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Bioengineering

आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के साथ एक Functionalized चुंबकीय बैक्टीरियल Nanocellulose का निर्माण

Published: May 26, 2016 doi: 10.3791/52951
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5,6, 1,2,3,7
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Nuclear, Plasma and Radiological Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Program of Study and Control of Tropical Diseases (PECET), University of Antioquia, 5Sealy Center for Vaccine Development, University of Texas Medical Branch, 6WHO Collaborating Center for Vaccine Research, Evaluation and Training on Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch, 7Beckman Institute, University of Illinois at Urbana-Champaign

Abstract

इस अध्ययन में, बैक्टीरियल Nanocellulose (bnc) बैक्टीरिया Gluconacetobacter xylinus द्वारा उत्पादित संश्लेषित और लोहे के आक्साइड नैनोकणों (IONP) (फे 3 हे 4) के साथ बगल में गर्भवती एक चुंबकीय बैक्टीरिया का Nanocellulose (MBNC) उपज के लिए किया जाता है। MBNC के संश्लेषण के लिए एक सटीक और विशेष रूप से डिजाइन बहु कदम प्रक्रिया है। संक्षेप में, बैक्टीरियल Nanocellulose (bnc) pellicles संरक्षित जी से बनते हैं xylinus तनाव आकार और आकृति विज्ञान की हमारी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार। लोहे (तृतीय) क्लोराइड hexahydrate (FeCl 3 · 6H 2 ओ) और लौह (द्वितीय) क्लोराइड tetrahydrate (FeCl 2 · 4H 2 ओ) एक 2 के साथ का एक समाधान: 1 दाढ़ अनुपात तैयार किया है और ऑक्सीजन रहित उच्च शुद्धता पानी में पतला है। एक पतली झिल्ली BNC तो अभिकारकों के साथ पोत में पेश किया है। इस मिश्रण हड़कंप मच गया और वेग को छोड़ने के द्वारा एक सिलिकॉन तेल स्नान और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (14%) में 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया तो कहा जाता हैलौह BNC जाल में आयनों। यह अंतिम कदम सीटू मैग्नेटाइट नैनोकणों (फे 3 हे 4) जीवाणु Nanocellulose जाल के अंदर में बनाने की अनुमति देता है BNC पतली झिल्ली के लिए चुंबकीय गुण प्रदान करने के लिए। एक विषाक्तता परख BNC-IONP पतली झिल्ली के biocompatibility मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) उनके biocompatibility में सुधार करने के क्रम में IONPs कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) छवियों से पता चला कि IONP तंतु BNC मैट्रिक्स के रिक्त स्थान interlacing में रियायत के तौर पर स्थित थे, लेकिन उनमें से कुछ भी BNC रिबन के साथ पाए गए। चुंबकीय बल सूक्ष्मदर्शी MBNC पर प्रदर्शन माप उच्च और कमजोर तीव्रता चुंबकीय क्षेत्र के साथ उपस्थिति चुंबकीय डोमेन का पता चला, MBNC पतली झिल्ली के चुंबकीय प्रकृति की पुष्टि। यंग मापांक इस काम में प्राप्त मूल्यों पिछले अध्ययनों में कई रक्त वाहिकाओं के लिए रिपोर्ट उन लोगों के साथ एक उचित समझौते में भी कर रहे हैं।

Introduction

Bacterian Nanocellulose (bnc) एसीटोबैक्टर xylinum तनाव, भी Gluconacetobacter xylinus के रूप में जाना द्वारा संश्लेषित, और स्थिर संस्कृति के दौरान फिल्मों या हवा तरल इंटरफेस पर pellicles के रूप में जमा है। ये BNC pellicles कंटेनर, जहां वे बड़े हो रहे हैं के रूप अपनाने और उनकी मोटाई संस्कृति में दिनों की संख्या पर निर्भर करता है। ए xylinus polymerization और बाद के क्रिस्टलीकरण की एक प्रक्रिया के माध्यम से सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के संश्लेषण के लिए माध्यम में ग्लूकोज का उपयोग करता है। ग्लूकोज अवशेषों के polymerization बैक्टीरियल बाह्य झिल्ली जहां Glucan चेन सेल लिफाफा पर वितरित एकल pores से चली जाती हैं पर किया जाता है। सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के क्रिस्टलीकरण वान डर वाल्स संबंध द्वारा Glucan श्रृंखला चादरों के गठन एच-1 संबंध द्वारा चादरों की स्टैकिंग द्वारा पीछा के साथ बाह्य अंतरिक्ष में होता है।

चुंबकएक BNC मैट्रिक्स के लिए एकीकृत आईसी नैनोकणों आदेश धमनियों की दीवार के क्षतिग्रस्त स्थल पर बल प्रत्यक्ष और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को सीमित करने के लिए आवश्यक (एसएमसी) चुंबकीय नैनोकणों युक्त, को बढ़ाने के लिए एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र द्वारा आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है। इस रणनीति के अन्य ऊतकों से एसएमसी को दूर रखता है, और बल रक्त प्रवाह द्वारा लगाए गए खिलाफ जगह में कोशिकाओं रखती है। यह दिखाया गया है कि एसएमसी रक्त वाहिका, जहां वे प्रचुर मात्रा में Tunica मीडिया 2 में मुख्य रूप से स्थित परतों रूप से vasoelasticity में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

