Abstract
In questo studio, nanocellulose batterica (BNC) prodotto dal batterio Gluconacetobacter xylinus è sintetizzata e impregnato in situ con nanoparticelle di ossido di ferro (IONP) (Fe 3 O 4) per ottenere un nanocellulose batterica magnetica (MBNC). La sintesi di MBNC è un processo preciso e specificamente progettato multi-step. In breve, nanocellulose batterica (BNC) pellicole sono formate da conservato G. xylinus ceppo in base alle nostre esigenze sperimentali di dimensioni e morfologia. Una soluzione di ferro (III) esaidrato (FeCl 3 · 6H 2 O) e ferro (II) cloruro tetraidrato (FeCl 2 · 4H 2 O) con un 2: rapporto molare 1 viene preparata e diluita in acqua ad elevata purezza deossigenato. Una pellicola BNC viene quindi introdotto nel recipiente con i reagenti. Questa miscela viene agitata e riscaldata a 80 ° C in un bagno di olio di silicone e idrossido di ammonio (14%) viene quindi aggiunta da cadere per precipitare ilferrosi ioni nella maglia BNC. Questo ultimo passaggio consente di formare in situ di nanoparticelle di magnetite (Fe 3 O 4) all'interno della rete nanocellulose batterica per conferire proprietà magnetiche a BNC pellicola. Un test tossicologico è stato utilizzato per valutare la biocompatibilità del pellicle BNC-IONP. Polietilenglicole (PEG) è stato utilizzato per coprire i IONPs al fine di migliorare la loro biocompatibilità. microscopia elettronica a scansione (SEM) immagini ha mostrato che la IONP si trovavano preferenzialmente nella fibrilla interlacciamento spazi della matrice BNC, ma alcuni di loro sono stati trovati anche lungo i nastri BNC. misurazioni microscopio a forza magnetiche eseguite sul MBNC rilevati i domini magnetici di presenza con il campo magnetico ad alta e debole intensità, a conferma della natura magnetica della pellicola MBNC. I valori modulo di Young ottenuti in questo lavoro sono anche in un accordo ragionevole con quelli riportati da diversi vasi sanguigni in studi precedenti.
Introduction
Il nanocellulose batteriologica (BNC) viene sintetizzato Acetobacter xylinum ceppo, noto anche come Gluconacetobacter xylinus, e depositato sotto forma di film o pellicole sulla interfaccia aria-liquido in coltura stazionaria. Queste pellicole BNC adottano la forma del contenitore in cui vengono coltivati, ed il loro spessore dipende dal numero di giorni in coltura. A. xylinus utilizza il glucosio nel mezzo per la sintesi delle microfibrille di cellulosa attraverso un processo di polimerizzazione e successiva cristallizzazione. La polimerizzazione dei residui di glucosio viene effettuata a membrana extracellulare batterica in cui le catene glucano sono estrusi da singoli pori distribuiti su cellule envelope. La cristallizzazione delle microfibrille di cellulosa verifica nello spazio extracellulare con la formazione di strati di catena glucano da van der Waals legame seguita impilando dei fogli da H-bonding 1.
Magnetenanoparticelle ic integrati ad una matrice BNC possono essere manipolati facilmente da un campo magnetico esterno al fine di aumentare la forza necessaria per dirigere e confinare cellule muscolari lisce (SMC) contenente nanoparticelle magnetiche, al sito danneggiato della parete arteriosa. Questa strategia mantiene il CML lontano da altri tessuti, e tiene le celle al posto contro la forza esercitata dal flusso sanguigno. E 'stato dimostrato che SMCs svolgono un ruolo importante nella vasoelasticity del vaso sanguigno, dove formano strati abbondanti situate prevalentemente nella tunica media 2.
Il metodo utilizzato per la sintesi di MBNC comporta BNC pellicle immerso e agitata in una soluzione di ferro (III) cloruro esaidrato e ferro (II) cloruro tetraidrato a 80 ° C. idrossido di ammonio viene aggiunta per formare nanoparticelle di ossido di ferro all'interno della maglia BNC. L'aggiunta di idrossido di ammonio cambia il colore della soluzione da arancione al nero. La compatta IONPs insieme lungo la fibrilla BNCs con una distribuzione non uniforme.
