Abstract
Двигательного дефекты в результате нейродегенеративных расстройств может быть позднее начало симптом болезни, после многих лет субклинического дегенерации, и, таким образом, текущие терапевтические стратегии лечения не лечебная. Благодаря использованию всей ExoME последовательности, большее число генов были идентифицированы, чтобы играть роль в локомоции человека. Несмотря идентификации этих генов, не известно, как эти гены имеют решающее значение для нормального функционирования опорно-двигательного. Таким образом, надежность анализа, который использует модели организмов для выяснения роли этих генов с целью выявления новых целей терапевтического интереса, нужен более чем когда-либо. Мы разработали сенсибилизированной версию отрицательные geotaxis анализа, который позволяет для обнаружения дефектов мягких ранее и имеет возможность оценить эти дефекты с течением времени. Анализ проводят в стакане градуированный цилиндр, который герметизируют с помощью воска барьерной пленки. При увеличении порогового расстояния для поднялась до 17,5 См и увеличение продолжительности эксперимента до 2 мин, мы наблюдали большую чувствительность при обнаружении мягкий дисфункций мобильности. Анализ является экономически эффективным и не требует интенсивную подготовку, чтобы получить высокую воспроизводимость результатов. Это делает его отличной техникой для скрининга лекарств-кандидатов в Drosophila мутантов шагающих с дефектами.
Introduction
Разрушительные нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, и наследственной спастической параплегии все чаще признается. К сожалению, большинство из этих нейродегенеративных расстройств по-прежнему не лечения. Широкое распространение клиническое применение генома, объективных генетических тестов, таких, как весь ExoME последовательности привело к увеличению числа генов в причастности локомотивных расстройств человека. Несмотря на этот прогресс, патологическая прогрессии от раннего к поздних стадиях, остается неуловимым в этих расстройств. Дрозофилы обеспечивает один с генетическими инструментов для изучения требование гена в контролируемой пространственной и временной основе. Кроме того, дрозофилы оказался полезным для скрининга лекарств для неврологических заболеваний, таких как болезнь Паркинсона 1, болезнь Альцгеймера 2, интеллектуальной инвалидности 3,4 и 5,6 эпилепсии среди других. Наша цель в том, чтобы разработать экономически эффективными надежный анализ, который позволит высокого анализ пропускной что все равно будет достаточно чувствительным, чтобы обнаружить небольшие изменения в производительности двигателя.
Есть несколько анализы, используемые для количественной оценки последствий генетической мутации и / или состояния окружающей среды на поведение альпинистской Drosophila. Большинство анализов выгоду из естественной склонности мух расти, известных как отрицательные geotaxis или подъемного анализа. Бензер 7 предложил в 1967, что противоток Устройство, используемое для изучения фототаксиса также может быть использован для изучения gravitaxis. С тех пор, Ганецкий 8 и многие другие 9 -12 построили на начальном анализе. Принцип заключается в размещении известное число мух в ампулу и нажмите флакона твердо на твердую поверхность, в результате чего мухи, чтобы упасть на дно флакона. Как это врожденное поведение, мухи будут пытаться подняться на верхней части флакона, против силы тяжести. Этот анализ количественных и measuRES сколько мухи поднялись мимо маркера на флаконе во время, отведенное период времени. Измерение скорости вместо общего числа мух восхождения стал надежным параметром и показали дефекты в тех случаях, когда количество мух критериев не было значительным 13.
Лазание анализа оказалось полезным при изучении многих нейродегенеративных расстройств, включая болезнь Паркинсона 14. Тем не менее, мы отметили, что локомотив дефекты не могут быть обнаружены во время, когда нейродегенерация уже видели в патологических исследований 14. Таким образом, использование традиционных анализа может ограничить способность к обучению на ранних стадиях патогенеза заболевания. Появление дефектов опорно-двигательного аппарата в течение более поздних стадиях патологии может отражать заболевание, прогрессирование слишком передовые для полного спасения.
Это поднимает потенциальную проблему с чувствительностью традиционной восхождение анализа. Потенциал неспособность традиных восхождение анализа для обнаружения дефектов мягких локомотива может быть связано с высоты, на которую мухи требуемой подниматься. Традиционные анализа 15,16 измеряет количество мух успешно подняться над высоту от 2 до 5 см от 10 до 20 сек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование дрозофилы было в соответствии с университетом научно-исследовательских принципов Альберты.
1. Fly Коллекция
- Соберите 20 мух, используя СО 2 (г) обезболивание и место в 25 мм х 95 мм сбора флакон, содержащий пищу.