MBNC के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया विधि BNC पतली झिल्ली डूबे और 80 डिग्री सेल्सियस पर लोहे (तृतीय) क्लोराइड hexahydrate और आयरन (II) क्लोराइड tetrahydrate की एक समाधान में हड़कंप मच शामिल है। अमोनियम हाइड्रॉक्साइड BNC जाल के अंदर लोहे के आक्साइड नैनोकणों फार्म में जोड़ा जाता है। अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के अलावा काला करने के लिए नारंगी से समाधान का रंग बदलता है। एक साथ BNC तंतु साथ IONPs कॉम्पैक्टएक गैर वर्दी वितरण के साथ है।

इस प्रोटोकॉल एक जीवाणु Nanocellulose-चुंबकीय nanoparticle पतली झिल्ली, जो हम चुंबकीय बैक्टीरिया का Nanocellulose (MBNC) का नाम है, जो लापता, क्षतिग्रस्त या घायल छोटे व्यास रक्त वाहिकाओं के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोग करने का इरादा है के डिजाइन पर केंद्रित है। एचएस Barud और सहकर्मियों ने हाल ही में एक समान काम खूंटी और superparamagnetic लोहे के आक्साइड नैनोकणों 3 के एक स्थिर जलीय फैलाव में BNC pellicles के मिश्रण से एक BNC आधारित लचीला चुंबकीय कागज का उत्पादन करने के लिए प्रकाशित किया है। यहाँ, हम बैक्टीरियल सेलुलोज के उत्पादन और चुंबकीय नैनोकणों के साथ बगल में अपनी संसेचन का वर्णन है। एक cytotoxicity एकल डीएनए किनारा टूट जाता है का पता लगाने के आधार पर परख BNC और MBNC pellicles के biocompatibility परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

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Protocol

1. बैक्टीरियल Nanocellulose की तैयारी (bnc)

नोट: चरणों के सभी, सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत किया जाता है जब तक अन्यथा इंगित।

  1. संस्कृति के माध्यम से तैयार करें।
    1. खमीर निकालने की 25 ग्राम, 15 ग्राम peptone, mannitol का 125.0 ग्राम, और उच्च शुद्धता पानी की 500 मिलीलीटर के संयोजन से तरल संस्कृति के माध्यम से 500 मिलीलीटर की तैयारी। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए और दुकान के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर इस मिश्रण आटोक्लेव।
    2. खमीर निकालने के 5.0 ग्राम, peptone की 3.0 ग्राम, mannitol के 25.0 ग्राम, और उच्च शुद्धता पानी की 100 मिलीलीटर के लिए अगर की 15 ग्राम जोड़कर semisolid मीडिया की 100 मिलीलीटर की तैयारी। 20 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर इस मिश्रण आटोक्लेव। एक बार जब autoclaved, एक 90 मिमी x 16 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में जमा मिश्रण के 5 मिलीलीटर। आगे उपयोग करें जब तक इस तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस पर जेल का हल और दुकान की अनुमति दें।
  2. Rehydrate जी xylinus तनाव तरल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ने और ऊपर pipetting द्वारा फ्रीज सूखे शीशियों में संरक्षित औरनीचे, के रूप में निर्माता के निर्देशों ने संकेत दिया।
  3. जीवाणु निलंबन की छोटी बूंदों एक inoculating पाश का उपयोग कर के साथ semisolid मीडिया वाले पेट्री डिश टीका लगाना। सुनिश्चित करें कि inoculum डिश के केंद्र के किनारे से एक Zig Zag दिशा में पाश ले जाकर पूरे पेट्री डिश शामिल किया गया।
  4. पेट्री डिश सीओ 2 के बिना एक मशीन में 72 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक बार जब ऊष्मायन अवधि पूरी हो चुकी है, छोटे सफेद कालोनियों दिखाई दे रहे हैं। कालोनियों तुरंत इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, तो Parafilm के साथ ढक्कन सील और व्यंजन उल्टा रखने से 4 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश की दुकान। कालोनियों अप करने के लिए 6 महीने के लिए उस रास्ते में संग्रहित किया जा सकता है।
  5. स्थानांतरण 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में कदम (1.1.1) में तैयार तरल संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर। कदम में टीका पेट्री डिश से एक inoculating सुई (1.3) के साथ दो कालोनियों ले लो और उन्हें टिशू कल्चर प्लेट के पहले अच्छी तरह से में जगह है। आरशेष 23 कुओं के लिए एक ही प्रक्रिया EPEAT।
  6. 7 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर टिशू कल्चर प्लेट सेते हैं। यह चित्र 1 में दर्शाया 16 मिमी व्यास और लगभग 2-3 मिमी व्यास की मोटाई के साथ 24 BNC pellicles की कुल निकलेगा।
    नोट: प्लेटों झटकों से ऊष्मायन अवधि के दौरान किसी भी बिंदु पर जीवाणु संस्कृति को परेशान मत करो, उदाहरण के लिए। ऊष्मायन अवधि, जी दौरान xylinus हवा तरल इंटरफेस है, जो आकार और कुप्पी के आकार स्थिर खेती की शर्तों के तहत गोद ले में एक polymeric क्रिस्टलीय जाल के लिए फार्म glucopyranose चीनी अणुओं extrudes। इस बहुलक मैट्रिक्स, बैक्टीरियल Nanocellulose (bnc) के रूप में जाना जाता है, ऊष्मायन अवधि के अंत में विशिष्ट है।
  7. विकास मीडिया से BNC pellicles लीजिए और 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 1% NaOH के समाधान के 200 मिलीलीटर में उन्हें बाँझ, जी के सभी निशान हटाने के लिए आदेश में xylinus। वैकल्पिक रूप से, एक चुंबकीय पट्टी का उपयोग कर 300 rpm पर इस समाधान हलचलऔर एक भावप्रवण प्लेट। NaOH समाधान त्यागें और हौसले से तैयार 1% NaOH के समाधान के 200 मिलीलीटर जोड़ें। एक बार में एक ही प्रक्रिया को दोहराएं या समाधान में BNC pellicles जब तक एक पारदर्शी उपस्थिति प्राप्त कर लेता है।
  8. तीन बार पानी के साथ BNC pellicles कुल्ला और आरटी पर उच्च शुद्धता पानी में उन्हें दुकान। यकीन BNC pellicles पूरी तरह से पानी में डूबे हुए हैं और किसी भी समय सूखे की अनुमति नहीं कर रहे हैं।
  9. 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर BNC pellicles आटोक्लेव।
    नोट: एक Vivo में चूहा Märtson और सहकर्मियों द्वारा किया जाता में चमड़े के नीचे अध्ययन के बाद 60 सप्ताह आरोपण BNC के गैर गिरावट लक्षण दिखाई। दरअसल, BNC माइक्रोबियल और कवक एंजाइमों, जो स्तनधारियों में अनुपस्थित रहे द्वारा प्रकृति में सड़ सकने है। दूसरी ओर, BNC के biodegradability यांत्रिक, रासायनिक और जैविक प्रक्रियाओं है कि इन विवो 4 में सूक्ष्मतंतु नेटवर्क को कमजोर करने का परिणाम हो सकता है।