Questo protocollo concentra sulla progettazione di un batterica pellicle nanoparticelle nanocellulose-magnetico, che abbiamo chiamato magnetica nanocellulose batterica (MBNC), che intende utilizzare in sostituzione di mancanti, vasi sanguigni di piccolo diametro danneggiati o feriti. HS Barud e collaboratori hanno recentemente pubblicato un lavoro simile per la produzione di una carta magnetica flessibile BNC a base mescolando pellicole BNC in una dispersione acquosa stabile di PEG e nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche 3. Qui, descriviamo la produzione di cellulosa batterica e la sua impregnazione in situ con nanoparticelle magnetiche. Un test di citotossicità in base alla rilevazione del singolo rotture del DNA è stato utilizzato per testare la biocompatibilità delle pellicole BNC e MBNC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione del batterica Nanocellulose (BNC)
Nota: Tutte le operazioni vengono eseguite in condizioni asettiche, se non diversamente indicato.
- Preparare terreno di coltura.
- Preparare 500 ml di terreno di coltura liquido combinando 25 g di estratto di lievito, 15 g di peptone, 125,0 g di mannitolo e 500 ml di acqua ad elevata purezza. Autoclave questa miscela a 120 ° C per 20 min e conservare a 4 ° C.
- Preparare 100 ml di supporti semisolidi aggiungendo 15 g di agar a 5,0 g di estratto di lievito, 3,0 g di peptone, 25,0 g di mannitolo e 100 ml di acqua ad elevata purezza. Autoclave questa miscela a 120 ° C per 20 min. Una volta autoclavato, deposito 5 ml della miscela in un x 16 mm plastica Petri 90 mm. Lasciare la soluzione di gel a 4 ° C e conservare a questa temperatura fino a nuovo uso.
- Reidratare G. xylinus ceppo conservato in fiale liofilizzate con l'aggiunta di 1 ml di terreno di coltura liquido e pipettando su ebasso, come indicato dalle istruzioni del produttore.
- Inoculare le piastre di Petri contenenti supporti semisolidi con piccole gocce di sospensione batterica utilizzando un ciclo inoculo. Assicurarsi che l'inoculo copre l'intera piastra Petri spostando l'anello in una direzione zag zig dalla periferia al centro del piatto.
- Incubare le piastre di Petri a 26 ° C per 72 ore in un incubatore senza CO 2. Dopo il periodo di incubazione, piccole colonie bianche sono visibili. Se non vengono utilizzati immediatamente le colonie, memorizzare le piastre Petri a 4 ° C sigillando il coperchio con parafilm e disporre le stoviglie capovolta. Le colonie possono essere memorizzati in questo modo fino a 6 mesi.
- Trasferimento 2 ml di mezzo di coltura liquido preparato al punto (1.1.1) in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti di coltura tissutale. Prendere due colonie con un ago da inoculo delle piastre seminate Petri nella fase (1.3) e metterli nel primo pozzo della piastra di coltura tissutale. REPEAT la stessa procedura per le restanti 23 pozzetti.
- Incubare la piastra di coltura tissutale a 30 ° C per 7 giorni. Ciò produrrà un totale di 24 BNC pellicole con diametro di 16 mm e uno spessore di circa 2-3 mm di diametro come illustrato in Figura 1.
Nota: non disturbare la coltura batterica in qualsiasi momento durante il periodo di incubazione, per esempio agitando le piastre. Durante il periodo di incubazione, G. xylinus estrude molecole di zucchero glucopiranosio per formare una maglia cristallina polimerico nell'interfaccia aria-liquido, che adotta la forma e le dimensioni del pallone in condizioni di coltivazione statiche. Questa matrice polimerica, detto nanocellulose batterica (BNC), è evidente alla fine del periodo di incubazione. - Raccogliere le pellicole BNC dal supporto di crescita e sterilizzare in 200 ml di 1% di soluzione di NaOH per 1 ora a 50 ° C, al fine di eliminare ogni traccia di G. xylinus. Opzionalmente, mescolare questa soluzione a 300 rpm con una barra magneticae una piastra di agitazione. Scartare la soluzione di NaOH e aggiungere 200 ml di soluzione preparata 1% NaOH. Ripetere lo stesso processo ancora una volta o fino a quando le pellicole BNC in soluzione acquisisce un aspetto traslucido.
- Lavare le pellicole BNC con acqua tre volte e conservarli in acqua ad elevata purezza a temperatura ambiente. Assicurarsi che le pellicole BNC sono completamente immersi in acqua e non sono autorizzati a essiccare in qualsiasi momento.
