Introduction
在高产奶牛胚胎早期损耗是在乳品行业1，2的主要挑战之一。牛已经成为一个有趣的模型来研究人类早期胚胎发育，由于其相似的发展过程3,4。然而，需要更多的研究来有关于涉及牛胚胎早期发育的基因更好的理解。
后由于第一微阵列技术二十年1995年5开发的，更为复杂的探测器制造工艺降低打印错误和内和不同微阵列平台6之间的阵列芯片可变性的发展。改进的微阵列技术导致了在临床研究7和广泛应用这种技术最近，在早期胚胎quality评估8。
大量的芯片技术所需的材料也就是为什么微阵列技术最初未能进入的一些研究领域，如早期胚胎发育的主要原因。最近，RNA扩增方法已得到改进，线性放大RNA为从起始原料RNA 9个子纳克微克的水平。目前市场上可用的几个商业RNA扩增试剂盒;然而，更多的受欢迎发达试剂盒相关的核糖单引物等温扩增10和T7启动子驱动的11种方法。最流行的反义RNA扩增的体外转录采用用寡dT引物在5'端12连结到一个T7启动子。该技术允许保持了最具代表性的反义转录物的线性扩增后˚F或阵列杂交13。该方法已适于放大来自牛胚胎8提取的总RNA皮克水平。
万向联动系统（ULS）是直接结合的DNA或扩增的RNA与铂联荧光色素或者花青547或花青647，通过形成于鸟嘌呤14的N7位置的配位键的标记方法。该方法适于在胚胎的研究，以产生更稳定的相比改性酶法15产生的aRNA的氨基烯丙基扩增的aRNA无需修改。单染料和两种染料标记方法已经在芯片使用通用联动系统调整。一个大型芯片的比较研究是有数据质量的一个和两个彩色阵列平台6之间的良好的相关性。
近来，T7启动子驱动Ñ反义RNA扩增和ULS标记方法已被开发，以提供更可靠的协议来产生标记的aRNA材料用于微阵列杂交8,16的高品质的足够量。因此，这项研究提供了一个协议来演示一些从RNA提取使用7天牛胚胎作为一个例子涉及双色微阵列数据分析的重要步骤。
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Protocol
这项研究的动物部分在阿尔伯塔省埃德蒙顿，加拿大大学的代谢研究单位进行，由亚伯达省动物护理和使用委员会大学所有的动物实验程序批准（协议＃AUP00000131），和动物的照顾根据以动物保健指南加拿大委员会（1993年）。
1.胚胎生产，总RNA和DNA酶处理的分离
- 对于动物实验方案和胚胎收集参阅在我们以前的出版物17 和 18。
- 池和捕捉来自在液氮每头奶牛冷冻类似阶段的胚胎，然后在保持-80℃直至RNA提取。
- 通过基于列的RNA提取试剂盒使从微微规模的样本提取RNA（包信息，请在物料清单）中提取总RNA。
注：推荐套件包括：调节缓冲液，提取BUFFER，70％乙醇，洗涤缓冲液1中，洗涤缓冲液2中，洗脱缓冲液，以收集管和离心管RNA纯化列。 - 添加10μL的提取缓冲液含有胚胎管中并在42℃孵育30分钟。在800 XG 2分钟的离心管收集细胞提取物到离心管中。
- 吸取250μL调理缓冲到纯化柱过滤膜。孵育调理缓冲RNA的纯化塔，在室温下5分钟。离心在收集管中的纯化塔以16,000 xg离心1分钟。
- 吸移管10微升70％乙醇的成RNA提取缓冲液和胚胎的混合物。吹打上下拌匀。吸取混合气进入预处理纯化柱。
- 以100 xg离心结合的RNA，离心纯化塔2分钟，通过离心16,000 xg离心紧接30秒通过除去流动。
- 吸取10081，L洗涤缓冲液1到纯化塔和离心机在8000×g下1分钟。
注意：DNA酶处理建议后，是否提取RNA进行逆转录或扩增。 - 步骤1.8之后消化基因组DNA。
注：建议DNA酶试剂盒在材料列表中。推荐套件包括：DNA酶I原液和缓冲器。 - 通过混合5微升的DNA酶我原液35μL缓冲准备的DNase孵育混合物中。轻轻倒转混合。
- 直接吸取40微升的DNA酶保温混合物进入纯化柱膜。在室温下孵育15分钟。