- Хранить флаконов, содержащих мух горизонтально, чтобы избежать захвата мух в любых жидкостей, которые могут накапливаться в нижней флакон.
- Инкубируйте мух в течение по крайней мере 21 часов при 22 ° С в 45% -ной влажности в инкубаторе в течение приблизительно 15 ч. Установите инкубатор с 12 ч свет: темнота цикла.
2. Восхождение Анализ
- На следующее утро, 20 передачи мух от одного флакона в стакан 250 мл мерный цилиндр. Отметьте положение цилиндра держать его постоянное каждый день. Используйте один стеклянный цилиндр, на генотип, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между генотипами. Промыть в конце каждого эксперимента и роТейт их между генотипами.
- Проведение экспериментов в окружающего света (или красный свет, если существует потенциальная дефект в видении) при температуре и влажности 22 ° С и 40% соответственно. Чтобы избежать циркадный ритм посрамить всегда проводить эксперименты в то же время суток.
- Печать на вершину цилиндра с барьерной пленки (восковой пленки), чтобы предотвратить утечку любых мух (рис 2).
- Установите видеокамеру на штативе. Фокус камеры на 190 мл линии 250 мл мерный цилиндр (17,5 см).
- Подсчитайте число мертвых мух в нижней части цилиндра и в пищевой флаконах. Запишите этот номер как смертности.
- Очень слегка постучите цилиндр от закрытой пены ячейки площадку многократно с достаточно сил, чтобы вытеснить мух с внутренней нижней поверхности. Нажмите 5 - 10 раз, а другой рукой нажать запись на камере.
- Нажмите кнопку "Запись" на камере.
- Начните VIDео записи камеры и нажмите цилиндр шесть раз в отдельном без ритмического рисунка.
- Провести испытание каждый в течение 2 мин с момента мухи в прошлом постучал и записывать количество мух, пересекающих высоту 17,5 см (190 мл) в каждый момент времени, выбранного (количественно каждые 10 сек). Примечание: маркировка на мл цилиндра будет варьироваться от одной модели к другой цилиндра в зависимости от диаметра. Чтобы избежать ошибки, измерить высоту на каждом цилиндре используется.
- После того, как суд закончился, избавиться от мух в 95% этанола.
- Повторите шаги 2.1 до 2.9, пока все дублированные не были проверены со свежими мух каждый раз.
Примечание: Несмотря на то, 5 повторов может быть достаточно с мутацией, имеющих сильное влияние на передвижение, 10 биологических повторностях 20 мух (200) мух рекомендуется для обнаружения мелких различий. - По окончании эксперимента, мыть цилиндры в лабораторном посудомоечной машиной и сухой O / N, чтобы использовать повторно.
3. Анализ
- АнаZE видео каждый летать суда. Каждый 10 сек, записывать общее количество мух, которые проходят целевой линии.
- Если муха лезет обратно или падает, запись летят, как -1 и рассчитывать на следующий муху пересечь целевой линии, как тот же номер лету, что поднялся обратно или упал. Например, если 15-й муха падает ниже целевой линии, рядом муха, чтобы пересечь линию (16-й летать) считается 15-й муха, а не 16-го.
- Вычитание смертности от общего количества мух (20), чтобы получить количество мух, которые остаются в испытании. В каждый момент времени, получить фракцию пролетает над целевой линии.
- Участок каждый процент на каждый момент времени (рисунок 3).
- Анализ производительности в точке данных 120 сек и выполнять Стьюдента при 2 группы присутствуют или ANOVA и пост-тест для множественных сравнений (с Бонферрони модификации для плановых и внеплановых Тьюки для сотрудничестваmparisons). Колмогорова-Смирнова тесты 17 также выполняется, чтобы установить нормальность и равного дисперсию, но также сравнить распределения мутантного группы контроля.
