素の浸食HLA-ABC染色細胞（チャネル2）の形態のマスクから（M02,2）をむしばむと呼ばれるEA新しいマスク、、。その後、分析に/むしばむ（M02,2）で計算真円度パラメータからなる新しい機能を作成し、メニューを用意しています。
注：このパラメータは、円からの細胞形状の偏差を測定します。したがって、完全に丸いT細胞は、低円形度を示すことになる細長い極性細胞に対し高い真円度値を有する。 - その後、以前にゲート細胞から円形の特徴の値を報告します別のヒストグラムを作成します。個々のセルのための円形度の値に応じて合焦細胞集団、直接個々の分布をプロットするために、このヒストグラムを使用する。
- 非刺激細胞のためにヒストグラムの形状を見ると、極性細胞のためにゲートを描き、非刺激細胞のほとんどの真円度の限界値まで最低の真円度の値で始まるプロットされている。ゲーテッド人口（％はゲートで囲われた）の間で偏細胞の割合の統計表示を見てください。
注：我々は、13以下の円形度指数値のため、このゲートを設定している。 - 細胞内のアクチン染色の偏光を見るために、HLA-ABC染色（チャネル2）およびファロイジン染色を比較し、明るい詳細類似R3の値のヒストグラムをプロット（チャンネル4）。
注：この大きな特徴の値は、二以上の染色である重畳。 - 前と同じゲート戦略を使用して、偏アクチン染色を有する細胞のパーセンテージを示す分離された染色のための非刺激細胞上にゲートをプロットする。
- 完了すると、MHCクラスIおよびファロイジン染色、偏光された細胞の割合の分布に偏析を示す細胞のパーセンテージは平均±SD、全てのセルの真円度と類似度指標の平均値をcorrespに示されていると共にonding統計パネル。
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Representative Results
ここで選択された最初の例では、CCL19で刺激したヒト一次Tリンパ球の使用に関する。しかし、同じ戦略は、初代マウスT細胞、T細胞株またはケモカイン刺激に応答する任意の他の細胞型で使用することができる。ここで紹介するゲーティング戦略は集中イベント、単一のセルを選択一連のウィンドウが含まれています。 （ 図1）またはCCL19刺激された（ 図2）Tリンパ球を休止するためのMHCクラスI HLA-ABC及び繊維状アクチン：最後に、蛍光強度の範囲は、二つのマーカー上の例のように、ここで続いている。
まず、円形度は、未処理（ 図1）またはCCL19刺激された（ 図2）Tリンパ球で測定される。休止細胞は、高い真円度値と主要な単一のピークを有しているという事実は、ほとんどの細胞は円形に近いことを示している。しかし、CCL19刺激が出現oをを誘発することが明らかである低円形度指数を有する細胞のFA第二亜集団。この亜集団は、偏光の形態を採用している細胞を包含する。 HLA-ABCおよびFアクチン染色の間に明るい詳細の類似度を表すときにも、一つはいくつかの細胞は両方のマーカーが共局在の低い程度を示していることを示す、CCL19処理の際に、このインデックスの値の低下を示すことを観察することができる。興味深いことに、以前に提示ドットプロットから、1は、明視野画像と行わ染色のそれぞれの画像からなる細胞の画像を得るために、任意の特定のドットにカーソルを配置することができます。 図3は、このように CCL19の例としては、T刺激提示非偏光（ 図3A）または偏光（ 図3B）セルのゲートに落ちる球。一つは、明らかに、両方の亜集団間の形態の違いを視覚化することができます。 図1から円形ヒストグラム下の統計表から、 2つのCCL19（ 図3C）の非存在下または存在下での偏ゲートに入る細胞の割合をプロットすることができる。予想されるように、それはケモカイン刺激が（11.2％から50.6パーセントまで）偏極T細胞の割合を増加させることは明らかである。一つには、両方の条件（ 図3D）で得られた全細胞集団の平均円形度をプロットすることができる。 CCL19刺激はこのインデックスの低下を誘発する。半分だけの細胞が分極さしかしながら、CCL19刺激により観察された平均円形度指数の変化は小さい。
同様に、 図4は、HLA-ABCおよびFアクチン染色の両方が（ 図4A）を行うか（ 図4B）が共局在化しないでCCL19刺激された細胞の例を表す。 図1および図2に示した明るい詳細類似ヒストグラム以下の統計表から、一つの割合を得ることができるHLA-ABCおよびFアクチンとの間の共局在の極めて低い程度を示す細胞を表し、1.5未満のインデックス値を示す細胞である。 図4Cは、（細胞の画分は、CCL19の刺激時に このゲート増加に収まることを示してい3.4％から13.9％へ）。個々のセルのインデックスの値を収集し、一方は、両方の条件（ 図4D）で得られた全細胞集団の平均明るい細部の類似度をプロットすることができる。 CCL19は、しかし、以前と同じ理由のために、変化が小さく、屈折率の低下を誘発する。共局在、F-アクチン細胞の一方の極におけるF-アクチンのクラスタリングが主な原因である - 対応する細胞の画像を見ることで、それは、HLA-ABCでこの低下があることを表示されます。逆に、HLA-ABC MHCクラスI分子の細胞内分布は、肉眼的にCCL19刺激に影響されていないようです。