- Autoclave le pellicole BNC a 121 ° C per 20 min.
Nota: Uno studio sottocutanea in vivo nel ratto eseguita da Martson e collaboratori hanno mostrato segni non degradazione del BNC dopo 60 settimane impianto. Infatti, BNC è degradabile in natura dagli enzimi microbici e fungine, assenti nei mammiferi. D'altra parte, la biodegradabilità del BNC può essere il risultato di processi biologici che indeboliscono la rete microfibril in vivo 4 meccanica, chimica e.
2. Sintesi di Polymer-coatedDi ossido di ferro nanoparticelle e la sua deposizione in un batterica Nanocellulose membrana
- Bubble 1.000 ml di acqua ad elevata purezza con gas azoto per eliminare l'ossigeno disciolto nell'acqua e sostituirla con azoto.
- Utilizzare un tre colli pallone a fondo tondo a preparare una soluzione in un rapporto 2: 1 molare di ferro (III) cloruro esaidrato (FeCl 3 · 6H 2 O) e ferro (II) cloruro tetraidrato (FeCl 2 · 4H 2 O) diluito con l'acqua di elevata purezza deoxygenated. Ad esempio, utilizzare 5,4 g di FeCl 3 · 6H 2 O e 1,98 g di FeCl 2 · 4H 2 O in 10 ml di acqua ad elevata purezza deossigenato. Se questa preparazione diventa troppo viscoso e difficile da agitare, utilizzare 0,54 g di FeCl 3 · 6H 2 O e 0,198 g di FeCl 2 · 4H 2 O in 20 ml di acqua ad elevata purezza deossigenato.
Nota: Ridurre il tempo di esposizione del 4H FeCl 2 · 2 O all'aria pesando questo chcomposto emical il più velocemente possibile. Una volta introdotto nel pallone a fondo rotondo a tre colli, chiudere il tre colli pallone a fondo tondo con tappo setto finché non è collegato all'alimentazione di gas azoto e il tubo del refrigerante. - Utilizzare due colli della nave per fornire un ingresso e l'uscita di azoto costante collegando l'alimentazione di gas azoto per un agugliato in un tappo setto e fissato al collo del vaso.
- Posizionare 1 BNC pellicola che è stato preparato in precedenza al passo 1.5 (15,6 mm di diametro e 2-3 mm di spessore) nel recipiente con i reagenti. Assicurarsi che il campione è completamente sommerso nel liquido.
- Collegare collo restante della nave verso un tubo del refrigerante. Inoltre, utilizzare un tubo di essiccazione riempito con solfato di calcio anidro in cima al tubo del refrigerante. Eseguire l'acqua attraverso il tubo del refrigerante.
- Sigillare tutti i giunti di vetro con grasso per vuoto.
- Riscaldare la soluzione in un bagno di olio di silicone a 80 ° C con una agitazionepiastra e mantenere questa temperatura fino al punto 2.10. Utilizzare una piccola ancoretta magnetica per miscelare i reagenti a 350 rpm per 5 min. Assicurarsi che il BNC è opportunamente impregnato con la soluzione ferrosi e dei reagenti sono completamente sciolto. Tenere agitazione la miscela fino alla fine dell'esperimento.
Nota: Utilizzare un termometro per verificare la temperatura dell'olio di silicone. Essa deve essere stabile a 80 ° C. - Aumentare la velocità di agitazione a 700 rpm e aggiungere (facendo cadere), in un intervallo di tempo di 5 minuti, 5 ml di idrossido di ammonio (NH 4 OH, 14%) al 10 ml di soluzione ferrosa utilizzando un ago pipettaggio, che è stata anche un pugno in un tappo setto. Dopo l'aggiunta di idrossido di ammonio, il colore della soluzione cambia da giallo / arancio al nero.
- Continuare a mescolare la soluzione a 80 ° C per altri 5 minuti. Evitare fermenti ad alta velocità al fine di mantenere l'integrità del campione. Elevate velocità, cioè, superiore a 1.000 rpm, possono distruggereil campione.
- Abbassare la temperatura della soluzione a 30 ° C utilizzando il fondo controllo della temperatura della piastra agitazione e mantenere agitazione per altri 5 minuti. Quindi, spegnere la piastra calda. A questo punto, il IONP sono stati inseriti nella rete BNC.