- 吸取40μL洗涤液1到纯化柱膜上，然后离心在8000 XG为15秒。
- 吸取100μL的洗涤缓冲液2进入净化塔和离心机在8000×g下1分钟。
- 吸取另外100微升洗涤缓冲液2到纯化塔和离心机为16,000×g的2分钟。
- 纯化塔转移至新的0.5毫升离心管中。吸移管11洗脱缓冲液的微升直接在纯化塔的膜。以确保洗脱缓冲液的最大吸收到膜中，吸移管的尖端轻轻触碰到膜的表面，而分配所述洗脱缓冲液。
- 孵育柱在室温下1分钟。离心1分钟列在1000 xg离心到列分发洗脱缓冲液，然后在16,000g XG旋转1分钟以洗脱RNA。
- 根据制造商的说明来评估RNA的质量和数量19使用生物分析仪。
- 储存在-80℃直到使用RNA样品。
2. RNA扩增和标记的微阵列分析
注：对于RNA扩增和标记程序工作的第一次使用，使用五个NG穗在RNA ALO与实际的aRNA样品ng到监视RNA扩增和杂交的质量控制测量。在穗的RNA结构包含10个在体外合成，在预定比例多聚腺苷酸的成绩单。当程序适当地进行，标记的转录物特异性只杂交到阵列互补控制探针和数据可以被扫描以跟踪具有最小自或交叉杂交的质量控制的保证。关于扫描阵列和数据分析后的尖刺，在控制强度和规范化步骤的详细介绍请参考以前的出版物20，21。下面的过程是考虑到常规微阵列的用户。
- 11微升 - 在10总体积制备100pg的高品质的RNA样品（RNA完整性数（RIN）值至少> 7.0）。
- 扩增RNA样品与扩增试剂盒能够有微微的样本规模的工作（低至100 PG）。
注：推荐扩增试剂盒信息，请在材料清单，并遵循制造商的说明书没有任何修饰。 - 使用基于荧光的定量评估扩增的aRNA的大小范围的分布。
- 使用分光光度计仪器（基于在260和280nm的吸光度）来测量扩增的aRNA的浓度。
- 存储放大阿尔纳在-80°C，直到准备标签。
- 根据ULS阿尔纳标记试剂盒用户指南使用放大RNA 2微克的荧光标记。
注意：由于花青547和花青647染料是光降解和花青647染料敏感容易被臭氧分解，标记过程中发生的光的最小量和无臭氧环境下。 - 打开臭氧箱（ 图1A），直至臭氧的电平为0.001 ppm的。
- 轻轻混匀，并在85°C孵育在热循环仪的管15分钟。在冰上至少1分钟发生的样本。降速用RNA提取试剂盒出发，除了相关的DNA酶处理（1.9至1.11）的步骤之前，收集管的内容，以清理CY-染料标记的扩增的RNA。
- 使用分光光度计仪器来测量和确定标记的扩增的RNA的浓度并在使用前保持标记的aRNA在-80℃下最大为3天。
3.基因芯片杂交，洗涤
注：以下重要步骤是根据双色微阵列基因表达分析协议改编（版本6.5，2010年5月）。
- 添加从每个菁547-和647菁标记的aRNA纳克的825等量和25X碎片和10倍的封闭液混合。
- 加热该混合物在60℃下15分钟，并在冰上冷却1分钟。
- 加入2X杂交缓冲液等量拌匀。
- 离心机以13000rpm，然后将混合物已准备好用于杂交。
- 从该混合物中加载100微升到阵列滑动并密封杂交室内部的幻灯片。
- 在65℃下装入装配室分成杂交烘箱17小时在烤箱10的转速旋转。
- 根据浸入稳定和30秒干燥的解决方案与臭氧保护治疗方案洗净阵列。
- 从溶液中取出阵列并确保该阵列表面干燥，无粉尘颗粒
4.扫描微阵列
- 保持阵列在黑暗的地方，打开scann呃，直到它准备使用（15分钟等待时间）。
- 加载阵列条形码左，进入扫描仪和开始扫描。根据软件用户指南执行现场分析并保存数据（GPR）文件格式。
5.统计分析
- 下载软件FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php点击“导入原始数据”和GPR文件加载到FlexArray。
- 如有必要，通过之后的指令执行正规化和统计分析。注：因为以前22说明计算在这项研究中积极选点的阈值。
