一机能磁性纳米纤维素的细菌与氧化铁纳米粒子的制备

Abstract

在这项研究中，由细菌Gluconacetobacter xylinus产生细菌纳米纤维素（BNC）合成并在使用氧化铁纳米颗粒（IONP） _铁 （Fe ₃ O _4） 原位浸渍，得到磁性细菌纳米纤维素（MBNC）。 MBNC的合成是一个精确而专门设计的多步骤过程。简言之，将细菌纳米纤维素（BNC）药膜是从保留G形成根据我们的尺寸和形态的实验要求xylinus菌株。铁（III），氯化六水合物（的FeCl _{3·6H 2} O）和铁（II），氯化四水合物（的FeCl _{2·4H 2} O）与2的溶液：1的摩尔比制备，并在脱氧的高纯度的水稀释。通过BNC防护膜，然后在与反应物的容器中引入的。此混合物搅拌并在硅油浴中和氢氧化铵（14％），在80℃下加热，然后加入通过丢弃以沉淀亚铁离子进入BNC网格。最后一步允许在原地的磁性纳米颗粒_铁 （Fe ₃ O _4）细菌的纳米纤维素网内部形成赋予磁特性BNC薄膜。毒理学测定用来评估BNC-IONP防护膜的生物相容性。聚乙二醇（PEG）被用来覆盖IONPs以改善其生物相容性。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，IONP被优先位于原纤维交织在BNC矩阵的空间，但它们中的一些也沿BNC色带找到。在MBNC进行磁力显微镜测量检测存在磁畴拥有高强度弱磁场，确认MBNC薄膜的磁性质。在这项工作中获得的杨氏模量也都在这些报道的几个血管在以往的研究一个合理的协议。

Introduction

所述bacterian纳米纤维素（BNC）由木醋杆菌菌株，也称为Gluconacetobacter xylinus合成，并且静置培养期间沉积在空气-液体界面上的薄膜或药膜的形式。这些BNC药膜采用在那里它们被生长的容器的形式，并且它们的厚度取决于天在培养数。A. xylinus通过聚合和随后的结晶的方法使用在用于纤维素微纤丝的合成培养基中的葡萄糖。葡萄糖残基的聚合是在细菌细胞外膜，其中葡聚糖链从分布在细胞被膜单个细孔挤出进行。纤维素微纤维的结晶发生在与通过范德华键合形成葡聚糖链片材随后通过氢键¹堆叠片材的胞外空间。

磁铁集成到一个BNC矩阵集成电路纳米颗粒可容易地通过外部磁场，以增加包含磁性纳米粒子需要引导和限制平滑肌细胞的力（平滑肌细胞），在动脉壁的损伤部位进行操作。这种策略保持平滑肌远离其它组织，并保持细胞在抵抗由血液流动所施加的力的地方。它已经显示，平滑肌细胞在血管，在那里形成主要位于中膜²丰富层的vasoelasticity发挥重要的作用。

用于MBNC的合成方法涉及的BNC薄膜浸入并在80℃下铁（III）六水合氯化铁（Ⅱ）四水合氯化的溶液中搅拌。加入氢氧化铵以形成在BNC网格内的氧化铁纳米颗粒。加入氢氧化铵的变化从橙色到黑色的溶液的颜色。该IONPs紧凑沿着BNC纤维一起s的一个非均匀分布。

此协议的重点是细菌纳米纤维素磁性纳米颗粒薄膜，这是我们命名磁性细菌纳米纤维素（MBNC），它的目的是为丢失，损坏或损伤的小直径的血管的替代物使用的设计。 HS Barud和同事最近发表了类似的工作通过在PEG和超顺磁性氧化铁纳米微粒³的稳定的水性分散体混合的BNC药膜，以产生一个基于BNC柔性磁性纸。这里，我们描述了生产细菌纤维素和其就地与磁性纳米颗粒浸渍。基于检测单个DNA链断裂的细胞毒性测定用于测试的BNC和MBNC药膜的生物相容性。