- Raffreddare il composto fino a RT e separare le nanoparticelle magnetiche (MNP) e BNC con un forte magnete permanente (ad esempio, 1 Tesla). Per fare questo, trasferire la miscela in un pallone nave e quindi, mantenendo il magnete vicino alla nave, tenere il MNPs e il BNC in posizione mentre decantazione del supernatante.
Nota: Fare attenzione nel maneggiare i magneti forti dal momento che possono essere dannosi se usati in modo errato. Per la procedura (2.12) - (2.14) e (2.16) utilizzano l'acqua deossigenato elevata purezza preparata precedentemente in (2.1) per evitare che particelle dall'ossidazione. - Risospendere il MNPs e BNC in 100 ml di acqua. Agitare delicatamente la soluzione per rimuovere tutte le MNPs che non sono fortemente incorporati nella BNC. Decantare il supernatant di nuovo tenendo il MNPs e il BNC in posizione con il magnete.
- Lavare il MNPs e più volte BNC con acqua fino a quando il surnatante raggiunge pH neutro (pH ~ 7), come misurato utilizzando una striscia colorimetrico.
- Separare il nanocellulose batterica magnetico-funzionalizzati BNC o magnetico (MBNC) dal MNPs con una pinzetta e sciacquare la MBNC più volte con acqua fino a quando l'acqua è pulita.
- Sterilizzare il MBNC esponendo il MBNC O / N a UV (110-280 nm).
- Autoclave 500 ml di acqua ad elevata purezza deoxygenated a 120 ° C per 20 min e memorizzare il MBNC in 20 ml di questa acqua.
- Asetticamente, immergere il campione in 1% di PEG e mescolare per 2 ore a temperatura ambiente (37 ° C). Questo procedimento migliora la biocompatibilità e la stabilità delle nanoparticelle di ossido di ferro depositato nel BNC, specificamente quelle esposte in superficie 5-7. Il rivestimento PEG sarà distribuita attraverso la rete MBNC 3D.
Nota: Naked IONP sono facilmente ossidato in ariaa causa della loro elevata attività chimica 8. Anche se PEG è considerato un materiale non biodegradabile, la sua stabilità chimica dipende dalle condizioni biologiche applicate come contenuto di acqua, pH, temperatura, presenza di enzimi, specie reattive dell'ossigeno, specie reattive, e 9 altri.
3. Caratterizzazione del BNC e MBNC pellicole
- Proprietà meccaniche
- Eseguire carico normale e test di scarico nanoindentazione con un penetratore Berkovich. Il raggio di Berkovich diamante penetratore è di 20 nm.
- Utilizzare silice fusa e tungsteno calibrare area di contatto in funzione della profondità di penetrazione a RT. Durante la prova, montare i campioni nello indentazione con colla. Il penetratore avvicinato i campioni nella sua direzione di spessore.
- Selezionerà casualmente posizioni di indentazione su superfici campioni. Mantenere la distanza tra 2 rientri tra 200-300 mm.
- Applicare il carico allacampioni in passi e registrare lo spostamento corrispondente del penetratore. Analizzare la trama di carico vs profondità per trovare il modulo di Young.
- Eseguire il test nanoindentazione dei campioni in presenza di acqua deionizzata (DI acqua), e prova applicando tassi di carico tra 0,0001 mN / sec e 0.005 mN / sec, con carico picco tra 0,01 mN e 0,60 mN.
- Utilizzare una cella di liquido e mantenere i campioni in ambiente liquido. Questa configurazione unica per la caratterizzazione nanomeccaniche immerso in un ambiente fluido è ideale per simulare efficacemente la portata funzionalità biomeccanica delle membrane BNC e MBNC.
- Caratterizzazione strutturale da SEM
- Caratterizzare la struttura della fibra nanocellulose microscopio elettronico a scansione (SEM).
- Lyophilize i campioni per 24 ore a -80 ° C. Poi montare su borchie SEM, polverizzare con il film Au-Pd per 10 secondi e analizzare mediante SEM.
- Prende le immagini con un ingrandimento di 22,000Xe 60,000X, con una tensione di accelerazione di 5 kV.
- domini magnetici
- Lasciare le pellicole MBNC asciugare completamente a temperatura ambiente, e successivamente esporre per 5 minuti per un magnete permanente (1 Tesla).
- Immediatamente, effettuare le misure di forza magnetica utilizzando un bio-AFM secondo il protocollo del produttore.