- 选择下拉从FlexArray的情节观众手动查看所有杂交斑点和背景信号。注：杂交到芯片飙升后在控制的类似的图像可以在以前的研究中8可以看出。
- 选择一个从FlexArray阵列正常化进程之间的分位数以下阵列内黄土正常化相应下拉手册。
- 从导出所有FlexArray归一化数据到一个Excel文件以便今后使用。
6.生物信息学分析
从牛胚胎特异性转录的探针序列的原始注解（BESTv1）微阵列先前已8所述。在本研究中，获得了20403独特的基因符号（GS）（ 补充文件1 ）通过EmbryoGENE实验室信息管理系统（LIMS）ELMA（http://elma.embryo-gene.ca）。的6765独特的基因（名单补充文件2被选中），对应于芯片正常化进程后，所有的积极信号（第5步.5）从牛7天胚胎基因表达谱。积极的信号阈值是基于从A值的信号强度透水出版16计算。
- 执行与PANTHER功能分析（蛋白质分析，通过进化关系）分类系统23，24，打开下面的链接（http://www.pantherdb.org/about.jsp）。
- 上传的6765胚胎特异性GS列表使用统计人数过多试验胚胎发育过程中识别特定的生物过程，并使用普通牛的默认设置（在数据库中的所有基因）作为参考名单25。
注意：这允许从在统计上过高或过低表达用二项式检验的GO术语发育有关的过程的鉴定。 - 在<0.05设置P值阈值的软件默认。数据可以下载并博览会rted到Excel文件中进一步选择16。
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Representative Results
从第7天的牛胚胎的总RNA和扩增的aRNA的代表性结果示于图3和表1中总结。
RNA的完整性和轮廓可以提取RNA后进行评估。 RNA的质量评估可以通过生物分析仪（ 图3A），并只与RIN值的那些样本高于7.0有资格被用于扩增（ 表1）来完成。
质量和扩增的RNA的量应扩增后进行评估。扩增的RNA轮廓和适当大小范围的相似性是用于质量控制（ 图3B）的主要因素。两轮扩增后，扩增的RNA片段的大小非常相似，范围200至800碱基对（ 图3B）和的类似尺寸范围内的所有的aRNAs，aRNAs被选择用于进一步的荧光标记。另外，原来的总RNA的一个成功的扩增将产生的aRNA（ 表1）中的至少超过一千倍。
荧光标记效率可以根据标记比率度来计算。其计算公式是ULS阿尔纳标记试剂盒用户指南。用户指南建议的标记比率的程度应该是1.0 - 3.6％，这表明，平均1 - 每100个核苷酸3.6 ULS分子。
杂交和扫描后的图像文件可以从FlexArray查看。微阵列杂交和洗涤后良好的质量扫描的图像示于图4A中 。如果标记的物质是比该范围低或高，信号将太低以检测或高背景水平将后scanni被检测纳克（ 图4B）。
在目前的研究中，阳性信号的阈值设定为7.6（超过7.6或背景<7.6被认为是阳性更高探针信号）。近似表示20826阳性斑点的探针集合的46％在红色指示在牛天7胚胎（ 图5）。除去未加和重复的基因符号后，只有6765独特的基因符号是留给PANTHER分析。
这些基因6765代表了第7天的囊胚牛表达的独特的RNA转录。为了查找特定于牛囊胚的生物学过程，PANTHER比例过高的试验进行的。具有最高倍富集指数前10基因本体论（GO）术语的ID被选择（ 图6）。在一般情况下，这些特定的GO术语基本上代表了活跃的细胞分裂过程，如mitosiS和染色体分离，细胞周期和细胞质和线粒体翻译起始调控。
