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Bioengineering

La fabricación de una funcionalizado magnética bacteriana NANOCELULOSA con nanopartículas de óxido de hierro

Published: May 26, 2016 doi: 10.3791/52951
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5,6, 1,2,3,7
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Nuclear, Plasma and Radiological Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Program of Study and Control of Tropical Diseases (PECET), University of Antioquia, 5Sealy Center for Vaccine Development, University of Texas Medical Branch, 6WHO Collaborating Center for Vaccine Research, Evaluation and Training on Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch, 7Beckman Institute, University of Illinois at Urbana-Champaign

Abstract

En este estudio, NANOCELULOSA bacteriana (BNC) producido por la bacteria Gluconacetobacter xylinus se sintetiza y se impregna in situ con nanopartículas de óxido de hierro (IONP) (Fe 3 O 4) para producir un NANOCELULOSA bacteriana magnética (MBNC). La síntesis de MBNC es un proceso de múltiples pasos preciso y diseñado específicamente. Brevemente, NANOCELULOSA bacteriana (BNC) unas películas se forman a partir G. conservado xylinus cepa de acuerdo con nuestras necesidades experimentales de tamaño y morfología. Una solución de hierro (III) hexahidrato de cloruro de (FeCl 3 · 6H 2 O) y de hierro (II) tetrahidrato de cloruro de (FeCl 2 · 4H 2 O) con una relación molar 2: 1 se prepara y se diluye en agua de alta pureza desoxigenada. Una película BNC se introduce entonces en el recipiente con los reactivos. Esta mezcla se agita y se calienta a 80 ° C en un baño de aceite de silicona y hidróxido de amonio (14%) se añade a continuación, dejando caer para precipitar elferroso iones en la malla BNC. Esta última etapa permite la formación de nanopartículas de magnetita situ (Fe 3 O 4) dentro de la malla NANOCELULOSA bacteriana para conferir propiedades magnéticas a BNC película. Un ensayo toxicológico se utilizó para evaluar la biocompatibilidad de la película BNC-IONP. El polietilenglicol (PEG) se utilizó para cubrir los IONPs el fin de mejorar su biocompatibilidad. microscopía electrónica de barrido (SEM), las imágenes mostraron que el IONP se encuentra preferentemente en la fibrilla entrelazado espacios de la matriz BNC, pero algunos de ellos también se han encontrado a lo largo de las cintas BNC. mediciones de microscopio de fuerza magnética realizadas en el MBNC detectaron los dominios magnéticos de presencia con el campo magnético de alta intensidad y débil, lo que confirma la naturaleza magnética de la película MBNC. los valores del módulo de Young obtenidos en este trabajo son también en un acuerdo razonable con los reportados por varios vasos sanguíneos en estudios previos.

Introduction

El NANOCELULOSA bacteriana (BNC) es sintetizada por la cepa de Acetobacter xylinum, también conocido como Gluconacetobacter xylinus, y se deposita en forma de películas o unas películas sobre la interfaz aire-líquido durante el cultivo estacionario. Estos unas películas BNC adoptan la forma del recipiente en el que se cultivan, y su grosor depende del número de días en cultivo. A. xylinus utiliza la glucosa en el medio para la síntesis de las microfibrillas de celulosa a través de un proceso de polimerización y la posterior cristalización. La polimerización de los residuos de glucosa se lleva a cabo en la membrana extracelular de bacterias donde las cadenas de glucano se extruyen de los poros individuales distribuidos en la envoltura celular. La cristalización de las microfibrillas de celulosa se ​​produce en el espacio extracelular con la formación de las hojas de la cadena de glucano por van der Waals seguido por el apilamiento de las hojas por H-1 de unión.