- Per ciascuna misurazione, catturare prima le caratteristiche topografia e acquisire i domini magnetici durante un secondo passaggio. Ottenere entrambe le misure con la bio-AFM in modalità senza contatto.
- Caratterizzazione magnetica delle nanoparticelle è condotta utilizzando vibrante magnetometro campione (VSM) nel sistema misurazioni proprietà fisiche (PPMS) di Quantum Design, a temperatura ambiente (300 K), con un campo magnetico nell'intervallo da -10000 a 10.000 Oe.
- citocompatibilità
- Seme umano aortica cellule muscolari lisce (HASMC) in una piastra di coltura tissutale 6 pozzetti ad una densità di 1.0x10
- Utilizzare popolazioni di cellule non trattate e perossido trattata idrogeno come controlli negativi e positivi rispettivamente.
- Eseguire il test di Comet secondo protocolli del produttore e le linee guida suggerite da A. Azqueta & AR Collins 10.
- Utilizzare il colorante acido nucleico SYBR oro in questo saggio di intercalare e fluorescente etichettare il DNA contenuto nei campioni elettroforesi secondo il protocollo del produttore.
Nota: le cellule che non sono sottoposti ad alcuna danni al DNA in presenza di campioni BNC e MBNC, mostrerà una fluorescenza rotonda nucleoide verde, mentre le cellule danneggiate del DNA avranno lungo comete - campioni positivi avranno nucleoidi (la testa della cometa) seguito da code che contengono materiale DNA frammentato (percentuale di DNA nella coda).
- Seme umano aortica cellule muscolari lisce (HASMC) in una piastra di coltura tissutale 6 pozzetti ad una densità di 1.0x10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il periodo di incubazione di G. xylinus era un totale di 9 giorni, ma le pellicole cominciò a formare prima ed erano evidenti dopo circa 2 giorni. L'aspetto macroscopico del BNC è illustrato nella Figura 1, la cui forma imita quella della cultura piatto coltivate. Figura 2 descrive il procedimento per produrre pellicole BNC-IONP, che riassume le principali fasi del protocollo di cui sopra nonché la configurazione dei componenti principali.
Immagini SEM stati usati per risolvere la microstruttura, la morfologia e la distribuzione spaziale delle fibre di BNC (figura 3) e la distribuzione IONP in funzionalizzato BNC (figura 4). Il BNC è formato da nastri sottili (circa 50 nm di diametro) che formano pori aperti tutta la rete, senza uno schema definito. Il IONP sono preferenzialmente located tra i pori formati da fibrille intreccio, formando gruppi di 100 nm o più dimensioni. Individual IONP sono anche legati lungo i nastri. Il MBNC presenta una struttura fibrillare meno compatta rispetto al BNC, probabilmente perché IONP riunire nastri del BNC. Microscopio a forza magnetica è stato usato per ricostruire il profilo magnetico al topografia del MBNC (Figura 5A, B). Grandi pori di 500 nm di diametro o più grandi sono formati nella MBNC, che non sono stati osservati in greggia BNC (Figura 5A). Ciò è in accordo con le osservazioni che accompagnano le microfotografie SEM, dove il MBNC visualizza una struttura più porosa rispetto alla non modificato BNC. Un gradiente forza magnetica con due domini di diversa magnetizzazione è stato rilevato attraverso la superficie MBNC (Figura 5B), il cui contrasto non correlano con le colline e le valli formate da regioni IONP-ricche in MBNC immagini topografiche (Figura 5A). Alta e debole intecampi magnetici nsity sono indicati come giallo e verde in Figura 5B rispettivamente. Il ciclo di isteresi delle nanoparticelle, misurata incorporati nel nanocellulose batterica, è mostrato in Figura 5 fornire la prova che tutte le IONPs erano superparamagnetico a RT, senza isteresi.
HASMC sono state coltivate in presenza di BNC e del MBNC per verificare eventuali effetti negativi sulla vitalità delle singole cellule come risultato di esposizione a questi materiali estranei. L'entità del danno in singole cellule è stata quantificata la rilevazione di rotture del DNA (Figura 6). I risultati sono stati confrontati HASMC coltivazione in normali condizioni di coltura di 37 ° C, 95% di aria e 5% di CO 2 (controllo negativo) e HASMC con idrogeno genotossicità perossido-indotta (100 mM H 2 O 2) per 30 min ( controllo positivo). confronti a coppie con t-test hanno mostrato esimogli effetti della MBNC sulla vitalità cellulare erano significativamente differenti da quelli indotti con trattamento perossido di idrogeno su HASMC (p -value <0,001, ***).
