Bioprinting cellularisées Constructs Utilisation d'un spécifique de tissu Hydrogel Bioink

L'objectif général de ce protocole est de démontrer une approche polyvalente pour concevoir des bioencres à base d'hydrogel pouvant être extrudées à l'aide d'appareils d'impression biologique. Ces bioencres peuvent ensuite être utilisées pour fabriquer des constructions tissulaires tridimensionnelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'impression biologique, notamment sur la manière de contrôler les propriétés mécaniques nécessaires afin de fournir un matériau pouvant être extrudé à l'aide d'une imprimante biologique.

Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de composants disponibles dans le commerce combinés de manière modulaire pour créer un bio-encre hydrogel simple et efficace utilisable en bioprinting. Les applications de ces technologies incluent la création d'organoïdes tridimensionnels pouvant être utilisés pour modéliser précisément les effets des médicaments, des toxines et des maladies. Bien que cette méthode puisse fournir un cadre pour le bioprinting de constructions hépatiques tridimensionnelles, elle peut également être appliquée à d'autres types de tissus, tels que le muscle, le poumon et le côlon.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car plusieurs réactifs différents sont utilisés pour créer l’encre bioactive hydrogel, mais la méthode est en réalité assez simple. La procédure sera démontrée par Young-Joon Seol, un post-doctorant de notre équipe. Commencez par préparer un digest de matrice extracellulaire spécifique au tissu destiné à être utilisé dans la formulation de l’hydrogel, comme décrit ailleurs.

Ensuite, dissoudre un photoinitiateur dans de l'eau à un ratio de 0,1 % poids par volume. Pour former les bioencres hydrogels, dissoudre d'abord les composants de base des kits d'hydrogel d'acide hyaluronique dans des aliquots individuels de la solution aqueuse de photoinitiateur. Puis, combiner la solution de matrice extracellulaire, l'acide hyaluronique thiolié à 2 %, la gélatine thioliée à 2 %, les agents de réticulation et le milieu de culture d'hépatocytes selon les rapports indiqués ici. Pour améliorer les propriétés d'extrusion de la bioencre, ajouter 1,5 milligramme par millilitre d'acide hyaluronique non modifié et 30 milligrammes par millilitre de gélatine une fois le mélange obtenu.

Ensuite, vortexer une dizaine de secondes le mélange obtenu à puissance maximale avant utilisation. Avant d'essayer le bio-encre dans un dispositif d'impression biologique, testez d'abord ses caractéristiques d'extrusion sur la paillasse du laboratoire. À l'aide d'une seringue standard, déposez un échantillon de la bio-encre, puis fixez à la seringue une aiguille de 20 à 30 gauge.

Laisser le bio-encre se réticuler, puis la faire passer à travers l'aiguille afin d'obtenir des filaments d'hydrogel extrudés régulièrement. Si la formulation est capable de former un filament présentant peu ou pas d'irrégularités, elle est prête pour l'impression biologique. Pour charger les préparations de bio-encre dans une imprimante biologique, pipeter les bio-encres dans des cartouches d'imprimante stérilisées.

Les laisser reposer pendant 30 minutes avant l'extrusion, car l'encre biologique subira une réticulation spontanée de premier stade à l'intérieur de la cartouche. Ensuite, charger la cartouche dans le dispositif d'impression et raccorder une source de pression pneumatique à la cartouche. Préparer un motif simple, tel qu'une grille de sept millimètres sur sept millimètres composée de lignes parallèles, à imprimer afin d'évaluer sa compatibilité à l'extrusion.

Tandis que la tête d'impression se déplace dans le plan XY à une vitesse d'environ 300 millimètres par minute, appliquez une pression de 20 kilopascals à la cartouche pour extruder l'encre biologique. Si les matériaux extrudés sont hétérogènes ou irréguliers, réduisez la quantité de réticulateur ajoutée afin d'assouplir le matériau réticulé de stade un. Une formulation d'encre biologique correctement préparée doit s'extruder de manière homogène, permettant un dépôt précis et la formation d'architectures.

Préparez des sphéroïdes hépatiques primaires en 3D dans une plaque de 96 puits en utilisant la méthode de la goutte suspendue, comme décrit dans le protocole accompagnant. Après trois jours de culture, récupérez les sphéroïdes hépatiques à partir de la plaque de goutte suspendue à l’aide d’une pipette et transférez-les dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Laissez les sphéroïdes sédimenter au fond du tube conique pendant une à deux minutes.

Ensuite, aspirez soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette. Transférez entre 110 et 125 pour cent du volume souhaité du construct imprimé en 3D de la solution d’encre bioactive hydrogel fraîchement préparée dans le tube conique contenant les sphéroïdes. Puis, pipetez délicatement les sphéroïdes de haut en bas afin de les redisperser dans la solution d’encre bioactive hydrogel.

Une fois la suspension homogène obtenue, transférer la solution de sphéroïdes dans une cartouche d'imprimante biologique à l'aide d'une pipette et laisser la solution subir la première étape de réticulation pendant 30 minutes. À l'issue de cette étape de réticulation, utiliser un dispositif d'impression biologique pour créer les structures de l'hydrogel souhaitées contenant les sphéroïdes hépatiques primaires. Après chaque couche déposée, exposer l'encre biologique imprimée à une lumière UV pendant deux à quatre secondes afin d'initier le mécanisme de réticulation secondaire.

Cela stabilisera les constructions et augmentera la rigidité au niveau souhaité. La concentration de PEG alcyne dans la solution contrôle la densité globale de réticulation, et par conséquent détermine principalement la rigidité de la construction finale. Après l’impression biologique, une viabilité cellulaire élevée dans les constructions hépatiques a été observée à l’aide de la microscopie confocale.

Dans des conditions environnementales optimales, la viabilité devrait être supérieure à 85 %. De plus, lorsque les constructions ont été marquées avec des marqueurs indiquant un tissu hépatique, une expression positive de la CYP3A4, une isoforme du cytochrome P450, de l'albumine intracellulaire, de l'E-cadherine, une protéine d'adhésion cellule-cellule épithéliale, et de la DPP4, une protéine fortement exprimée dans le foie, a été observée pour tous ces marqueurs. Lorsque les concentrations d'urée et d'albumine dans le milieu de culture ont été mesurées, on a constaté que la construction sécrétait à la fois de l'urée et de l'albumine à des niveaux constants au cours des 14 jours d'expérience. Cela suggère davantage que les bioencres à base d'hydrogel spécifiques au tissu contribuent au maintien de la fonction des cellules hépatiques.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures du début à la fin, à condition d'être exécutée correctement. Toutefois, cela dépend souvent du dispositif de bioprinting particulier utilisé. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les étapes démontrées doivent fréquemment être adaptées afin d'être compatibles avec d'autres types de tissus ou d'autres dispositifs de bioprinting.

En suivant cette procédure, d'autres formulations d'encres de biohydrogels peuvent être créées afin de soutenir l'impression biologique d'autres types de tissus. Le développement de ces technologies a permis de préparer le terrain pour la création de plates-formes multicellulaires « organe-sur-puce » destinées au criblage de médicaments et à la modélisation de maladies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de commencer à concevoir des matériaux pouvant être utilisés pour l'impression biologique de constructions tissulaires tridimensionnelles en utilisant un réticulation en plusieurs étapes.

N'oubliez pas que le travail avec la lumière ultraviolette peut être extrêmement dangereux pour la vision, et des précautions telles que l'utilisation de lunettes de protection contre les UV doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.