Imánnanopartículas integrado del IC a una matriz de BNC se pueden manipular fácilmente por un campo magnético externo a fin de aumentar la fuerza necesaria para dirigir y confinar las células musculares lisas (CML) que contiene nanopartículas magnéticas, en el sitio dañado de la pared arterial. Esta estrategia mantiene el SMCs lejos de otros tejidos, y mantiene las células en su lugar contra la fuerza ejercida por el flujo de sangre. Se ha demostrado que las SMC juegan un papel importante en el vasoelasticity del vaso sanguíneo, donde forman abundantes capas situadas principalmente en la túnica media 2.

El método utilizado para la síntesis de MBNC implica BNC película sumerge y agita en una solución de hierro (III) cloruro (II) hexahidrato de cloruro de hierro y tetrahidrato en 80 ° C. se añadió hidróxido de amonio para formar nanopartículas de óxido de hierro en el interior de la malla BNC. La adición de hidróxido de amonio cambia el color de la solución de naranja a negro. El compacto IONPs juntos a lo largo de la fibrilla BNCs con una distribución no uniforme.

Este protocolo se centra en el diseño de una película bacteriana NANOCELULOSA-magnética de nanopartículas, lo que hemos llamado NANOCELULOSA bacteriana magnética (MBNC), que está destinado para su uso como un sustituto de la falta, los vasos sanguíneos de pequeño diámetro dañados o lesionados. SA Barud y colaboradores han publicado recientemente un trabajo similar para producir un documento magnética flexible basado BNC-BNC mezclando unas películas en una dispersión acuosa estable de PEG y nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas 3. A continuación, describimos la producción de celulosa bacteriana y su impregnación in situ con nanopartículas magnéticas. Se utilizó un ensayo de citotoxicidad basado en la detección de roturas de cadena de ADN única para poner a prueba la biocompatibilidad de las unas películas BNC y MBNC.

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Protocol

1. Preparación de Bacterial NANOCELULOSA (BNC)

Nota: Todos los pasos se llevan a cabo en condiciones asépticas, a menos que se indique lo contrario.