Figura 1. aspetti macroscopici di nanocellulose batterica. Pellicole BNC sono stati ottenuti dopo un periodo di incubazione di 11 giorni, che sono circa. 3 mm di spessore. Il periodo di incubazione dipende dai requisiti per la destinazione d'uso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Fabbricazione di nanocellulose batterica magneticamente funzionalizzati. Ferro nanoparticelle di ossido vengono assemblate e io ncorporated in situ all'interno del BNC, ottenendo un MBNC. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagine SEM di BNC. Il BNC mostra una fitta rete e nastri non aggregati con dimensioni di 50 nm o meno. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. SEM immagine di BNC-IONP pellicola. Nanoparticelle di ossido di ferro (IONP) vengono preferenzialmente posizionati tra i nastri di interlacciamento.d / 52951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. AFM topografia MBNC e strutture domini magnetici. Topografia (A) Superficie delle MBNC mostrando macchie di nanoparticelle altamente confezionati, che stanno al di sopra della struttura di nanofibril. (B) i domini giallo e verde indicano due regioni di diversa magnetizzazione di campo magnetico ad alta e debole intensità, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Estensione del danno al DNA in HASMC dopo essere stato l'esposizionea BNC, e MBNC rispettivamente. PosCtl denota HASMC che ha subito un trattamento perossido di idrogeno ai fini comparativi. NegCtl denota HASMC la coltivazione in condizioni di coltura normali. Gli effetti negativi della viabilità MBNC su HASMC erano significativamente differenti da quelle osservate nel PosCtl (p-value <0.001, ***). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lo spessore e la dimensione della pellicola BNC possono essere facilmente manipolati variando il tempo di incubazione e la dimensione del pallone in cui è cresciuto durante la coltivazione statica. I microproprietà del BNC, quali la porosità, possono essere modificate cambiando il rapporto di ossigeno nella cultura statica. Le concentrazioni di ossigeno maggiore resa più difficile BNC 11. A. Bodin e collaboratori hanno prodotto tubi di BNC con una pressione di scoppio fino al 880 mm Hg modificando il rapporto ossigeno ossigeno atmosferico al 100% di ossigeno durante il processo di fermentazione di G. xylinus 12. Analogamente, la porosità del BNC può anche essere introdotto incorporando porogens quali microsfere di cera di paraffina nel processo di fermentazione. La porosità e pori interconnettività risultante in questo caso dipenderà dalla dimensione porogen 13.
La rete porosa del BNC permette loro di essere funzionalizzati con nanoparticelle, ad esempio, per la somministrazione di farmaciagenti. Nel nostro studio, abbiamo funzionalizzati BNC con IONP sintetizzando e in crescita in situ le nanoparticelle nella membrana BNC, al fine di attuare un protocollo magnetica per il reclutamento delle cellule rapida ed allegato nella ponteggi BNC-based. Test nanomeccaniche rivelano che risposta nanoscala di BNC comporta in modo simile con i vasi sanguigni 14 con un bassissimo modulo di Young, E BNC = 0,0025 GPa all'interno dei campioni di 0,04 GPa in superficie. I valori ottenuti sono nella gamma con quelli osservati da Fu et al. 15.
L'eccesso di IONP potrebbe essere facilmente rimosso dal BNC causa della elevata porosità del materiale. SEM fotografie hanno mostrato che le nanoparticelle sono distribuite principalmente negli spazi formati da fibrille intreccio e dispersi lungo i nastri. La concentrazione delle specie di ferro utilizzati in questo protocollo ha prodotto ad alta densità confezionato IONP, che ha riunito nastri del BNC. Ciò ha determinato unMBNC con pori più grandi di quelle della non modificato BNC. Olsson et al., Che ha usato diverse concentrazioni di FeSO 4 / CoCl 2 sali con la stessa frazione volumetrica BNC nella sintesi di aerogel cellulosa nanofibril, segnalato un simile aumento della porosità BNC quando hanno cambiato la frazione di volume della ferrite di cobalto ferromagnetico nanoparticelle da 0,7% a 5,7% 16. Questa elevata porosità nel MBNC può essere vantaggiosa per la deposizione di farmaci che aumentano il tempo di recupero e di evitare la restenosi a pareti arteriose danneggiate.