それは我々が次のさらにテストすることを決めた理由です。二つのマーカー（FアクチンおよびホスホERM）を分析することにより、方法論は、ケモカイン刺激T細胞の極対向して分離することが知られている。 （50 ng / mLでCXCL12で刺激の8分後に5.95パーセントから79.10パーセントの偏細胞に）以前より、同一のゲーティング戦略を、図5Aに定量化CXCL12で刺激したヒトT細胞は、強く偏光した。 FアクチンおよびホスホERMは、CXCL12刺激後の少ない共局在することを意味し、 図5Bおよび5Dに示すように、これらの条件では、平均ブライト詳細類似性指数の強い減少がある。予想されるように、ここで選択マーカーの分離を示す細胞の割合は、以前に研究もの（14％、 図4C）と比較して（48％、 図5C）高い。したがって、各条件の平均類似度指数の低下が（ 図5D）も、より明白である。したがって、ここに提示イメージングフローサイトメトリー技術は、suがある異なる設定における2つの染色の共局在の程度を定量化するのITable。
最後に、どの程度まで、いくつかの細胞骨格要素またはケモカイン刺激によるT細胞の形態の変化に影響を及ぼすことが知られているシグナル伝達経路の摂動を説明することを決定し、フローサイトメトリーイメージングによって測定することができる。制御T細胞は、最初に（ 図6A）ラトランキュリンアクチン破壊する薬剤で前処理したいくつかと比較した。細胞を蛍光ファロイジンで染色し、フローサイトメトリーを撮像して分析し、CXCL12で刺激した。 Fアクチン染色の生の最大ピクセル強度を示すヒストグラムでは、両方の細胞集団（ 図6A、上部）について示されている。アクチンフィラメントに向けラトランキュリンAの切断活性から予想されるように、ファロイジン染色の強度は、これらの細胞（右パネル）で低い車両DMSO（左パネル）で処理したTリンパ球を制御するために比較した。また、-TRをラトランキュリンeated T細胞は、対照細胞（ 図6A、下部）より丸みのままであることを示す大きな円度指数を示す。これは、形態学的変化を示す細胞の割合を測定するためにヒストグラムに設定ゲートすることによって定量することができる。対照細胞の32％が この状態で偏得るが、ラトランキュリン処置されたTリンパ球の10％のみが、任意の形状の変化（ 図6B）を示す。したがって、イメージングフローサイトメトリー技術は一方がこの現象の一部の細胞骨格要素の潜在的効果を研究する際に形態学的改変の違いを測定するのに適していることをここに示されている。
第二に、この方法では多数の細胞の獲得はまた、少数派として存在する細胞の急速小さなサブセットを分析する可能性を開く。我々の分析は、特異的T細胞の挙動の共トランスフェクションに制限されている。図7では、一例を提示する極性複合Par6 /PKCζのドミナントネガティブ変異体をコードするプラスミドと一緒にGFPでエド。非トランスフェクト細胞に対応するヒストグラムは特に関連のGFP + T細胞（ 図7A、左）上のゲートに私たちを許可している。実際にチャンネル2の蛍光強度の分布を定量するヒストグラムとして測定されたGFPの強度は、全細胞集団のごく一部は、（ 図7A）をトランスフェクトされたことを示している。これらのトランスフェクトされた細胞の形態学的な偏光度は、次いでGFP +細胞（ 図7B）の唯一の真円度を測定することによって定量した。円形度の低い値を示すT細胞のための追加のゲートは、各条件（ 図7C）の偏細胞の割合の推定を可能にした。結果はPar6 /PKCζシグナル伝達経路の機能の破壊は、T細胞polarizatiを阻害したことを示し私たちの以前の知見7に沿って、両方のCCL19及びCXCL12ケモカインによって誘発される上。
図一次ヒトT細胞上の1.代表的な非刺激性染色の結果。左上のパネルは、（チャンネル1）明視野画像上のM01マスクを用いて計算グラデーションRMSのヒストグラム再区分を示しています。右上のパネルは、以前のプロットからゲートさにフォーカス細胞の明視野像（チャンネル1）に基づいて、2画素の侵食されたM01マスクの領域を示している。中央のパネルは、個々のために、HLA-ABCとファロイジン染色（それぞれチャネル2,4、）のいずれかドットプロット（左パネル）またはヒストグラム（中央および右パネル）の両方の生の最大ピクセル値を示し、IN-前のステップで選択したセルを集中。正しい染色を有する個々の、焦点の合った細胞のこの集団から、 HLA-ABC及びファロイジン染色との類似度を示すHLA-ABC染色（左下パネル）およびブライト詳細類似R3機能（右下のパネル）の2画素の侵食M02マスク上に円形特徴を算出する。