  1. Preparar medio de cultivo.
    1. Preparar 500 ml de medio de cultivo líquido mediante la combinación de 25 g de extracto de levadura, 15 g de peptona, 125,0 g de manitol y 500 ml de agua de alta pureza. Esta mezcla en autoclave a 120 ° C durante 20 minutos y se almacena a 4 ° C.
    2. Preparar 100 ml de medios semisólidos mediante la adición de 15 g de agar a 5,0 g de extracto de levadura, 3,0 g de peptona, 25,0 g de manitol y 100 ml de agua de alta pureza. Autoclave esta mezcla a 120 ° C durante 20 min. Una vez tratado en autoclave, el depósito 5 ml de la mezcla en un 90 mm x 16 mm de plástico placa de Petri. Permitir que la solución de gel a 4 ° C y se almacena a esta temperatura hasta su uso posterior.
  2. Rehidratar G. xylinus cepa conservada en viales liofilizados mediante la adición de 1 ml de medio de cultivo líquido y pipeteando arriba yhacia abajo, como se indica por las instrucciones del fabricante.
  3. Inocular las placas de Petri que contienen medios semisólidos con pequeñas gotas de suspensión bacteriana usando un asa de inoculación. Asegúrese de que el inóculo cubre toda la placa de Petri moviendo el bucle en una dirección zag zig desde el borde hasta el centro del plato.
  4. Se incuban las placas de Petri a 26 ° C durante 72 horas en una incubadora sin CO 2. Una vez que el período de incubación es completa, pequeñas colonias blancas son visibles. Si no se utilizan de inmediato las colonias, almacenar las placas de Petri a 4 ° C mediante el sellado de la tapa con Parafilm y la colocación de los platos al revés. Las colonias se pueden almacenar de esta manera para un máximo de 6 meses.
  5. Transferencia de 2 ml del medio de cultivo líquido preparado en la etapa (1.1.1) en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Tomar dos colonias con una aguja de inoculación de las placas de Petri inoculadas en el paso (1.3) y colocarlos en el primer pocillo de la placa de cultivo de tejidos. REPEAT el mismo procedimiento para los 23 pozos restantes.
  6. Incubar la placa de cultivo de tejidos a 30 ° C durante 7 días. Esto dará lugar a un total de 24 BNC unas películas con diámetro de 16 mm y un espesor de aproximadamente 2-3 mm de diámetro como se muestra en la Figura 1.
    Nota: No perturbar el cultivo bacteriano en cualquier momento durante el período de incubación, por ejemplo agitando las placas. Durante el período de incubación, G. xylinus extruye moléculas de azúcar de glucopiranosa para formar una malla cristalina polimérico en la interfaz aire-líquido, que adopta la forma y el tamaño del matraz bajo condiciones de cultivo estáticas. Esta matriz polimérica, conocida como NANOCELULOSA bacteriana (BNC), es visible al final del periodo de incubación.
  7. Recoger las unas películas BNC de los medios de crecimiento y esterilizarlos en 200 ml de solución de NaOH al 1% durante 1 hora a 50 ° C, con el fin de eliminar todo rastro de G. xylinus. Opcionalmente, esta solución se agita a 300 rpm usando una barra magnéticay una placa de agitación. Descartar la solución de NaOH y añadir 200 ml de solución recién preparada 1% de NaOH. Repita el mismo proceso una vez más o hasta que las unas películas BNC en solución adquiere un aspecto translúcido.
  8. Enjuague las unas películas BNC con agua tres veces y almacenarlos en agua de alta pureza a TA. Asegúrese de que las unas películas BNC se sumergen completamente en el agua y no se les permite secar en cualquier momento.
  9. Autoclave las unas películas BNC a 121 ° C durante 20 min.
    Nota: Un estudio subcutáneo in vivo en la rata realizado por Märtson y compañeros de trabajo mostró signos de no degradación de la BNC después de 60 semanas de la implantación. De hecho, BNC es degradable en la naturaleza por las enzimas microbianas y fúngicas, que están ausentes en los mamíferos. Por otro lado, la biodegradabilidad del BNC puede ser el resultado de procesos biológicos que debilitan la red de microfibrillas in vivo 4 mecánicas, químicas, y.

2. Síntesis del polímero recubiertoLas nanopartículas de óxido de hierro y su deposición en una membrana bacteriana NANOCELULOSA