2. के संश्लेषण पॉलिमर-लेपितआयरन ऑक्साइड नैनोकणों और एक जीवाणु Nanocellulose झिल्ली में इसका बयान

  1. बुलबुला पानी में किसी भी भंग ऑक्सीजन को हटाने और नाइट्रोजन के साथ इसे बदलने के लिए आदेश में नाइट्रोजन गैस के साथ उच्च शुद्धता पानी के 1000 मिलीलीटर।
  2. एक 2 में एक समाधान तैयार करने के लिए एक तीन गर्दन दौर नीचे कुप्पी का प्रयोग करें: आयरन (तृतीय) क्लोराइड hexahydrate (FeCl 3 · 6H 2 ओ) और लौह (द्वितीय) क्लोराइड tetrahydrate के 1 दाढ़ अनुपात (FeCl 2 · 4H 2 ओ) पतला ऑक्सीजन रहित उच्च शुद्धता पानी के साथ। उदाहरण के लिए, FeCl 3 का 5.4 जी · का उपयोग 6H 2 हे और ऑक्सीजन रहित उच्च शुद्धता पानी की 10 मिलीलीटर में FeCl 2 · 4H 2 ओ के 1.98 छ। इस तैयारी भी चिपचिपा और मुश्किल हलचल करने के लिए बदल जाता है, ऑक्सीजन रहित उच्च शुद्धता पानी की 20 मिलीलीटर में FeCl 3 के 0.54 छ · 6H 2 हे और 0.198 FeCl 2 जी · 4H 2 ओ का उपयोग करें।
    नोट: इस चर्चा के वजन से 2 ओ हवा के लिए FeCl 2 · 4H के समय जोखिम को कमemical यौगिक जितनी जल्दी हो सके। एक बार तीन गर्दन दौर नीचे फ्लास्क में पेश किया, तीन गर्दन पट stoppers के साथ दौर नीचे कुप्पी बंद जब तक यह नाइट्रोजन गैस की आपूर्ति और कंडेनसर ट्यूब से जुड़ा है।
  3. एक सुई एक पट डाट में मुक्का मारा और इस पोत की गर्दन को तय करने के लिए नाइट्रोजन गैस की आपूर्ति को जोड़ने से एक निरंतर प्रवेश द्वार और नाइट्रोजन गैस के उत्पादन प्रदान करने के लिए पोत के दो गर्दन का प्रयोग करें।
  4. जगह 1 BNC पतली झिल्ली जो (व्यास की 15.6 मिमी और मोटाई के 2-3 मिमी) अभिकारकों के साथ पोत में पहले से 1.5 चरण में तैयार किया गया था। यकीन नमूना पूरी तरह से तरल में डूबे हुए है बनाओ।
  5. एक कंडेनसर ट्यूब के लिए पोत के शेष गर्दन कनेक्ट करें। इसके अतिरिक्त, कंडेनसर ट्यूब के शीर्ष पर निर्जल कैल्शियम सल्फेट के साथ भरा एक सुखाने ट्यूब का उपयोग करें। कंडेनसर ट्यूब के माध्यम से पानी चलाने के।
  6. वैक्यूम तेल के साथ कांच जोड़ों के सभी सील।
  7. एक भावप्रवण का उपयोग कर 80 डिग्री सेल्सियस के लिए एक सिलिकॉन तेल स्नान में समाधान हीटhotplate और 2.10 कदम जब तक इस तापमान पकड़ो। 5 मिनट के लिए 350 rpm पर अभिकारकों मिश्रण करने के लिए एक छोटे चुंबकीय हलचल पट्टी का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि BNC उचित रूप से लौह समाधान के साथ गर्भवती है और अभिकारकों पूरी तरह से भंग कर रहे हैं। प्रयोग के अंत तक मिश्रण सरगर्मी रखें।
    नोट: सिलिकॉन तेल के तापमान को सत्यापित करने के लिए एक थर्मामीटर का उपयोग। यह 80 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थिर होना चाहिए।
  8. एक pipetting सुई है, जो किया गया है का उपयोग कर (एनएच 4 ओह, 14%) 5 मिनट, अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 5 मिलीलीटर की एक समय अंतराल लौह समाधान के 10 मिलीलीटर में 700 rpm के लिए सरगर्मी वेग में वृद्धि और (छोड़ने के द्वारा) जोड़ने के लिए, यह भी एक पट डाट में मुक्का मारा। अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के अलावा के बाद, समाधान का रंग काला करने के लिए पीला / नारंगी से बदलता है।