- Представить данные по старению, построить процент мух восхождение на 120 сек с мухами разных возрастов (2 дня, 1 неделю, 2 недели), чтобы увидеть, если есть прогрессивная дефицит (Рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Восхождение сильным и воспроизводимые поведение. Действительно, в один прекрасный день старые мухи дикого типа достичь целевого расстояния производительность скалолазания быстро (25 - 30 сек). Мутант летает представить диапазон характеристик от легкой (или с задержкой), чтобы завершить неспособность подняться к цели. Проиллюстрируем это здесь с двумя различными мутантных аллелей. Первый тяжелый аллель гена spastin вызванной полной делеции гена spastin (Курорты и велнесс 5.75) 18. В этой строке (Курорты и велнесс 5.75 с TM6b) однажды старые мухи не достигают WT производительность восхождение даже после 2 мин. Этот мутант линия представляет с тяжелыми дефектами даже при использовании флакон метод (рис 1а, б). Преимущество метода, изложенного здесь, становится все более очевидным при изучении мутанта для того же гена, но с неполным удалением опубликованной той же группе (Отели 17-7 с TM3) 18. В этом случае производительность до 8 дней нормально (рис 1С-F (рис 3) или генетического взаимодействия. Для дальнейшего доказательства, включают спасение поведенческого фенотипа с экспрессией белка дикого типа гена для изучаемой. Для исследования взаимодействия, сравнить мух, которые гетерозиготных для обеих мутаций интерес с мухами, что есть только один мутации интерес. Анализ также позволяет контролировать прогрессирование дефекта скалолазания в течение долгого времени, важный аспект в моделировании прогрессивные расстройства опорно-двигательного аппарата (рисунок 4). Кроме того, 2 мин позволяют лучше видеть прогрессирование восхождение в тяжелых мутантов.
Рисунок 1. Сравнение различных скалолазных анализов. Для серьезных мутаций различных степеней восхождение дефекта можно увидеть, используя различные методы, но умеренные мутации не могут быть обнаружены с некоторыми анализов. Чтобы продемонстрировать это, мы использовали два опубликованных мутантных линий для гена spastin:. Spastin 5-75, который содержит полный исключить spastin гена и spastin 17-7, который содержит частичное удаление в spastin гена (А) Во-первых, скалолазание оценивается имея мухи подняться на вершину пустой флакон пищи. В верхней после 18 сек количество мух записывается. Используя этот протокол значительное дефект видел в Spast 5-75 / TM6b по сравнению с контрольной группой дикого типа (N = 10, р <0,001). (Б) Далее, поднимаясь производительность оценивается с помощью метода, описанного здесь. Восхождение также D efective в то же генотипа Spast 5-75 / TM6b. Разница в производительности очень значительным (N = 5, р <0,001), но разрыв в производительности больше. Для мутаций, показанных иметь меньшую мысль эффект (например, Spast 17-7 содержит частичную удаление spastin гена), метод цилиндр, представленные здесь, могут быть более чувствительны. (С) Нет существенных дефектов не наблюдается с 3 дней spast 17-7 / ТМ3 с флакона метода (N = 5). (D) Нет существенных дефектов наблюдается с 3 дней spast 17-7 / TM3 с методом цилиндра (N = 5). (Е) нестатистическая тенденция отметить, с 8 дней spast 17-7 / ТМ3 летит (N = 5). (F) Но значение наблюдается в течение 8 дней spast 17-7 / TM3 протестированы с методом цилиндра, представленного на такое же количество повторов (N = 5, р <0,001).rget = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Схематическое представление экспериментальной установки. 20 мух вставить в стеклянный цилиндр, а затем закрывали воск барьерной пленки. Мухи затем постучал в нижней и количества мух, пересекающих среднюю линию записанного с помощью камеры на 120 сек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Типичные результаты эксперимента восхождения. Процент мух пройдя порог линия представлена каждые 10 сек над duratiна анализа. В этом эксперименте, 3 генетически соответствующие управления (дикого типа, UAS курорты -RNAi / + Elav-GAL4 / +), сравниваются с мухами трансгенных содержащих как UAS и компоненты Gal4 (Elav-GAL4 / UAS курорты -RNAi). UAS Спас-РНК-интерференции от VDRC # 108739. Это представление позволяет для оценки скорости восхождения для каждого генотипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. характерную диаграмму для старения профиль. Поскольку многие локомотивные расстройства прогрессируют, важно, чтобы изобразить эволюцию во времени. На этом графике, WT мухи сравнению с гетерозиготных мутантов (СПА / WT) и транс-гетерозиготные мутанты (spast5-75 / spast17-7) на 2 дня (а) и 8 дней (В)(N = 10, р <0,001). Результаты также изображены с течением времени для 120 сек. момент времени (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дрозофилы уже доказано, отличная модель в болезни 14 и других нейродегенеративных условий 1,2 Паркинсона. В дополнение к генетических инструментов, доступных в Drosophila, его геном высоко консервативен для генов, вовлеченных в неврологических расстройств 19. Появление генома широких методов генетического скрининга (в том числе всей ExoME последовательности), скорее всего, по-прежнему обеспечивают больший список генов-кандидатов, связанных с нарушениями двигательных человека. Разработка процедур для этих условий требует животных моделей, чтобы увеличить понимание патологии, участвующих в ранних стадиях нейродегенерации. Использование дрозофилы и отрицательного geotaxis анализа обеспечивает недорогой и надежный метод идентификации генов, участвующих в локомотивных дефектов, а затем экранировать лекарств-кандидатов для фенотипа спасения. Это добавляет к молекулярной, электрофизиологических и изображений Доказательства тшлем также могут быть получены в том же животной модели. Использование скалолазания анализа, другие успешно воспроизведена моторные дефекты в мух мутанта для генов, нарушающих человеческое передвижение. Тем не менее, предыдущие исследования показали, что патологические изменения могут предшествовать выявление дефектов опорно-двигательного аппарата на несколько дней 14. Это явление наблюдается также при нейродегенеративных условий человека, где мы говорим о субклинических изменений. Мы считаем, что понимание, а затем обработки этих субклинические изменения, модификации болезнь будет значительно улучшена.