これら二つの最新のプロットの場合、人口の再区分を示す統計を以下の表に示されている（ゲートさ％は、機能、SDの平均）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：図1を8分間は200ng / mLのCCL19で刺激した初代ヒトT細胞上の代表的な染色結果パネルレイアウトとゲーティング戦略は同一である。JPG "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：CCL19によって刺激されたTリンパ球の形態学的状態の定量。それぞれ図2からの細胞の（A、B）としては、例えば外側または「偏光」ゲートにおいて、（C）CCL19の非存在下で得られた偏T細胞の割合を示すヒストグラム（ 図1、 - ）または200 ngのと/ mlのCCL19（ 図2、+）（D）ヒストグラムは、個体におけるSE±円形度の平均値を表す、合焦細胞非存在下での人口- CCL19の又は存在（+）（）。 *** P <0.001。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
HLA-ABCとファロイジン染色の間の共局在の程度の図4.定量。 （A、B）は、図2の外側または明るい細部それぞれ類似ヒストグラムから「共局在していない」ゲート内の細胞の例としては、（C）不における両マーカーの間に共局在性を示さないT細胞の割合を示すヒストグラム条件またはCCL19刺激された（+）個体におけるSE±類似度の平均値を表す（D）ヒストグラム、焦点の合った細胞集団の非存在下で（ - ）刺激- CCL19の又は存在（+）（）。 *** P <0.001。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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F-アクチンの図5.分析-ヒト初代T細胞のCXCL12刺激によりリン酸化ERMの除外。 CXCL12（10または50 ng / mLで）の存在下または非存在下で分極したT細胞の（A）の割合（B）ブライト詳細類似度に応じて個別の合焦細胞集団の配分を示すヒストグラムサイトメトリイメージングフローこれはCXCL12の非存在下で、または10ng / mlのまたは50ng / mlのCXCL12で、ホスホERMおよびファロイジン染色の間の共局在の程度を比較し、何の共局在化を示さない細胞の割合の（C）の定量PERMおよびT細胞におけるファロイジン染色が刺激かCXCL12と各状態におけるSE±類似度の平均値（D）の定量。 *** P <0.001。/ 52140 / 52140fig5large.jpg「ターゲット= "_空白」をアップロードする>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
T細胞の分極におけるアクチン重合の図6の効果。 （A）Fアクチン次にラトランクリンA（500 nMで、30分）またはDMSOで処理した初代ヒトT細胞の染色強度（上方パネル）および真円度（下のパネル）は、8分間、100ng / mlのCXCL12で刺激した。（ B）CXCL12による刺激の8分後、DMSOまたはラトランクリンAで処理分極したT細胞の割合を示すヒストグラム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PKCζのキナーゼデッド変異体またはCCL19後にPar6ブロックT細胞の偏光またはCXCL12治療のN末端 変異体の図7.発現。非トランスフェクト一次T細胞または初代T細胞GFPで同時トランスフェクトし、空ベクター（対照）またはPKCζのキナーゼデッド変異体またはN末端 におけるGFPの発現強度を示すヒストグラムメトリー（A）イメージングフローまたはCCL19または8分間（100ng / mlのCXCL12刺激後：基礎レベル（無刺激NS）での異なる構築物を発現するGFP陽性細胞集団の真円度を表すヒストグラムメトリPar6の部分（B）画像処理の流れ基礎レベルで、またはCCL19またはCXCL12刺激後の異なる構築物を発現する形態学的に偏T細胞の割合の）。（C）の定量化。 大きな版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図のシオン。
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Discussion