  9. एक और 5 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर समाधान सरगर्मी जारी है। आदेश नमूना की अखंडता को बनाए रखने के लिए उच्च गति हलचल से बचें। उच्च गति, यानी, अधिक से अधिक 1000 rpm, नष्ट कर सकते हैंनमूना।
  10. 30 डिग्री सेल्सियस के समाधान का तापमान कम सरगर्मी hotplate के तापमान नियंत्रण नीचे का उपयोग और एक और 5 मिनट के लिए सरगर्मी रखने के लिए। फिर, गर्म थाली से दूर हो जाते हैं। इस बिंदु पर, IONP BNC जाल में शामिल किया गया है।
  11. आर टी करने के लिए नीचे मिश्रण ठंडा और अलग चुंबकीय नैनोकणों (एमएनपी) और BNC एक मजबूत स्थायी चुंबक (जैसे, 1 टेस्ला) का उपयोग। ऐसा करने के लिए, एक पोत फ्लास्क मिश्रण हस्तांतरण और फिर, जबकि चुंबक पोत के करीब रखने के लिए जगह में MNPS और BNC पकड़ जबकि सतह पर तैरनेवाला decanting।
    नोट: जब मजबूत मैग्नेट से निपटने के बाद से वे हानिकारक जब गलत तरीके से इस्तेमाल हो सकता है सावधान रहें। कदम (2.12) के लिए - (2.14) और (2.16) ऑक्सीकरण से कणों को रोकने के लिए ऑक्सीजन रहित उच्च शुद्धता में (2.1) पहले से तैयार पानी का उपयोग करें।
  12. 100 मिलीलीटर पानी में MNPS और BNC Resuspend। धीरे सभी MNPS कि दृढ़ता से BNC में शामिल नहीं कर रहे हैं दूर करने के लिए समाधान हिला। छानना रोंजगह में MNPS और BNC पकड़े चुंबक का उपयोग करके फिर से upernatant।
  13. पानी के साथ MNPS और BNC कई बार धोएं जब तक सतह पर तैरनेवाला तटस्थ पीएच (पीएच ~ 7) तक पहुँच जाता है के रूप में एक वर्णमिति पट्टी का उपयोग करके मापा।
  14. अलग MNPS से चुंबकीय-क्रियाशील BNC या चुंबकीय बैक्टीरिया का Nanocellulose (MBNC) चिमटी का उपयोग और जब तक पानी साफ चलाता MBNC कई बार पानी से कुल्ला।
  15. यूवी (110-280 एनएम) को MBNC हे / एन उजागर करके MBNC जीवाणुरहित।
  16. 20 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीजन रहित उच्च शुद्धता पानी की आटोक्लेव 500 मिलीलीटर और इस पानी के 20 मिलीलीटर में MBNC की दुकान।
  17. Aseptically, खूंटी के 1% में नमूना विसर्जित और आरटी पर 2 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए हलचल। यह प्रक्रिया biocompatibility और लोहे के आक्साइड BNC में जमा नैनोकणों, विशेष रूप से उन सतह 5-7 पर उजागर की स्थिरता में सुधार। खूंटी कोटिंग MBNC 3 डी नेटवर्क पर वितरित किया जाएगा।
    नोट: नग्न IONP आसानी से हवा में ऑक्सीकरण हो जाता हैउनके उच्च रासायनिक गतिविधि 8 की वजह से। हालांकि खूंटी एक गैर biodegradable सामग्री माना जाता है, इसकी रासायनिक स्थिरता जैसे पानी सामग्री, पीएच, तापमान, एंजाइमों की उपस्थिति, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों, और दूसरों के रूप में लागू 9 जैविक परिस्थितियों पर निर्भर करता है।