  1. Burbuja 1.000 ml de agua de alta pureza con gas nitrógeno con el fin de eliminar cualquier oxígeno disuelto en el agua y reemplazarlo con nitrógeno.
  2. Use un matraz de tres bocas de fondo redondo para preparar una solución en una proporción de 2: 1 molar de hierro (III) hexahidrato de cloruro de (FeCl 3 · 6H 2 O) y de hierro (II) tetrahidrato de cloruro de (FeCl 2 · 4H 2 O) diluido con el agua de alta pureza desoxigenada. Por ejemplo, utilizar 5,4 g de FeCl3 · 6H 2 O y 1,98 g de FeCl2 · 4H 2 O en 10 ml de agua de alta pureza desoxigenada. Si esta preparación se vuelve demasiado viscoso y difícil de agitar, utilizar 0,54 g de FeCl 3 · 6H 2 O y 0,198 g de FeCl 2 · 4H 2 O en 20 ml de agua de alta pureza desoxigenada.
    Nota: Reducir el tiempo de exposición del FeCl2 · 4H 2 O al aire pesando esta chcompuesto emical lo más rápido posible. Una vez introducido en el matraz de fondo redondo de tres bocas, cerrar el matraz de tres bocas de fondo redondo con tapones de tabique hasta que está conectado al suministro de gas nitrógeno y el tubo del condensador.
  3. Use dos cuellos del recipiente para proporcionar una entrada y salida de gas nitrógeno constante mediante la conexión de la alimentación de gas nitrógeno a una aguja perforada en un tapón septum y fijado a cuellos del buque.
  4. Coloque 1 BNC película que se preparó anteriormente en el paso 1.5 (15,6 mm de diámetro y 2 a 3 mm de espesor) en el recipiente con los reactivos. Asegúrese de que la muestra está completamente sumergido en el líquido.
  5. Conectar el cuello restante del buque a un tubo condensador. Además, utilizar un tubo de secado lleno con sulfato de calcio anhidro en la parte superior del tubo de condensador. Deje correr el agua a través del tubo del condensador.
  6. Sellar todas las juntas de vidrio con grasa de vacío.
  7. Calentar la solución en un baño de aceite de silicona a 80 ° C utilizando una agitaciónplaca de cocción y mantener esta temperatura hasta el paso 2.10. Use una pequeña barra de agitación magnética para mezclar los reactivos a 350 rpm durante 5 min. Asegúrese de que el BNC está impregnado adecuadamente con la solución ferrosa y los reactivos se disuelven por completo. Mantener la agitación de la mezcla hasta el final del experimento.
    Nota: Utilizar un termómetro para verificar la temperatura del aceite de silicona. Debe ser estable a 80 ° C.
  8. Aumentar la velocidad de agitación a 700 rpm y añadir (dejando caer), en un intervalo de tiempo de 5 min, 5 ml de hidróxido de amonio (NH 4 OH, 14%) a los 10 ml de solución ferrosa usando una aguja de pipeteado, que ha sido también perforado en un tapón de septo. Después de la adición del hidróxido de amonio, el color de la solución cambia de amarillo / naranja a negro.
  9. Continuar agitando la solución a 80 ° C durante otros 5 min. Evitar agitación de alta velocidad con el fin de mantener la integridad de la muestra. Las altas velocidades, es decir, superior a 1000 rpm, pueden destruirla muestra.
  10. Bajar la temperatura de la solución a 30 ° C utilizando la parte inferior control de la temperatura de la placa caliente de agitación y se mantiene la agitación durante otros 5 min. A continuación, apague el plato caliente. En este punto, la IONP se han incorporado en la malla BNC.
  11. Enfriar la mezcla hasta RT y se separan las nanopartículas magnéticas (MNP) y BNC utilizando un imán permanente fuerte (por ejemplo, 1 Tesla). Para ello, transferir la mezcla a un matraz de recipiente y luego, mientras se mantiene el imán cerca del recipiente, mantenga la MNPs y el BNC en su lugar mientras decantar el sobrenadante.
    Nota: Tenga cuidado al manipular los imanes fuertes, ya que pueden ser perjudiciales cuando se usan incorrectamente. Para ver los pasos (2.12) - (2.14) y (2.16) utilizan el agua de alta pureza desoxigenada preparada anteriormente en (2.1) para evitar que las partículas de la oxidación.
  12. Resuspender el micronutrientes en polvo y BNC en 100 ml de agua. Agite suavemente la solución para eliminar todos los micronutrientes en polvo que no están firmemente incorporados en el BNC. Decantar los supernatant de nuevo mediante la celebración de la NPM y el BNC en su lugar con el imán.
  13. Lavar la NPM y las BNC varias veces con agua hasta que el sobrenadante alcanza pH neutro (pH ~ 7), como se mide usando una tira colorimétrica.
  14. Se separa la NANOCELULOSA bacteriana magnético funcionalizado BNC o magnético (MBNC) de la NPM con unas pinzas y enjuague el MBNC varias veces con agua hasta que el agua salga clara.
  15. Esterilizar el MBNC exponiendo el MBNC O / N a los rayos UV (110-280 nm).
  16. Autoclave de 500 ml de agua de alta pureza desoxigenada a 120 ° C durante 20 minutos y almacenan el MBNC en 20 ml de esta agua.
  17. Asépticamente, sumergir la muestra en el 1% de PEG y se agita durante 2 horas a temperatura ambiente (37 ° C). Este procedimiento mejora la biocompatibilidad y la estabilidad de las nanopartículas de óxido de hierro depositados en el BNC, específicamente aquellos expuestos en la superficie 5-7. El recubrimiento de PEG se distribuye en la red MBNC 3D.
    Nota: Desnudo IONP se oxida fácilmente en el airedebido a su alta actividad química 8. A pesar de que PEG se considera un material no biodegradable, su estabilidad química depende de las condiciones biológicas aplicadas, tales como contenido de agua, pH, temperatura, presencia de enzimas, las especies reactivas de oxígeno, especies reactivas de nitrógeno, y otros 9.