图1：无臭氧盒（A）和阵列的标记反应（B）。 A）无臭氧盒包括一个催化转换器单元回收空气和破坏臭氧和一个高度敏感的臭氧传感器来监控芯片的性能在箱内的臭氧水平。 B）贴标程序和阵列杂交盒内进行，以避免臭氧荧光菁染料647退化。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：PANTHER 基因列表分析。红色箭头指示的区域需要被填补。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：RNA 的 代表生物分析仪电泳 （A）和 放大RNA（B） 的凝胶图像 。 A）显示与RIN值，RNA浓度和rRNA的比例整体效果。 B）RNA扩增后两回合放大的配置文件。扩增的RNA片段被预期为在200和800碱基对之间的范围内。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 阵列强度图的图像。 （A）数组滑动的良好形象呈现绿色和红色通道对应的高点强度（左侧用蓝色绿色表示）和低后台扫描后菁547和花青647信号（与深蓝色右图所示颜色）。 （B）数组幻灯片的不良形象展示从红色通道非常高的背景图片（从与来自菁647点强度的形象相似的蓝绿色的上游面板指示）。彩色图表表示信号与对应于不同的颜色数值的强度。信号强度的值是在深蓝色的范围内的最低。 请点击此处查看大- [R版本这个数字。
图5：MA 积7天牛胚胎基因表达谱。 20826红点代表上述背景信号积极的信号。背景点突出显示为黑色。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6： 具有最高 的 倍浓缩指数十大基因本体论（GO）项的ID。这些具体的GO术语在很大程度上代表了活跃的细胞分裂过程中，如有丝分裂和染色体分离，细胞周期调控和启动细胞质和线粒体转特征研。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 样品 | 胚胎数 | 类型 | 胚胎形态质量 | RNA浓度（PG /μL） | RIN | 扩增使用的总RNA（PG） | 放大RNA浓度（ng /μL） | ||||||||
| S1 | 4 | 囊胚 | 1级和2 | 101 | 8.6 | 858.5 | 3498.4 | ||||||||
| S2 | 1 | 囊胚 | 2级 | 142 | 7.4 | 1207 | 1682.4 | S3 | 2 | 囊胚 | 1级 | 135 | 8.8 | 1147.5 | 3185.3 |
| S4 | 3 | 囊胚 | 1级 | 177 | 9 | 1504.5 | 2906.4 | ||||||||
| S5 | 五 | 囊胚 | 1级 | 636 | 8.3 | 5406 | 3437.5 | ||||||||
| S6 | 3 | 囊胚 | 1级和2 | 159 | 9.1 | 1351.5 | 1689.8 | ||||||||
| S7 | 3 | 囊胚 | 1级 | 154 | 9 | 1309 | 4507.1 | ||||||||
| S8 | 4 | 囊胚 | 1级 | 304 | 8.5 | 2584 | 3089.3 | ||||||||
| S9 | 五 | 囊胚 | 1级 | 282 | 9.1 | 2397 | 3917.8 | ||||||||
| S10 | 6 | 囊胚 | 1级和2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 五 | 囊胚 | 1级 | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | 囊胚 | 1级 | 206 | 9 | 1751 | 2567.9 |
表1： 示例和RNA的信息。 RNA的浓度和质量应提取后进行评估。 RNA的完整性和浓度可通过任何生物分析仪进行评估。 RNA完整性数应大于7.0。 RNA浓度应通过分光分色仪的放大后进行检查。安莉芳根据国际胚胎移植学会手册o质量评价（第3版，开胃菜，IL）。