Protocol

1.细菌纳米纤维素的制备（BNC）

注意：所有的步骤都在无菌条件下进行的，除非另有说明。

1. 准备培养基。
   1. 通过组合25克酵母提取物，15g的蛋白胨，125.0克甘露醇，和500毫升的高纯度的水制成500毫升之液体培养基。高压釜在120℃下该混合物在4℃下20分钟，并存储。
   2. 通过加入琼脂15克的5.0克酵母提取物，3.0克胨25.0克甘露醇，和100毫升高纯水中制备100ml半固体介质。高压釜在120℃下该混合物20分钟。一旦高压灭菌，存款将5ml混合物中的90mm×16毫米的塑料陪替氏培养皿。允许在该温度下在4℃下该溶液至凝胶和存储直至进一步使用。
2. 补充水分G. xylinus应变加入1 ml液体培养基和吹吸在冷冻干燥的小瓶保存和下来，按照制造商的说明来表示。
3. 接种含有半固体培养基用接种环菌悬液的小液滴的培养皿。确保接种涵盖从边缘在Z字形方向移动所述环的菜中心的整个培养皿。
4. 孵化培养皿在26℃下72小时在恒温箱不用_的 CO _2。一旦潜伏期结束后，小白色菌落是可见的。如果菌落不立即使用，通过密封用封口膜盖和放置碗碟倒置储存于4℃的培养皿中。菌落可以存储在这种方式长达6个月。
5. 传送2毫升步骤（1.1.1）中制备的液体培养基在24孔组织培养板的每个孔中的。举两个菌落从接种的培养皿步骤的接种针（1.3），并将它们放到组织培养板的第一口井。 - [REPEAT对于剩余23孔相同的步骤。
6. 孵育在30℃下的组织培养板7天。这将产生共24的BNC药膜为16毫米直径，厚度直径约为2-3毫米的如在图1中描绘。
   注：在期间潜伏期任何一点摇动板请勿打扰的细菌培养，例如。在潜伏期，G. xylinus挤出吡喃葡萄糖糖分子，以在气-液界面，即采用静态培养条件下的形状和在烧瓶大小的聚合物结晶的网格。这种聚合物基质，称为细菌纳米纤维素（BNC），是在培养期结束显眼。
7. 从生长培养基收集在BNC药膜和在50℃下消毒他们在200ml的1％的NaOH溶液1小时，以除去G的所有痕迹xylinus。任选地，使用磁力棒搅拌以300rpm此溶液和搅拌板。丢弃该NaOH溶液和加入200毫升新制备的1％的NaOH溶液。重复同样的过程再一次，或直至溶液中的BNC药膜获得一个半透明的外观。
8. 冲洗BNC药膜用水三次，并在室温在高纯度的水将其存储。确保在BNC药膜是在水中完全浸没并且不允许在任何时间进行干燥。
9. 高压釜在121℃下在BNC药膜20分钟。
   注：由Märtson和他的同事进行的老鼠的体内皮下研究表明后60周植入BNC非降解的迹象。的确，BNC是由微生物和真菌酶，它们是在哺乳动物中不存在于自然界降解的。另一方面，在BNC的生物降解性可以是机械，化学，和削弱体内 ⁴的微纤维网的生物过程的结果。