3. Caracterización del BNC y MBNC unas películas

  1. Propiedades mecánicas
    1. Realizar la carga normal y prueba de descarga de nanoindentación utilizando un indentador Berkovich. El radio de Berkovich indentador de diamante es de 20 nm.
    2. Utilice sílice fundida y tungsteno para calibrar área de contacto en función de la profundidad de indentación a TA. Durante la prueba, las muestras de montar sobre la ranura utilizando pegamento. El penetrador se acercó a las muestras en su dirección de espesor.
    3. Seleccionar al azar lugares de sangría en las superficies de las muestras. Evitar que el espacio entre los 2 guiones entre 200-300 mm.
    4. Se aplica la carga a lamuestras de los pasos y registrar el correspondiente desplazamiento del penetrador. Analizar la trama de carga vs profundidad para encontrar el módulo de Young.
    5. Llevar a cabo la prueba de nanoindentación de las muestras en presencia de agua desionizada (agua DI), y la prueba mediante la aplicación de tasas de carga entre 0,0001 mN / seg y 0,005 mN / seg, con picos de carga entre 0,01 y 0,60 mN mN.
    6. Utilice una celda líquida y mantener las muestras en el entorno de líquidos. Esta configuración única para la caracterización nanomecánica inmerso en un ambiente fluido es ideal para simular efectivamente el alcance funcionalidad biomecánica de las membranas BNC y MBNC.
  2. Caracterización estructural por SEM
    1. Caracterizar la estructura de fibra NANOCELULOSA por microscopía electrónica de barrido (SEM).
    2. Liofilizar las muestras durante 24 horas a -80 ° C. A continuación, montar en los espárragos SEM, por pulverización catódica con una película de Au-Pd durante 10 segundos y analizar el uso de SEM.
    3. Toma de imágenes con una ampliación de 22,000Xy 60,000X, con un voltaje de aceleración de 5 kV.
  3. dominios magnéticos
    1. Permitir las unas películas MBNC a completamente seco a temperatura ambiente, y posteriormente exponer durante 5 min a un imán permanente (1 Tesla).
    2. Inmediatamente, llevar a cabo las mediciones de fuerza magnética utilizando un bio-AFM de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    3. Para cada medición, la captura en primer lugar las características topográficas y adquirir los dominios magnéticos durante una segunda pasada. Obtener ambas mediciones con el bio-AFM en modo de no contacto.
    4. Caracterización magnética de las nanopartículas se lleva a cabo utilizando vibración magnetómetro de muestra (VSM) en el sistema de mediciones de las propiedades físicas (PPMS) de Diseño Quantum, a temperatura ambiente (300 K), con un campo magnético en el intervalo de -10 000 a 10.000 Oe.
  4. citocompatibilidad
    1. Semillas humano las células del músculo liso de aorta (HASMC) en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos a una densidad de 1.0x10 cm2 y se incuba durante 24 horas en presencia de las muestras de ensayo: unas películas BNC y MBNC (cada uno con un 15,6 mm de diámetro).
    2. Utilice poblaciones de células tratadas con peróxido de hidrógeno no tratados y como controles negativos y positivos, respectivamente.
    3. Realizar el ensayo de cometa de acuerdo con los protocolos del fabricante y las directrices sugeridas por A. Azqueta y AR 10 Collins.
    4. Utilice el colorante ácido nucleico SYBR Gold en este ensayo para intercalar y la etiqueta de fluorescencia del ADN contenido en las muestras a electroforesis según el protocolo del fabricante.
      Nota: Las células que no se someten a ningún daño en el ADN en presencia de muestras BNC y MBNC, mostrará un nucleoide redondo de color verde fluorescente, mientras que las células dañadas de ADN tendrán cometas de largo - muestras positivas tendrán Nucleoides (la cabeza del cometa) seguido de colas que contienen material de ADN fragmentado (porcentaje de ADN en la cola).