3. BNC और MBNC pellicles की विशेषता

  1. यांत्रिक विशेषताएं
    1. सामान्य लोडिंग और अनलोडिंग nanoindentation परीक्षण एक Berkovich indenter का उपयोग कर प्रदर्शन करना। Berkovich हीरा indenter की त्रिज्या 20 एनएम है।
    2. आरटी पर खरोज गहराई का एक समारोह के रूप में संपर्क क्षेत्र जांचना के लिए जुड़े हुए सिलिका और टंगस्टन का प्रयोग करें। परीक्षण के दौरान, गोंद का उपयोग खरोज पर नमूने माउंट। indenter इसकी मोटाई दिशा में नमूने का दरवाजा खटखटाया।
    3. नमूनों सतहों पर बेतरतीब ढंग से चुनिंदा खरोज स्थानों। 200-300 मिमी के बीच 2 इंडेंट के बीच अंतर रखें।
    4. लोड लागू करेंचरणों में नमूने और indenter की इसी विस्थापन रिकॉर्ड है। लोड गहराई बनाम की साजिश का विश्लेषण यंग मापांक खोजने के लिए।
    5. 0.01 एम.एन. और 0.60 करोड़ के बीच पीक लोड के साथ, 0.0001 करोड़ / सेकंड और 0,005 करोड़ / सेकंड के बीच लोड दरों को लागू करने से विआयनीकृत पानी (डि पानी), और परीक्षण की उपस्थिति में नमूने के परीक्षण nanoindentation बाहर ले।
    6. एक तरल सेल का प्रयोग करें और तरल पदार्थ वातावरण में नमूने रखें। एक तरल पदार्थ वातावरण में डूबे nanomechanical लक्षण वर्णन के लिए इस अनूठी सेटअप को प्रभावी ढंग से BNC और MBNC झिल्ली की पहुंच बायोमैकेनिकल कार्यक्षमता अनुकरण करने के लिए आदर्श है।
  2. SEM द्वारा संरचनात्मक लक्षण वर्णन
    1. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) स्कैनिंग द्वारा Nanocellulose फाइबर संरचना विशेषताएँ।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए नमूने Lyophilize। फिर, SEM स्टड पर माउंट 10 सेकंड के लिए Au-पी.डी. फिल्म के साथ धूम और SEM का उपयोग का विश्लेषण।
    3. 22,000X की एक बढ़ाई छवियों लेता हैऔर 60,000X, 5 केवी की एक त्वरण वोल्टेज के साथ।
  3. चुंबकीय डोमेन
    1. आरटी पर पूरी तरह से सूखे के लिए MBNC pellicles की अनुमति दें, और बाद में एक स्थायी चुंबक (1 टेस्ला) के लिए 5 मिनट के लिए बेनकाब।
    2. इसके तत्काल बाद, एक जैव AFM निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार का उपयोग कर चुंबकीय बल माप बाहर ले।
    3. प्रत्येक माप के लिए, पहली स्थलाकृति सुविधाओं पर कब्जा है और एक दूसरे के पास दौरान चुंबकीय डोमेन के अधिग्रहण। गैर संपर्क मोड में जैव AFM के साथ दोनों माप प्राप्त।
    4. नैनोकणों के चुंबकीय लक्षण वर्णन -10,000 10,000 ँ की रेंज में, भौतिक संपत्ति माप प्रणाली क्वांटम डिजाइन (PPMs) में हिल नमूना magnetometer (वीएसएम) का उपयोग किया जाता है एक चुंबकीय क्षेत्र के साथ आर टी (300 कश्मीर) में।
  4. Cytocompatibility
    1. 1.0x10 के घनत्व पर बीज मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (HASMC) 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में 2 सेमी और परीक्षण के नमूने की उपस्थिति में 24 घंटे के लिए सेते: BNC और MBNC pellicles (व्यास का एक 15.6 मिमी के साथ प्रत्येक)।
    2. क्रमश: नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इलाज और हाइड्रोजन पेरोक्साइड इलाज किया कोशिकाओं की आबादी का उपयोग करें।
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल और दिशा निर्देशों ए Azqueta और एआर कोलिन्स 10 से सुझाव के अनुसार धूमकेतु परख प्रदर्शन।
    4. intercalate को यह परख में न्यूक्लिक एसिड डाई SYBR सोने का उपयोग और fluorescently डीएनए निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार electrophoresed नमूनों में निहित लेबल।
      नोट: प्रकोष्ठों कि BNC और MBNC नमूनों की उपस्थिति में किसी भी डीएनए की क्षति से गुजरना नहीं है, एक फ्लोरोसेंट दौर हरी nucleoid दिखाएगा, डीएनए क्षतिग्रस्त कोशिकाओं लंबे धूमकेतु होगा जबकि - सकारात्मक नमूने nucleoids (धूमकेतु के सिर) होगा द्वारा पीछा किया पूंछ जो खंडित डीएनए सामग्री (पूंछ में डीएनए का प्रतिशत) होते हैं।