2.合成聚合物涂层氧化铁纳米粒子及其在细菌纳米纤维素膜沉积

1. 气泡1,000ml中，用氮气高纯度水，以便除去任何溶解的氧气在水中，并用氮气替换。
2. 使用的三颈圆底烧瓶中，以在一个2制备溶液：铁（III），氯化六水合物（的FeCl _{3·6H 2} O）和铁（II）四水合氯化的1摩尔比（的FeCl _{2·4H 2} O）稀释与脱氧高纯度的水。例如，使用5.4克三氯化铁_{3·6H 2} O和10毫升脱氧高纯度水1.98克的FeCl _{2·4H 2} O的。如果这个准备转向过于粘稠，不易搅拌均匀，用0.54克三氯化铁_{3·6H 2} O和0.198克的FeCl _{2·4H 2} O在20毫升脱氧高纯度的水。
   注意：通过称量此通道缩小的FeCl _2·4H的曝光时间₂ O至空气emical化合物尽可能快。一旦在该三颈圆底烧瓶中引入，关闭与隔膜止动件的三颈圆底烧瓶中，直至其被连接到氮气供给和冷凝管。
3. 使用该容器的两个颈部通过连接氮气供给到在一个隔塞冲孔并固定在容器的颈部的针提供恒定的入口和氮气的输出。
4. 放置其在与反应物的容器中而制备先前在步骤1.5（直径为15.6毫米，厚度为2-3毫米）1个BNC防护膜。确保将样品中的液体完全浸没。
5. 容器的剩余颈部连接到一个冷凝管。此外，使用填充有在冷凝器管顶部的无水硫酸钙干燥管。通过冷凝器管运行的水。
6. 全密封玻璃接缝的真空硅脂。
7. 使用搅拌在硅油浴将溶液加热至80℃烤盘和保持此温度直到步骤2.10。用一个小的磁力搅拌棒以350转5分钟的反应物混合。确保在BNC适当与亚铁溶液浸渍和反应物完全溶解。保持搅拌该混合物，直至实验结束。
   注：利用温度计来验证硅油的温度。它应该是稳定至80℃。
8. 使用移液针，这一直增加搅拌速度至700转，并添加（滴加），在（NH ₄ OH，14％）的5分钟，加入5ml氢氧化铵的时间间隔，以10毫升亚铁溶液还砸出一个隔塞。加入氢氧化铵后，将溶液的颜色从黄色/橙色变为黑色。
9. 继续在80℃搅拌该溶液另外5分钟。避免高速蛛丝马迹以保持样品的完整性。高速行驶时， 即高于1000转，可以摧毁例子。
10. 降低溶液的温度升高到30℃，用搅拌加热板的温度控制底部，并保持搅拌另外5分钟。然后，关闭热板。在这一点上，IONP已纳入在BNC网格。
11. 冷却该混合物至RT和磁性纳米颗粒（MNP）和BNC使用强永久磁铁（ 例如 ，1特斯拉）分开。要做到这一点，将混合物转移到一个容器烧瓶中，然后，在保持磁铁靠近容器，握住的MNP和BNC到位而倾析上清液。
    注：在处理强磁铁时，因为不正确使用时，他们可能是有害的注意。对于步骤（2.12） - （2.14）和（2.16）使用（2.1）先前准备的脱氧高纯度的水，以防止氧化颗粒。
12. 重悬的MNP和BNC在100毫升水中。轻轻摇动解决方案删除所有未强烈纳入BNC的的MNP。倒出标通过使用磁铁持有的MNP和BNC的地方再次upernatant。
13. 用水洗涤的MNP和BNC几次直至上清液达到中性pH（pH约7），如用比色条进行测定。
14. 用镊子独立于的MNP磁功能化的BNC或磁细菌纳米纤维素（MBNC），并用清水冲洗MBNC几次，直到水变清。
15. 由MBNC O / N暴露于紫外线（110-280纳米）消毒MBNC​​。
16. 在120℃下进行20分钟的高压釜500毫升脱氧高纯度水，并存储MBNC在20ml这种水。
17. 无菌，浸入所述样品中聚乙二醇的1％，并搅拌在RT（37℃）2小时。此过程改善沉积在BNC的氧化铁纳米颗粒，特别是那些在表面^5-7露出的生物相容性和稳定性。所述PEG涂层将在MBNC三维网络进行分发。
    注：裸IONP很容易在空气中氧化因为他们的高化学活性^8。即使PEG被认为是一种非生物降解的材料，其化学稳定性取决于所施加的生物条件，例如水含量，pH值，温度，酶的存在下，活性氧，活性氮种类和其他^9。

3. BNC和MBNC药膜的表征

1. 机械性能
   1. 执行正常装载和使用Berkovich压头卸载纳米压痕试验。 Berkovich压金刚石压头的半径为20纳米。
   2. 用熔融硅和钨的接触面积标定，因为在室温压痕深度的函数。在测试过程中，用胶安装在缩进的样品。压头接触在其厚度方向上的样品。
   3. 样本表面上随机选择缩进位置。保持2缩进之间的间距200-300毫米之间。
   4. 适用的负载的样品中的步骤，并记录该压头的相应位移。分析负载VS深度的情节找到了杨氏模量。
   5. 通过施加0.0001 MN /秒和0.005 MN /秒之间的负荷率，用0.01 mN与0.60 MN之间高峰负荷进行在去离子水（DI水），以及测试存在下样品的纳米压痕测试。
   6. 使用液体池，并保持样品液体环境下。对于浸在液体环境中的纳米机械表征这种独特的设置是理想的有效模拟BNC和MBNC膜的覆盖面生物力学功能。
2. 结构表征SEM
   1. 通过扫描电子显微镜（SEM）表征纳米纤维素纤维结构。
   2. 冻干的样品在-80℃下24小时。然后安装在SEM螺栓，用金钯薄膜溅射10秒，并用扫描电镜分析。
   3. 在22,000X的放大倍数取图像和60,000，用5千伏的加速电压。
3. 磁畴
   1. 允许MBNC药膜完全干燥在RT，并随后暴露5分钟以一永久磁铁（1特斯拉）。
   2. 立即，进行使用根据制造商的协议的生物AFM磁力测量。
   3. 对于每次测量，第一捕捉地形特征和第二遍期间获取磁畴。获得在非接触模式与生物AFM两种测量。
   4. 纳米颗粒的磁特性在物理性能的测量系统的量子设计 （PPMS），使用振动样品磁强计（VSM）在-10,000至10,000奥斯特的范围内进行的，在室温（300K），用磁场。
4. 细胞相容性
   1. 种子的人主动脉平滑肌细胞（HASMC）在6孔组织培养板在1.0×10的密度2，并在试验样品的存在下培养24小时：BNC和MBNC药膜（每个15.6毫米直径的的）。
   2. 分别使用未经处理的和过氧化氢处理的细胞群体作为阴性和阳性对照。
   3. 根据制造商的协议和由A. Azqueta＆AR柯林斯¹⁰建议的准则进行彗星测定。
   4. 使用核酸染料SYBR金在该试验中，以相互插入和荧光标记载根据制造商的协议的电泳样品中的DNA。
      注意：不进行在BNC和MBNC样品存在任何DNA损伤的细胞，会呈现荧光绿色圆形类核，而DNA受损细胞将长彗星 - 阳性样本将有类核（彗星头部），其次是含有DNA碎片材料（尾部DNA的百分比）的尾巴。