La mancanza di correlazione tra le caratteristiche topografiche e le immagini di fase magnetiche sono state anche descritto da B. Torre et al. 17, che ha sottolineato l'indipendenza tra la topografia ed i segnali magnetici del film di nanoparticelle sparse. Ulteriori studi di caratterizzazione devono essere condotti per determinare l'isteresi di magnetizzazione (MH) anse del MBNC tramite SQUID-VSM systeli.
Il MBNC mostrato basso potenziale di effetti tossici, secondo i risultati osservati nel Comet Assay, indicando che questo materiale è biocompatibile per l'uso a contatto con le cellule.
Le fasi più critiche del procedimento sono correlati alla quantità di idrossido di ammonio e la velocità a cui viene aggiunto, oltre a garantire la completa immersione e agitazione della BNC nella soluzione durante la reazione. Il primo aspetto determina la dimensione delle risultanti nanoparticelle di ossido di ferro, mentre la seconda influenza come le nanoparticelle vengono distribuiti della matrice BNC. Al fine di controllare meglio le dimensioni del MNPs, una buretta di rubinetto può essere utilizzato per regolare l'aggiunta facendo cadere idrossido di ammonio nella reazione. Piccoli pezzi di BNC che può essere completamente immersi nella soluzione si consiglia, ad esempio, le dimensioni di circa 1,9 cm 2 per un volume totale di 10 ml di soluzione. Un Limizione di questa tecnica è la distribuzione disomogenea della IONP all'interno della maglia BNC.
Questo protocollo descrive un metodo per incorporare nanoparticelle di ossido di ferro a BNC per formare un composito. A causa della biocompatibilità e le proprietà fisiche e meccaniche del BNC e le nanoparticelle di ossido di ferro, l'MBNC può essere utilizzato in una varietà di applicazioni biomediche come sistemi di somministrazione di farmaci e scaffold per la crescita cellulare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucoacetobacter xylinus | ATCC | 700178 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296-500G | |
| D-Mannitol Bioxtra | Sigma Aldrich | M9546-250G | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacteriological Peptone | Sigma Aldrich | P0556 | |
| Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water | Sigma Aldrich | 158127-100G | |
| Iron(III) Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489-100G | |
| Ammonium Hydroxide | Macron Fine Chemicals | 6665-46 | |
| Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 | Sigma Aldrich | 202398-250G | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | 44939-250G | |
| Disposable Petri dish | Sigma Aldrich | BR452000 | |
| Disposable Inoculating Loop | Fisher Scientific | 22-363-604 | |
| Anhydrous Calcium Sulfate | W.A. Hammond Drierite | 13001 | |
| High vacuum grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends | Sigma Aldrich | CAD7937-12EA | |
| pH test strips | Sigma Aldrich | P4786-100EA | |
| Round-bottom three neck angle type distilling flask | Sigma-Aldrich | CLS4965250 | |
| Silicone oil for oil baths | Sigma-Aldrich | 85409-250ML | |
| Drying Tube | Chemglass | CG-1295-01 | |
| Septum Stopper, Sleeve Type | Chemglass | CG-3022-98 | |
| Magnetic stir bar | Chemglass | CG-2001-05 | |
| Condenser | Chemglass | CG-1218-01 | |
| Temperature Controller | BriskHeat | SDC120JC-A | |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Comet Assay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| bio-AFM | JPK Instruments | NanoWizard 4a BioScience AFM | |
| Nanoindenter | Micro Materials Ltd | Multi-module mechanical tester | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Hitachi High Technologies America | Hitachi S-4800 |
References
- Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
- Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).
- Barud, H. S., et al.
- Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20, 1989 (1999).
- Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications. J. Magn. Magn. Mater. 380, 132 (2015).
- Torrisi, V., et al. Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles. Biomacromolecules. 15, 3171 (2014).
- Cai, Z., Kim, J. Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility. Cellulose. 17, 83 (2010).
- Wu, W., He, Q., Jiang, C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).
- Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s. Biomaterials. 35, 4848 (2014).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Scherner, M., et al. In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept. J. Surg. Res. 189, 340 (2014).
- Bodin, A., et al. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng. 97, 425 (2007).
- Zaborowska, M., et al. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 6, 2540 (2010).
- Karimi, A., et al. A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading. Artery Res. 8, 51 (2014).
- Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation. Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995 (2013).
- Olsson, R. T., et al. Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates. Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).
- Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).