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Representative Results

जी के ऊष्मायन अवधि xylinus 9 दिनों की कुल था, लेकिन pellicles पहले फार्म शुरू किया और लगभग 2 दिनों के बाद स्पष्ट किया गया है। BNC की स्थूल उपस्थिति चित्र 1 में प्रदर्शित किया जाता है, जो डिश देसी संस्कृति की कि mimics के आकार। चित्रा 2 bnc-IONP pellicles के उत्पादन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है, जो मुख्य रूप में अच्छी तरह से ऊपर प्रोटोकॉल में शामिल कदम सारांश मुख्य घटकों का विन्यास।

SEM छवियों microstructure, आकृति विज्ञान, और BNC (चित्रा 3) और क्रियाशील BNC में IONP वितरण के तंतुओं के स्थानिक वितरण (चित्रा 4) को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया। BNC ठीक रिबन (व्यास में लगभग 50 एनएम) के रूप में परिभाषित किया गया है कि एक पैटर्न के बिना संपूर्ण नेटवर्क पर खुले pores द्वारा बनाई है। IONP preferentially हैं नियंत्रण रेखापैदा तंतु interlacing द्वारा गठित pores, 100 एनएम या आकार में अधिक के समूहों के गठन के बीच। व्यक्तिगत IONP भी रिबन के साथ बंधे हुए हैं। शायद इसलिए क्योंकि IONP bnc का रिबन को एक साथ लाने MBNC एक कम जमा तंतु संरचना BNC की तुलना दर्शाती है। चुंबकीय बल सूक्ष्मदर्शी MBNC की स्थलाकृति पर चुंबकीय प्रोफ़ाइल को फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 5 ए, बी)। 500 एनएम व्यास या बड़ा के बड़े pores MBNC, जो इलाज BNC (चित्रा 5 ए) में नहीं मनाया गया में बनते हैं। इस SEM Microphotographs, जहां MBNC असंशोधित BNC तुलना में एक अधिक झरझरा संरचना को प्रदर्शित करता है में टिप्पणियों के साथ समझौते में है। विभिन्न संस्कार के दो डोमेन के साथ एक चुंबकीय शक्ति ढाल MBNC सतह (चित्रा 5 ब), जिसका विपरीत पहाड़ियों और घाटियों MBNC स्थलाकृतिक छवियों (चित्रा 5 ए) में IONP समृद्ध क्षेत्रों द्वारा गठित साथ संबंध स्थापित नहीं करता भर में खोजा गया था। उच्च और कमजोर intensity चुंबकीय क्षेत्र क्रमश: चित्रा 5 ब में पीले और हरे रंग के रूप में चिह्नित हैं। नैनोकणों, जो बैक्टीरिया Nanocellulose में एम्बेडेड मापा जाता है की हिस्टैरिसीस पाश, चित्रा 5 में दिखाया गया है कि सभी सबूत IONPs आरटी पर superparamagnetic थे, कोई हिस्टैरिसीस के साथ उपलब्ध कराने के।

HASMC BNC की उपस्थिति में और MBNC का संवर्धन किया गया इन विदेशी माल से संपर्क का एक परिणाम के रूप में अलग-अलग कक्षों की व्यवहार्यता पर कोई हानिकारक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए। व्यक्ति की कोशिकाओं में क्षति की हद तक डीएनए किनारा टूट की पहचान (चित्रा 6) द्वारा मात्रा गया था। परिणामों का 37 डिग्री सेल्सियस, 95% हवा, और 5% सीओ 2 (नकारात्मक नियंत्रण) और 30 मिनट के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड प्रेरित genotoxicity (100 माइक्रोन के एच 2 ओ 2) के साथ HASMC को सामान्य संवर्धन की स्थिति (के तहत बढ़ HASMC की तुलना में थे सकारात्मक नियंत्रण)। बनती टी परीक्षण का उपयोग कर तुलना वें दिखायाMBNC के प्रभाव को सेल व्यवहार्यता पर HASMC (पी -value <0.001, ***) पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार के साथ प्रेरित उन लोगों से काफी अलग थे।