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Representative Results

El período de incubación de G. xylinus era un total de 9 días, pero las unas películas comenzó a formarse antes y eran evidentes después de 2 días. La apariencia macroscópica de la BNC se muestra en la Figura 1, la forma de que imita la de la cultura plato de cosecha. Figura 2 describe el procedimiento para producir unas películas BNC-IONP, que resume las principales etapas implicadas en el protocolo anterior así como la configuración de los componentes principales.

Imágenes de SEM fueron utilizados para resolver la microestructura, la morfología y la distribución espacial de las fibras de BNC (Figura 3) y la distribución IONP en funcionalizado BNC (Figura 4). El BNC está formado por cintas finas (aproximadamente 50 nm de diámetro) que forman poros abiertos en toda la red sin un patrón definido. El IONP son preferentemente locado entre los poros formados por el entrelazado de fibrillas, formando racimos de 100 nm o más en tamaño. IONP individuo también están obligados a lo largo de las cintas. El MBNC exhibe una estructura fibrilar menos compactada en comparación con el BNC, probablemente porque IONP reunir cintas del BNC. Microscopio de fuerza magnética se utilizó para reconstruir el perfil magnético en la topografía de la MBNC (Figura 5 A, B). Los poros grandes de 500 nm de diámetro o más grande se forman en la MBNC, que no se observaron en BNC sin tratar (Figura 5A). Esto está de acuerdo con las observaciones en las microfotografías SEM, donde el MBNC muestra una estructura más porosa que la no modificada BNC. Un gradiente de fuerza magnética con dos dominios diferentes de la magnetización se detectó en toda la superficie MBNC (Figura 5B), cuyo contraste no se correlaciona con las colinas y valles formados por regiones ricas en IONP en el MBNC imágenes topográficas (Figura 5A). Alta y débil intecampos magnéticos nsity se denotan como el amarillo y el verde en la figura 5B, respectivamente. El ciclo de histéresis de las nanopartículas, que se mide incrustadas en el NANOCELULOSA bacteriana, se muestra en la Figura 5 proporciona evidencia de que todos los IONPs eran superparamagnéticas a TA, sin histéresis.

HASMC se cultivaron en presencia de BNC y de MBNC para la prueba de cualquier efecto perjudicial sobre la viabilidad de las células individuales como resultado de la exposición a estos materiales extraños. La extensión del daño en las células individuales se cuantificó mediante la detección de roturas de cadena de ADN (Figura 6). Los resultados se compararon con HASMC crecer bajo condiciones de cultivo normales de 37 ° C,% de aire 95, y 5% de CO 2 (control negativo) y a HASMC con hidrógeno genotoxicidad peróxido inducida (100 mM H 2 O 2) durante 30 min ( control positivo). comparaciones pareadas utilizando la prueba t mostraron THa los efectos de la MBNC sobre la viabilidad celular fueron significativamente diferentes de los inducidos con el tratamiento de peróxido de hidrógeno en HASMC (valor de p <0,001, ***).