イメージングフローサイトメトリーの最近の技術を使用して、ケモカイン刺激によって誘発される細胞および分子事象を分析するための迅速かつ有益なゲーティング戦略が提示されている。ケモカイン刺激及び分極プロセス中の異なるタンパク質の細胞内分布によって誘導される細胞形態の変化：単一の実験から、人は情報の2つの主要なタイプを得ることができる。興味深いことに、証拠はまた、統計的なロバスト性及び全細胞集団のごく一部の関連する分析を可能にする多数の細胞を分析する可能性が提供される。報告されたように、この技術は、免疫学的シナプス12の文脈における分子の再配布イベントを分析するために使用することができる。また、同様のセットアップがすでにSDF1で刺激されたT細胞のために使用されてきたが、2つのマーカー間の共局在の程度のない分析は、13を提供されていない。
しかしこの技術は、したがって、多くの細胞型に適し得る、接着細胞を直接分析することができず、懸濁液中の細胞は、従来の取得を固定する必要がある。機械のこれらの固有の制限に加えて、それは、それらを刺激する場合、37℃で細胞を維持することが重要である。このような形状の変化を駆動するアクチン重合、細胞骨格変化は、温度に大きく依存しているので、温度が実際に適切なT細胞の分極を達成するための鍵である。ラトランキュリン処理した細胞との我々の実験では、細胞が完全に偏光状態を達成するのケモカイン刺激によって誘発される適切なアクチンリモデリングが実際に非常に重要であることを確認します。この薬とここに提供されるデータに加えて、我々はまたPar6 /PKCζシグナル伝達経路を阻害する変異型タンパク質をトランスフェクトしたヒト一次Tリンパ球とイメージングフローサイトメトリー技術を試験した。一貫して私たちの前に公開された結果7と、それがここに表示され、この極性錯体FT細胞の分極をフレーヴァー。
ケモカイン刺激されると、T細胞は、偏形状を採用することを彼らのラウンド形態を失う。私たちは、円形度パラメータは、これらの形態学的変化を定量化するための最も正確であることがわかってきた。しかしながら、形状変化を記述する、他のパラメータは、アスペクト比またはElongatednessように、分析ソフトウェアによって提案されている。したがって、人は簡単にこのプロセスにおける特定のシグナル伝達経路の寄与または特定のタンパク質を試験することができる。
本研究では、我々は常に形態素分極を示す細胞の割合は、分子分極用のものよりも高いことを観察した。これは形態の変化を採用する細胞の割合が研究マーカーの大きな分子再配布を提示していないことを示しています。これは、彼らは明らかに最先端レベルを示していないが、彼らは低円形度指数を示すようにいくつかの細胞は、その丸い形状を失うという事実から発生する可能性がグラムエッジと腹肢。これらの部分偏T細胞はまだ典型的なマーカーの明らかな分子再配布を提示することなく、形態学的に偏T細胞のゲートに落ちる可能性があります。また、形状の変化よりも、マーカーの再分配のために高くなる可能性がしきい値シグナリングケモカインの違いは、これらの違いを説明できる。
また、HLA-ABCマーカー偏T細胞で再局在化されておらず、CCL19刺激によるこの染色の強度に変化がないことをここに示されている。逆に、確認がここで提供されるCCL19処理時のFアクチン染色が増加する（ 図1及び2）ケモカイン刺激は、アクチン重合5を活性化するので、既に知られているように。さらに、そのアクチンフィラメントが極性細胞の前面に再局在始めることを示している。その結果、両方のMAの間で共局在化の程度を測定し、明るい詳細類似度指数rkersはCCL19刺激により減少する傾向がある。比較として、そのような分析は、細胞正面から除外取得リン酸化ERMタンパク質との共局在F-アクチンの程度をここに提供されています。前面のFアクチンrelocalizes以降ホスホERM（それぞれ14％ 対 48％）、および- MHCクラスI偏析がFアクチンのためのものよりはるかに低い- Fアクチンを発現ケモカイン刺激T細胞のパーセンテージ偏光したT細胞の後部にリン酸化ERMタンパク質、MHCクラスI分子の再分配は、ケモカイン刺激に影響されない一方で。この明るい詳細類似度は、このように体系的に偏光されたT細胞における2つのマーカーの分布を比較するために使用することができる。したがって、この技術は、幅広い細胞集団中に存在する稀な事象で、潜在的に、多数の細胞上の2つの異なるマーカーの共局在化または共排除の程度を定量化するかに非常に適切である。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。
Acknowledgments
著者は大いにピエールBourdoncle、トーマスギルバートとコーチンイメージング施設のルイーズRimbaultを認める。この作品は、INSERM、CNRSとリーグ国立コントル·ルがん（エキップのlabellisée）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
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