आकृति 1
चित्रा 1. बैक्टीरियल Nanocellulose के macroscopic पहलुओं। BNC pellicles एक 11 दिन की ऊष्मायन अवधि, जो लगभग रहे हैं के बाद प्राप्त किया गया है। मोटाई में 3 मिमी। ऊष्मायन अवधि के उपयोग के लिए आवश्यकताओं पर निर्भर करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 चुंबकीय क्रियाशील बैक्टीरियल Nanocellulose का निर्माण। आयरन ऑक्साइड नैनोकणों इकट्ठा कर रहे हैं और मैं BNC भीतर बगल में ncorporated, एक MBNC उपज है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. SEM BNC की छवि। BNC ठीक एक नेटवर्क है और 50 एनएम या उससे कम के आकार के साथ गैर एकत्रित रिबन प्रदर्शित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 की BNC-IONP पतली झिल्ली। आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (IONP) preferentially interlacing रिबन के बीच तैनात हैं SEM छवि।डी / 52951 / 52951fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. MBNC और चुंबकीय डोमेन संरचनाओं के AFM स्थलाकृति। MBNC की (ए) सतह स्थलाकृति अत्यधिक पैक नैनोकणों, जो nanofibril संरचना के ऊपर खड़े के धब्बे दिखा। (बी) के पीले और हरे रंग डोमेन के उच्च और कमजोर तीव्रता चुंबकीय क्षेत्र के विभिन्न संस्कार के दो क्षेत्रों को निरूपित क्रमशः। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 जोखिम रहने के बाद HASMC में डीएनए नुकसान की हद तकBNC, और MBNC क्रमशः। PosCtl HASMC कि तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार कराना पड़ा अर्थ। NegCtl HASMC सामान्य संवर्धन की शर्तों के तहत बढ़ रही अर्थ। MBNC HASMC पर व्यवहार्यता के हानिकारक प्रभावों PosCtl (पी मूल्य <0.001, ***) में मनाया उन लोगों से काफी अलग थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मोटाई और BNC पतली झिल्ली के आकार को आसानी से ऊष्मायन समय और कुप्पी जिसमें यह स्थिर खेती के दौरान हो गई है के आकार को बदलने के द्वारा चालाकी से किया जा सकता है। BNC के microproperties, जैसे porosity के रूप में, स्थिर संस्कृति में ऑक्सीजन अनुपात बदलकर संशोधित किया जा सकता है। अधिक ऑक्सीजन सांद्रता मुश्किल उपज BNC 11। ए बोडिन और सहकर्मियों 880 मिमी पारा अप करने के लिए एक फट दबाव के साथ BNC की ट्यूब का उत्पादन जी के किण्वन प्रक्रिया के दौरान 100% ऑक्सीजन के लिए वायुमंडलीय ऑक्सीजन से ऑक्सीजन अनुपात बदलकर xylinus 12। इसी तरह, BNC के porosity भी इस तरह के किण्वन प्रक्रिया में पैराफिन मोम microspheres के रूप में porogens शामिल द्वारा शुरू की जा सकती है। इस मामले में जिसके परिणामस्वरूप porosity और ताकना इंटरकनेक्टिविटी porogen आकार 13 पर निर्भर करेगा।

BNC के झरझरा नेटवर्क दवा वितरण के लिए, उन्हें नैनोकणों, जैसे के साथ क्रियाशील करने की अनुमति देताएजेंटों। हमारे अध्ययन में, हम synthesizing और, BNC झिल्ली में नैनोकणों बगल में बढ़ रही क्रम में तेजी से सेल भर्ती और BNC आधारित scaffolds में कुर्की के लिए एक चुंबकीय प्रोटोकॉल को लागू करने के द्वारा IONP साथ BNC क्रियाशील है। Nanomechanical परीक्षण पता चलता है कि BNC के nanoscale प्रतिक्रिया एक बहुत कम यंग मापांक, ई BNC = सतह पर 0.04 GPa के लिए नमूने के अंदर 0.0025 जीपीए के साथ रक्त वाहिकाओं 14 के साथ इसी तरह से व्यवहार करता है। मूल्यों प्राप्त फू एट अल। 15 से मनाया उन लोगों के साथ रेंज में हैं।

IONP से अधिक आसानी से माल की उच्च porosity के कारण BNC से हटाया जा सकता है। SEM तस्वीरों से पता चला है कि नैनोकणों तंतु interlacing द्वारा गठित और रिबन के साथ छितरी रिक्त स्थान में मुख्य रूप से वितरित कर रहे हैं। लोहे की इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल प्रजातियों की एकाग्रता उच्च घनी IONP, जो एक साथ bnc का रिबन लाया पैक मिले। यह एक में हुईअसंशोधित BNC के उन लोगों की तुलना में बड़ा pores के साथ MBNC। ओल्सन एट अल।, जो FeSO 4 के विभिन्न सांद्रता इस्तेमाल किया / CoCl सेल्यूलोज nanofibril aerogels के संश्लेषण में BNC का एक ही मात्रा अंश के साथ 2 लवण, BNC porosity में एक समान वृद्धि की सूचना दी जब वे ferromagnetic कोबाल्ट फेराइट की मात्रा अंश बदल 5.7% से 16% से नैनोकणों 0.7। MBNC में इस उच्च porosity दवाओं है कि वसूली के समय को बढ़ाने के बयान के लिए फायदेमंद हो सकता है और क्षतिग्रस्त धमनियों की दीवारों पर restenosis से बच सकते हैं।