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Discussion
第一个问题使用7天的牛胚胎是没有得到足够数量的高质量RNA是研究基因表达进行微阵列分析。不推荐用于第7天的胚胎传统苯酚/氯仿RNA提取和乙醇沉淀法，导致低产量以及可能剩苯酚抑制RNA扩增反应。相反，一个标准的基于列的方法是更好地隔离总RNA，然后洗脱以最小的洗脱缓冲液，以增加浓度的RNA。在目前的研究是利用相同的方法学26，目前所使用的相同的RNA提取试剂盒27,28的其他报告可比得到780皮克每胚胎的总RNA的平均值。提取RNA，建议以溶解之前沉淀充分混合使用或暖提取缓冲液的小瓶至提取缓冲液之前重新溶解使用。此外，培养时间也是在萃取步骤的RNA产率很重要。孵育时间小于在42℃下整整30分钟减少的RNA产量。
在列DNA酶消化是必要的总RNA纯化过程中去除基因组DNA污染。 DNA酶酶是涡旋和离心非常敏感。因此，DNA酶和缓冲应轻轻倒转混合。
RNA的质量是在微阵列分析和样品与RIN非常重要低于7不应被视为用于杂交。在目前的研究中，通过生物分析仪所获得的总RNA轮廓类似于来自牛胚泡26,27在研究先前观察到。值得到使用预先阴影胚胎时应当注意，特别是从母体胚胎转移前的卵母细胞和胚胎制备的RNA，所述RIN值通常低于7相比从第7天的胚胎的总RNA，这是由于在28S / 18S rRNA的比例27的变化。
来自牛胚胎中提取的RNA的量是不够的平台杂交，因此，需要RNA扩增。有可用于RNA扩增的几种方法例如PCR， 在体外转录（IVT）和Ribo-SPIA（单引物等温扩增）。虽然后一种方法是更快，在一天之内提供了足够的材料为阵列，它需要至少5纳克作为起始材料29。因此，我们选择了IVT方法，它能够以低原料12工作（低至100 PG）。而且，它已经被测试，以扩增来自牛胚胎成功29提取总RNA。在目前的研究中，我们的扩增方法生产的〜28微克每扩增胚胎RNA从每个胚胎598皮克总RNA。 Additio应受，两轮扩增后，我们的样品显示出这是在协议与以前的研究13，15（200和800碱基对之间）的类似信息和适当的大小范围。
在这个协议中，我们使用了非酶标记方案，铂联花青（花青547和花青647）染料。此方法允许扩增或非扩增的RNA的标记。标签之前有扩增步骤允许使用天然核苷酸，导致RNA扩增更高的收益率，减少偏差相比，酶法产生较长的片段。的花青547和花青647染料是常见荧光染料推荐为双色阵列。然而，花青染料647对臭氧降解敏感。手持臭氧监测器应当用于使低于2 ppb的臭氧的肯定的水平。此外，无尘环境是必要的，以避免灰尘颗粒落入杂交溶液或都灵摹扫描。
微阵列实验所用一或两色的方法来设计。每个实验方法有一些优点和缺点。采用双色设计，减少了可变性和背景噪声，允许直接比较和循环使用，明确一个共同的参考样本设计。虽然当采用双色设计都进行了实验专用染料偏见可以显着影响的结果，这些偏见可以通过执行染料互换得到缓解。这样的技术的复制增加实验费用，但可以提高测量差异表达31既精确度和灵敏度。
比较其他生物信息学软件（如猩猩）PANTHER允许与普通牛基因组作为基准进行比较数据集。我们的研究结果表明，第7天的牛胚胎发育过程中的下列生物成分和功能涉及：中期/祖国党的调控细胞周期HASE过渡，有丝分裂中期/后期过渡的调控，染色体分离的调控，线粒体翻译，蛋白质的K48连接泛素化，ER高尔基囊泡介导的运输，核转录mRNA的分解代谢过程中，翻译起始，有丝分裂姊妹染色单体分离，有丝分裂核分裂。
在本文所提出的协议，从扩增的RNA，以阵列的扫描的荧光标记应与上述环境因素的额外认识到保持高质量的数据被执行。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
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