Bioprinting cellularisées Constructs Utilisation d'un spécifique de tissu Hydrogel Bioink

L’objectif global de ce protocole est de démontrer une approche polyvalente pour concevoir des bio-encres d’hydrogel qui peuvent être extrudées à travers des dispositifs de bio-impression. Les bio-encres peuvent ensuite être utilisées pour fabriquer des constructions tissulaires tridimensionnelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la bio-impression, telles que la façon de contrôler les propriétés mécaniques nécessaires pour fournir un matériau pouvant être extrudé à l’aide d’une bio-imprimante.

Le principal avantage de cette technique est que nous utilisons des composants disponibles dans le commerce combinés de manière modulaire pour créer une bio-encre hydrogel bioimprimable simple et efficace. Les applications de ces technologies comprennent la création d’organoïdes tissulaires 3D qui peuvent être utilisés pour modéliser avec précision les effets des médicaments, des toxines et des maladies. Bien que cette méthode puisse fournir un cadre pour la bio-impression de constructions hépatiques en 3D, elle peut également être appliquée à d’autres types de tissus tels que les muscles, les poumons et le côlon.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il existe un certain nombre de réactifs différents utilisés pour créer la bio-encre d’hydrogel, mais c’est en fait assez simple. Young-Joon Seol, post-doctorant de notre équipe, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez une digestion de matrice extracellulaire spécifique au tissu à utiliser dans la formulation de l’hydrogel, comme décrit ailleurs.

Ensuite, dissolvez un photoinitiateur dans l’eau à un rapport poids/volume de 0,1 %Pour former les bio-encres d’hydrogel, dissolvez d’abord les composants du matériau de base des kits d’hydrogel d’acide hyaluronique dans des aliquotes individuelles de la solution de photo-initiateur d’eau. Ensuite, combinez la solution ECM, l’acide hyaluronique thiolé à 2 %, la gélatine thiolée à 2 %, les agents de réticulation et les milieux de culture d’hépatocytes dans les proportions indiquées ici. Pour améliorer les propriétés d’extrusion de la bio-encre, ajoutez 1,5 milligramme par millilitre d’acide hyaluronique non modifié et 30 milligrammes par millilitre de gélatine au mélange.

Ensuite, faites tourbillonner le mélange obtenu à puissance élevée pendant dix secondes avant de l’utiliser. Avant de tester la bio-encre dans un dispositif de bio-impression, testez d’abord les caractéristiques d’extrusion sur la paillasse de laboratoire. À l’aide d’une seringue standard, déposez un échantillon de bioink, puis fixez une aiguille de calibre 20 à 30 à la seringue.

Laissez la bio-encre se réticuler, puis poussez-la à travers l’aiguille pour obtenir des filaments d’hydrogel extrudés en douceur. Si la formulation est capable de créer un filament avec peu ou pas de bosses, alors il est prêt pour la bio-impression. Pour charger les préparations de bio-encres dans une bio-imprimante, pipetez les bio-encres dans des cartouches d’imprimante stérilisées.

Laissez-les reposer pendant 30 minutes avant l’extrusion, car la bio-encre subira une réticulation spontanée de la première étape à l’intérieur de la cartouche. Ensuite, chargez la cartouche dans la configuration d’impression et connectez une source de pression pneumatique à la cartouche. Préparez un motif simple, comme cette grille de sept millimètres sur sept de lignes parallèles, à imprimer afin d’évaluer sa compatibilité avec l’extrusion.

Pendant que la tête d’impression se déplace dans le plan XY à une vitesse d’environ 300 millimètres par minute, appliquez une pression de 20 kilopascals sur la cartouche pour extruder la bio-encre. Si les matériaux extrudés sont grumeleux ou irréguliers, réduisez la quantité de réticulant ajoutée afin de ramollir le matériau réticulé de la première étape. Une formulation de bio-encre correctement préparée doit s’extruder en douceur, ce qui permet un dépôt et des architectures précis.

Préparez des sphéroïdes hépatiques de cellules primaires en 3D dans une plaque de 96 puits en utilisant la méthode de la goutte suspendue comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Après trois jours de culture, prélevez les sphéroïdes hépatiques de la plaque de goutte suspendue à l’aide d’une pipette et transférez-les dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Laissez les sphéroïdes se déposer au fond du tube conique pendant une à deux minutes.

Ensuite, aspirez soigneusement le support à l’aide d’une pipette. Transférez 110 à 125 % du volume de construction 3D imprimé souhaité de la solution de bio-encre d’hydrogel fraîchement préparée dans le tube conique contenant les sphéroïdes. Ensuite, pipetez soigneusement les sphéroïdes de haut en bas pour les remettre en suspension dans la solution de bio-encre d’hydrogel.

Une fois uniformément suspendue, transférez la solution de sphéroïde dans une cartouche de bio-imprimante à l’aide d’une pipette et laissez la solution subir la première étape de réticulation pendant 30 minutes. Après l’étape de la réticulation, utilisez un dispositif de bio-impression pour créer les structures d’hydrogel souhaitées contenant les sphéroïdes hépatiques primaires. Après chaque couche de dépôt, exposez la bio-encre imprimée à la lumière UV pendant deux à quatre secondes pour initier le mécanisme de réticulation secondaire.

Cela stabilisera les constructions et augmentera la rigidité au niveau souhaité. La concentration d’alcyne PEG dans la solution est ce qui contrôle la densité globale de réticulation, et contrôle donc principalement la rigidité de la construction finale. Après la bio-impression, une viabilité cellulaire élevée dans les constructions hépatiques a été observée à l’aide de la microscopie confocale.

Dans des conditions environnementales optimales, la viabilité devrait être supérieure à 85 %. De plus, lorsque les constructions ont été colorées pour des marqueurs indiquant un tissu hépatique, l’expression positive du CYP3A4, d’une isoforme du cytochrome P450, de l’albumine intracellulaire, de la E-cadhérine, une protéine d’adhésion cellule épithéliale et de la DPP4, une protéine fortement exprimée dans le foie. Lorsque le milieu de culture a été testé pour les niveaux d’urée et d’albumine, il a été constaté que la construction sécrétait à la fois de l’urée et de l’albumine à des niveaux constants pendant 14 jours. Cela suggère en outre que les bio-encres d’hydrogel spécifiques aux tissus aident à maintenir la fonction des cellules hépatiques.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures du début à la fin si elle est exécutée correctement. Cependant, cela dépend souvent du dispositif de bio-impression particulier utilisé. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les étapes démontrées doivent souvent être adaptées pour être compatibles avec d’autres types de tissus ou dispositifs de bio-impression.

À la suite de cette procédure, d’autres formulations de bio-encre en hydrogel peuvent être créées afin de soutenir la bio-impression d’autres types de tissus. Le développement de ces technologies a contribué à ouvrir la voie à la création de plateformes multi-organoïdes de corps sur puce pour le criblage de médicaments et la modélisation de maladies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de commencer à concevoir des matériaux qui peuvent être utilisés pour la bio-impression de constructions tissulaires 3D en utilisant la réticulation en plusieurs étapes.

N’oubliez pas que travailler avec la lumière ultraviolette peut être extrêmement dangereux pour la vision, et des précautions telles que l’utilisation de lunettes de protection UV doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.