Мы представляем здесь модель, которая позволяет обнаруживать дефекты мягких локомоции, которые могут помочь с пониманием отрывок из "presymptomatic симптоматическое" нейродегенеративного патологии с использованием модели дрозофилы. Многие группы использовали короткие расстояния восхождения (5-10 см), но мы увеличили расстояние до 17,5 см, в Палладино и др. 20. Хотя это различиемежду восхождение высоты может показаться незначительным, увеличение высоты должно было увеличить анализа трудности, тем самым помогая в идентификации сравнительно незначительных дефектов восхождение. Кроме того, некоторые методы выбрал, чтобы осветить верхнюю часть цилиндра с волоконно-оптической лампой, чтобы воспользоваться phototaxic реакции Drosophila взрослого. Тем не менее, источник света может вызвать отражение света внутри цилиндра; Таким образом, диффузное головой флуоресцентный источник света используется вместо. Кроме того, мутации в генах, участвующих в нейродегенерации может повлиять глаз функцию и, следовательно, исказить результаты. Увеличение размера пробы от 10 до 20 мух увеличивает статистическую мощность каждого испытания. Первоначально мы увеличили это число в качестве высоко как 30 мух, но впоследствии была снижена для того, чтобы свести к минимуму перенаселенность и взаимодействия эффектов между мух. Образцы выбрасывания после одного использования, а не работать в течение четырех повторных испытаний на образце, чтобы устранить рossibility обучения или усталости. Благодаря мух с чрезвычайно низкой производительности для скалолазания, это контрпродуктивной для записи время, требуемое для 50% мух, чтобы пересечь линию для целевой это может занять значительное количество времени для этого критерии должны быть выполнены. Скорее, мухи были даны длительность 2 мин, чтобы пересечь целевой линии. Количество мух, чтобы пересечь линию был записан и Binned с шагом 10 с, и полученное значение, выраженное в процентах.
Эти условия создают в более чувствительны оценка возможностей для скалолазания для взрослых мухи. В то время как другие конструкции анализа все еще полезны, эта парадигма может рассматриваться в тех случаях, когда исследуются мягкие ранние дефекты. Кроме того, этот анализ может помочь обнаружить меньшие изменения в контексте испытаний лекарств.
Важным вопросом является то, что отрицательное поведение geotaxis основан на мухи перехвата в нижней части цилиндра. Это therefРуды важно оценить другие формы передвижения, например, на плоской поверхности или в полете. Другие аспекты, такие как мотивация и социальное взаимодействие необходимо рассматривать как потенциальный тупик. Другой нюанс в том, что анализ позволяет представлены только один, чтобы оценить передвижения у взрослых мух. Это ограничивает возможность получения нейропатологические корреляты для поведения наблюдается, что очень важно для понимания патогенеза заболевания. Действительно, большинство нейровизуализации работа была проделана в нервно-мышечном соединении личинки до сих пор у дрозофилы. Получение поведение локомоции у личинки могут быть важным шагом для того, чтобы привлечь прямую корреляцию между поведением и патологических изменений.
Это очень важно контролировать температуру и влажность, при которых мухи были выращены и протестированы. В дополнение к эффекту на развитие лету, эти факторы оказали существенное влияние на способность преодолевать мух, поднятые и находится в неидеальных условиях. В рresence повышенной статического электричества или влажности, мухи не работать оптимально. Этот эффект не был одинаковым для всех генотипов, мутант летит, как правило, является более влияют такие факторы, чем в контрольной группе. Кроме того, цилиндры должны быть промыты и высушены должным между каждым экспериментом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| Computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point. |
References
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
- McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. 187, 523-534 (2011).
- Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
- Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
- Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
- Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799 (2011).
- Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
- Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , 1st edn, Springer. (2006).
- Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429 (2004).
- Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Genetics. 166, 835-881 (2004).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Genetics. 161, 1197-1208 (2002).