Figura 1
Figura 1. aspectos macroscópicos de NANOCELULOSA bacteriana. Unas películas BNC se han obtenido después de un período de incubación de 11 días, que son aprox. 3 mm de espesor. El período de incubación depende de los requisitos para el uso previsto. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. La fabricación de NANOCELULOSA bacteriana magnéticamente funcionalizado. Nanopartículas de óxido de hierro se ensamblan y yo ncorporated in situ dentro del BNC, produciendo un MBNC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Imagen de SEM de BNC. El BNC muestra una fina red y cintas no agregados con tamaños de 50 nm o menos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Imagen SEM de BNC-IONP película. Nanopartículas de óxido de hierro (IONP) están situadas preferentemente entre las cintas de entrelazado.d / 52951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. AFM topografía de MBNC y estructuras de dominios magnéticos. Topografía (A) de la superficie del MBNC que muestra manchas de nanopartículas altamente empaquetadas, que están por encima de la estructura de nanofibrillas. (B) dominios amarillos y verdes denotan dos regiones de diferente magnetización del campo magnético de alta intensidad y débil, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Extensión del daño en el ADN en HASMC después de haber sido la exposicióna BNC, y MBNC respectivamente. PosCtl denota HASMC que se sometió a tratamiento con peróxido de hidrógeno con fines comparativos. NegCtl denota HASMC el cultivo en condiciones normales de cultivo. Los efectos perjudiciales de la viabilidad MBNC en HASMC fueron significativamente diferentes de los observados en el PosCtl (valor de p <0,001, ***). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El espesor y el tamaño de la película BNC pueden ser fácilmente manipulados por cambiar el tiempo de incubación y el tamaño del matraz en el que se cultiva durante el cultivo estático. Los micropropiedades del BNC, tales como la porosidad, se pueden modificar cambiando la proporción de oxígeno en el cultivo estático. Las concentraciones más altas de oxígeno producen más dura BNC 11. A. Bodin y compañeros de trabajo producen tubos de BNC con una presión de rotura de hasta 880 mm Hg cambiando la proporción de oxígeno del oxígeno atmosférico a 100% de oxígeno durante el proceso de fermentación de G. xylinus 12. Del mismo modo, la porosidad de la BNC también puede ser introducido mediante la incorporación de porógenos tales como microesferas de cera de parafina en el proceso de fermentación. La porosidad y la interconectividad de los poros que resulta en este caso dependerá del tamaño porógeno 13.

La red porosa de la BNC les permite ser funcionalizados con nanopartículas, por ejemplo, para la administración de fármacosagentes. En nuestro estudio, hemos funcionalizado con BNC IONP sintetizando y creciente in situ las nanopartículas en la membrana BNC, con el fin de implementar un protocolo magnética para el reclutamiento rápido de las células y la unión de los andamios a base de BNC. Pruebas nanomecánicos revelan que la respuesta a nanoescala de BNC comporta de manera similar con los vasos sanguíneos 14 con un módulo muy bajo de Young, E BNC = 0,0025 GPa dentro de las muestras a 0,04 GPa en la superficie. Los valores obtenidos están en el rango con las observadas por Fu et al. 15.

El exceso de IONP podría ser fácilmente retirado de la BNC debido a la alta porosidad del material. Fotografías SEM mostraron que las nanopartículas se distribuyen principalmente en los espacios formados por entrelazado de fibrillas y dispersos a lo largo de las cintas. La concentración de las especies de hierro utilizados en este protocolo cedido alta densidad de empaquetado IONP, que reunió a las cintas del BNC. Esto resultó en unaMBNC con poros más grandes que los de la no modificada BNC. Olsson et al., Que utiliza diferentes concentraciones de FeSO 4 / CoCl 2 sales con la misma fracción de volumen de BNC en la síntesis de los aerogeles de nanofibrillas de celulosa, informaron de un aumento similar en la porosidad BNC cuando cambiaron la fracción de volumen de la ferrita de cobalto ferromagnético nanopartículas de 0,7% a 5,7% 16. Esta alta porosidad en el MBNC puede ser ventajoso para la deposición de fármacos que aumentan el tiempo de recuperación y evitar la reestenosis en las paredes arteriales dañados.