Representative Results

G.潜伏期xylinus共9天是，但菌膜开始较早形成和后约2天是显而易见的。在BNC的宏观外观显示在图1中 ，它模仿了菜生长的培养物的形状。 图 2描述了用于生产BNC-IONP药膜，其总结涉及协议之上以及主要步骤的主要部件的配置。

SEM图像被用来解决微观结构，形态，和BNC（ 图3）和在官能化的BNC IONP分布的纤维的空间分布（ 图4）。该BNC是由形成整个网络畅通毛孔没有定义的模式细带（直径约50纳米）形成。该IONP是优先禄由纤维交织形成的孔，形成在尺寸100nm以上的簇之间ated。个别IONP也沿色带的约束。该MBNC表现相比，BNC不太压实纤维结构，可能是因为IONP汇集BNC的丝带。磁力显微镜被用来在MBNC的地形来重构磁性轮廓（ 图5A，B）。形成在MBNC，这些都没有在未处理的BNC（ 图5A）观察到500纳米的直径或更大的大孔隙。这与在SEM显微照片，其中该MBNC显示比未修饰的BNC更加多孔结构的观察一致。整个MBNC面（ 图5B），其对比度不与富IONP地区的地形MBNC图像（ 图5A）形成的丘陵和山谷相关检测不同的磁化两个域的磁力梯度。高和弱INTEnsity磁场在图5B分别表示为黄色和绿色。纳米粒子，这是测嵌入在细菌纳米纤维素的磁滞回线中，示出在图5中提供的证据表明所有IONPs是超顺在室温，用没有滞后。

HASMC在MBNC的BNC的存在和下培养以测试对单个细胞的生存能力暴露于这些异物造成的任何不利影响。在单个细胞损伤的程度被检测的DNA链断裂（ 图6）进行定量。结果进行比较，以HASMC在37℃，95％空气和5％的CO _2（阴性对照）中，用30分钟过氧化氢 ​​诱导的基因毒性（100μMH ₂ O _2），以HASMC正常培养条件（下生长阳性对照）。采用t检验配对比较表明日在MBNC的影响对细胞活力分别为从这些上HASMC（ 对 -值<0.001，***）与过氧化氢 ​​处理诱导显著不同。

图1. 细菌纳米纤维素的宏观方面，11天的潜伏期，这是后约已获得BNC药膜。 3毫米的厚度。潜伏期取决于预期用途的要求。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.制作磁性功能化纳米纤维素的细菌的。氧化铁纳米颗粒组装和我 在 BNC内原位 ncorporated，产生MBNC。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. BNC的SEM图像。该BNC显示精细的网络和非聚集带为50纳米或更小尺寸。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4 的BNC-IONP薄膜。氧化铁纳米颗粒（IONP）被优先定位在交错带之间SEM图像 。D / 52951 / 52951fig4large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图5. MBNC和磁畴结构的AFM形貌。MBNC的（A）表面形貌呈现高度封装的纳米粒子，它站在纳米纤维结构上面的斑点。 （B），黄色和绿色领域表示不同的磁化强度和高强度弱磁场的两个地区分别。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6. 在多大程度上HASMC DNA损伤被曝光后到BNC，和MBNC分别PosCtl表示HASMC将经历过氧化氢 ​​处理用于比较目的。 NegCtl表示HASMC正常培养条件下生长。在MBNC对HASMC活力的不利影响是来自那些在PosCtl（p值<0.001，***）观察显著不同。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