स्थलाकृतिक सुविधाओं और चुंबकीय चरण छवियों के बीच के संबंध की कमी भी एट अल। बी टोरे 17, जिन्होंने स्थलाकृति और विरल nanoparticle फिल्मों के चुंबकीय संकेतों के बीच स्वतंत्रता की ओर इशारा द्वारा वर्णित किया गया है। इसके अलावा लक्षण वर्णन के अध्ययन संस्कार हिस्टैरिसीस (महाराष्ट्र) विद्रूप वीएसएम एसवाई के माध्यम से MBNC के छोरों का निर्धारण करने के लिए आयोजित किए जाने की जरूरत हैउपजा।

MBNC विषाक्त प्रभाव के लिए कम क्षमता का पता चला है, धूमकेतु परख में मनाया परिणामों के अनुसार, यह दर्शाता है कि इस सामग्री कोशिकाओं के साथ संपर्क में प्रयोग करने के लिए biocompatible है।

प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम अमोनियम हाइड्रॉक्साइड की राशि और जिस गति से यह जोड़ा जाता है, साथ ही प्रतिक्रिया के दौरान समाधान में पूर्ण विसर्जन और BNC की सरगर्मी सुनिश्चित करने के लिए संबंधित हैं। पहले पहलू है, जिसके परिणामस्वरूप लोहे के आक्साइड नैनोकणों के आकार को निर्धारित करता है, जबकि दूसरा एक को प्रभावित कैसे नैनोकणों BNC मैट्रिक्स के भर में वितरित कर रहे हैं। ताकि बेहतर MNPS के आकार को नियंत्रित करने के लिए, एक पानी निकलने की टोंटी के साथ एक burette प्रतिक्रिया में अमोनियम हाइड्रॉक्साइड छोड़ने के द्वारा अलावा विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। BNC के छोटे टुकड़े कि पूरी तरह से समाधान में डूबे जा सकता है, सलाह दी जाती है जैसे, समाधान के 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए लगभग 1.9 सेमी 2 का आकार। एक Limiइस तकनीक का tation BNC जाल अंदर IONP की inhomogeneous वितरण है।

इस प्रोटोकॉल BNC में लोहे के आक्साइड नैनोकणों को शामिल करने के लिए एक समग्र रूप में करने के लिए एक विधि का वर्णन है। biocompatibility और दोनों BNC और लोहे के आक्साइड नैनोकणों के शारीरिक और यांत्रिक गुणों की वजह से, MBNC ऐसी दवा वितरण प्रणाली और सेलुलर विकास के लिए scaffolds के रूप में जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucoacetobacter xylinus ATCC 700178
Agar Sigma Aldrich A1296-500G 
D-Mannitol Bioxtra Sigma Aldrich M9546-250G 
Yeast Extract BD Biosciences 212750
Bacteriological Peptone Sigma Aldrich P0556
Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water Sigma Aldrich 158127-100G
Iron(III) Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich 236489-100G 
Ammonium Hydroxide  Macron Fine Chemicals 6665-46
Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 Sigma Aldrich 202398-250G 
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma Aldrich 44939-250G
Disposable Petri dish Sigma Aldrich BR452000
Disposable Inoculating Loop Fisher Scientific 22-363-604 
Anhydrous Calcium Sulfate W.A. Hammond Drierite  13001
High vacuum grease Sigma Aldrich Z273554-1EA
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends Sigma Aldrich CAD7937-12EA
pH test strips   Sigma Aldrich P4786-100EA
Round-bottom three neck angle type distilling flask Sigma-Aldrich CLS4965250
Silicone oil for oil baths Sigma-Aldrich 85409-250ML 
Drying Tube Chemglass CG-1295-01
Septum Stopper, Sleeve Type Chemglass CG-3022-98
Magnetic stir bar Chemglass CG-2001-05
Condenser Chemglass CG-1218-01
Temperature Controller BriskHeat SDC120JC-A
Stirring Hotplate Fisher Scientific 11-100-49SH 
Comet Assay Kit Trevigen 4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies S-11494
bio-AFM JPK Instruments NanoWizard 4a BioScience AFM
Nanoindenter Micro Materials Ltd Multi-module mechanical tester 
Scanning electron microscopy (SEM) Hitachi High Technologies America Hitachi S-4800

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 111, बैक्टीरियल सेलुलोज लोहे के आक्साइड नैनोकणों रक्त वाहिका biomaterial
आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के साथ एक Functionalized चुंबकीय बैक्टीरियल Nanocellulose का निर्माण
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Arias, S. L., Shetty, A. R., Senpan, … More

Arias, S. L., Shetty, A. R., Senpan, A., Echeverry-Rendón, M., Reece, L. M., Allain, J. P. Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (111), e52951, doi:10.3791/52951 (2016).

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