La falta de correlación entre las características topográficas y las imágenes de fase magnéticas también se han descrito por B. Torre et al. 17, que señaló la independencia entre la topografía y las señales magnéticas de películas de nanopartículas dispersas. Otros estudios de caracterización deben llevarse a cabo para determinar la histéresis de magnetización (MH) bucles de la vía MBNC SQUID VSM-sytallos.

El MBNC mostró un bajo potencial de efectos tóxicos, de acuerdo con los resultados observados en el ensayo cometa, lo que indica que este material es biocompatible para usar en contacto con las células.

Los pasos más críticos en el procedimiento están relacionados con la cantidad de hidróxido de amonio y la velocidad a la que se añade, además de asegurar la completa inmersión y agitación de la BNC en la solución durante la reacción. El primer aspecto determina el tamaño de las nanopartículas de óxido de hierro resultantes, mientras que el segundo influenciar las nanopartículas se distribuyen a través de la matriz de BNC. Con el fin de controlar mejor el tamaño de la MNPs, una bureta con una llave de paso se puede utilizar para regular la adición dejando caer hidróxido de amonio en la reacción. Se aconseja a los pequeños trozos de BNC que puede ser completamente sumergido en la solución, por ejemplo, tamaños de aproximadamente 1,9 cm 2 para un volumen total de 10 ml de solución. una Limitación de esta técnica es la distribución no homogénea de la IONP dentro de la malla de BNC.

Este protocolo describe un método para incorporar nanopartículas de óxido de hierro en BNC para formar un compuesto. Debido a la biocompatibilidad y las propiedades físicas y mecánicas de tanto el BNC y las nanopartículas de óxido de hierro, el MBNC se puede utilizar en una variedad de aplicaciones biomédicas, tales como sistemas de administración de fármacos y andamios para el crecimiento celular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucoacetobacter xylinus ATCC 700178
Agar Sigma Aldrich A1296-500G 
D-Mannitol Bioxtra Sigma Aldrich M9546-250G 
Yeast Extract BD Biosciences 212750
Bacteriological Peptone Sigma Aldrich P0556
Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water Sigma Aldrich 158127-100G
Iron(III) Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich 236489-100G 
Ammonium Hydroxide  Macron Fine Chemicals 6665-46
Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 Sigma Aldrich 202398-250G 
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma Aldrich 44939-250G
Disposable Petri dish Sigma Aldrich BR452000
Disposable Inoculating Loop Fisher Scientific 22-363-604 
Anhydrous Calcium Sulfate W.A. Hammond Drierite  13001
High vacuum grease Sigma Aldrich Z273554-1EA
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends Sigma Aldrich CAD7937-12EA
pH test strips   Sigma Aldrich P4786-100EA
Round-bottom three neck angle type distilling flask Sigma-Aldrich CLS4965250
Silicone oil for oil baths Sigma-Aldrich 85409-250ML 
Drying Tube Chemglass CG-1295-01
Septum Stopper, Sleeve Type Chemglass CG-3022-98
Magnetic stir bar Chemglass CG-2001-05
Condenser Chemglass CG-1218-01
Temperature Controller BriskHeat SDC120JC-A
Stirring Hotplate Fisher Scientific 11-100-49SH 
Comet Assay Kit Trevigen 4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies S-11494
bio-AFM JPK Instruments NanoWizard 4a BioScience AFM
Nanoindenter Micro Materials Ltd Multi-module mechanical tester 
Scanning electron microscopy (SEM) Hitachi High Technologies America Hitachi S-4800

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References

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Bioingeniería No. 111, La celulosa bacteriana las nanopartículas de óxido de hierro de los vasos sanguíneos biomaterial
La fabricación de una funcionalizado magnética bacteriana NANOCELULOSA con nanopartículas de óxido de hierro
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Arias, S. L., Shetty, A. R., Senpan, … More

Arias, S. L., Shetty, A. R., Senpan, A., Echeverry-Rendón, M., Reece, L. M., Allain, J. P. Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (111), e52951, doi:10.3791/52951 (2016).

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