在BNC防护膜的厚度和尺寸可以通过改变培养时间和其所静态培养中生长的烧瓶的尺寸来容易地操纵。在BNC的microproperties，如孔隙率，可以通过在静态培养改变氧气比修改。高浓度的氧气产生更严厉的BNC ^11。 A.布丹和同事制作了一个爆破压力BNC的直径达880毫米汞柱通过在G的发酵过程中改变从大气中的氧气到100％氧气的氧气比率xylinus ^12。同样地，在BNC的孔隙率，也可通过将致孔剂如石蜡微球到发酵过程中引入。在这种情况下，所得到的孔隙率和孔互连性将依赖于致孔剂尺寸^13。

在BNC的多孔网络允许它们用纳米粒子， 例如官能化，用于药物输送代理商。在我们的研究中，我们通过合成和原位生长纳米颗粒进入BNC膜，为了实现快速细胞募集和依恋基于BNC-支架磁性功能化的协议与BNC IONP。纳米力学测试显示，BNC的纳米级响应与血管¹⁴的行为类似于具有非常低杨氏模量，E = _BNC 0.0025 GPA样品里面在表面0.04 GPA。得到的值是在与那些由Fu等 ¹⁵中观察到的范围内。

过量IONP的可以很容易地从BNC由于材料的高孔隙率除去。 SEM照片表明，纳米颗粒主要分布在由纤维交织形成并分散沿色带的空间。在这个协议中使用的铁物质的浓度产生高密集打包IONP，这带来了BNC的丝带在一起。这导致了MBNC具有比那些未改性的BNC的较大的孔。奥尔森等人的，谁使用的FeSO ₄的不同浓度/ _氯化钴盐在纤维素纳米纤维气凝胶的合成BNC相同体积分数，报告了在BNC孔隙率有类似的增加时，他们改变强磁性钴铁素体的体积分数从0.7％纳米至^5.7％16。在MBNC此高孔隙率可以是用于药物增加所述恢复时沉积有利的，并且避免再狭窄在受损动脉壁。

缺少地形特征和磁性相位图像之间的相关性也已经由B.托瑞等人 ^17，谁指出地形和稀疏纳米颗粒薄膜的磁信号之间的独立性描述。进一步的表征研究需要进行以确定磁化滞后（MH +）经由SQUID-VSM SY的MBNC的环茎。

的MBNC表现出对毒性作用低电位，根据在彗星试验观察到的结果，表明该材料是生物相容的，使用与细胞相接触。

在该过程中最关键的步骤都涉及到的氢氧化铵的量，并在其加入的速度，以及确保在反应过程中的溶液在BNC的完整浸泡和搅拌。第一方面确定所得的氧化铁纳米颗粒的大小，而第二个影响纳米颗粒如何横跨BNC矩阵的分布。为了更好地控制的MNP的大小，与活塞的滴定管可以用于调节加入滴加氢氧化铵到反应。 BNC小片可在溶液中完全浸没宜， 例如 ，为10毫升的溶液总体积的约19 ^平方厘米的尺寸。一LIMI这种技术的塔季翁是IONP的BNC网格内的不均匀分布。

这个协议描述了用于掺入氧化铁纳米颗粒中的BNC以形成复合材料的方法。因为生物相容性和两个BNC和氧化铁纳米颗粒的物理和力学性能的，该MBNC可以在多种生物医学应用，例如药物递送系统和支架为细胞生长中使用。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Agar	Sigma Aldrich	A1296-500G
D-Mannitol Bioxtra	Sigma Aldrich	M9546-250G
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
Bacteriological Peptone	Sigma Aldrich	P0556
Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water	Sigma Aldrich	158127-100G
Iron(III) Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	236489-100G
Ammonium Hydroxide	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Iron (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	44939-250G
Disposable Petri dish	Sigma Aldrich	BR452000
Disposable Inoculating Loop	Fisher Scientific	22-363-604
Anhydrous Calcium Sulfate	W.A. Hammond Drierite	13001
High vacuum grease	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends	Sigma Aldrich	CAD7937-12EA
pH test strips	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Round-bottom three neck angle type distilling flask	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Silicone oil for oil baths	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Drying Tube	Chemglass	CG-1295-01
Septum Stopper, Sleeve Type	Chemglass	CG-3022-98
Magnetic stir bar	Chemglass	CG-2001-05
Condenser	Chemglass	CG-1218-01
Temperature Controller	BriskHeat	SDC120JC-A
Stirring Hotplate	Fisher Scientific	11-100-49SH
Comet Assay Kit	Trevigen	4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494
bio-AFM	JPK Instruments	NanoWizard 4a BioScience AFM
Nanoindenter	Micro Materials Ltd	Multi-module mechanical tester
Scanning electron microscopy (SEM)	Hitachi High Technologies America	Hitachi S-4800