Introduction
Perda embrionária precoce em vacas leiteiras de alta produção é um dos principais desafios para a indústria de laticínios 1, 2. Bovine tornou-se um modelo interessante para estudar o desenvolvimento pré-implantação do embrião humano devido ao seu processo de desenvolvimento semelhante 3, 4. No entanto, é necessária mais investigação para ter uma melhor compreensão sobre genes envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial de bovinos.
Depois de vinte anos desde a primeira tecnologia de microarray desenvolvido em 1995 5, o desenvolvimento da tecnologia de fabricação sonda erros de impressão reduzidos mais sofisticados e variabilidade de chips de matriz dentro e entre diferentes plataformas de microarray 6. Tecnologia de microarray melhorou amplamente resultou numa aplicação desta tecnologia em investigação clínica 7 e, mais recentemente, no embrião inicial Qavaliação ualidade 8.
A grande quantidade de material necessário para a tecnologia de microarray é a principal razão pela qual a tecnologia de microarrays inicialmente não conseguiu introduzir um número de campos de pesquisa, como o desenvolvimento embrionário inicial. Mais recentemente, métodos de amplificação de ARN foram melhorados para amplificar ARN linearmente até ao nível de sub-microgramas nanograma material de partida ARN 9. Existem vários kits de amplificação de ARN comerciais disponíveis no mercado; no entanto, os mais populares kits bem desenvolvidos estão relacionados com Ribo-Single Primer isotérmico amplificação 10 e promotor T7 conduzida 11 métodos. O mais popular de amplificação anti-sentido de ARN utiliza na transcrição in vitro com um iniciador oligo dT de ligação a um promotor de T7 na extremidade 5 '12. Esta tecnologia permite a manutenção da maior parte dos transcritos anti-sentido representativas após amplificação linear fou matrizes de hibridação 13. Este método foi adaptado para amplificar nível picograma de RNA total extraído de embriões de bovino 8.
Universal Linkage System (ULS) é o método de marcação que incorpora diretamente o DNA ou RNA amplificado com corante fluorescente ligada à platina quer Cyanine 547 ou Cyanine 647, formando uma ligação de coordenação sobre a posição N7 de guanina 14. Este método foi adaptado em investigação embriões para gerar mais estável, sem modificação ARNA amplificado em comparação com o aminoallyl ARNA modificada gerado pelo método enzimático 15. tanto métodos de corante único e rotulagem dois corantes foram adaptados usando Universal sistema de ligação em microarray. Um grande estudo comparações microarray foi que há uma boa correlação da qualidade dos dados entre as plataformas de matriz de um e dois de cor 6.
Recentemente, tanto unidade promotor T7métodos de amplificação N ARN anti-sentido e de rotulagem ULS têm sido desenvolvidos para proporcionar um protocolo mais fiável para gerar uma quantidade suficiente de materiais de alta qualidade marcado arna para hibridação microarray 8, 16. Portanto, este estudo fornece um protocolo para demonstrar algumas das etapas importantes de extração de RNA para análise de dados envolvidos em microarray de duas cores utilizando Dia 7 embriões bovinos como um exemplo.
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Protocol
A parte animal desse estudo foi realizado na Unidade de Investigação Metabólica da Universidade de Alberta, Edmonton, Canadá, com todos os procedimentos experimentais em animais aprovado (Protocolo # AUP00000131) pela Universidade de Alberta Animal Care e do Comitê Use, e os animais tratados de acordo ao Conselho canadense de diretrizes animal Care (1993).
1. Produção de Embriões, Isolamento de RNA total e Tratamento DNase
- Para protocolos experimentais de animais e de colheita de embriões se referir em nossas publicações anteriores 17, 18.
- Piscina e encaixe congelar embriões estágio similar de cada vaca em nitrogênio líquido e, em seguida, manter a -80 ° C até a extração de RNA.
- Extrair o ARN total por meio de um estojo de extracção de ARN baseada em coluna, que permite extrair o ARN a partir de amostras escala Pico (kit de informação está disponível na lista de materiais).
NOTA: Recomendado kit contém: Condicionado Tampão, Extração Buffer, 70% de etanol, tampão de lavagem 1, tampão de lavagem 2, tampão de eluição, colunas de purificação de RNA com tubos de coleta e microtubos. - Adicionar 10 ul de tampão de extracção contendo embriões de tubo e incubar durante 30 min a 42 ° C. tubo de centrifugação a 800 xg durante 2 min para recolher o extracto de células no tubo de microcentrífuga.
- Pipetar 250 mL de buffer Condicionado para a membrana do filtro de purificação de coluna. Incubar a coluna de purificação de ARN com tampão condicionado durante 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar a coluna de purificação no tubo de recolha a 16.000 xg durante 1 min.
- Pipetar 10 ul de 70% de etanol com a mistura de ARN Tampão de Extracção e embriões. Misture bem, pipetando cima e para baixo. mistura pipeta na coluna de purificação pré-condicionados.
- Para ligar ARN, centrifugar a coluna de purificação de 2 min a 100 xg e segue-se imediatamente através de uma centrifugação a 16000 xg durante 30 segundos para remover o fluxo através.
- pipeta 10081; L de tampão de lavagem 1 para a coluna de purificação e centrifugar durante 1 min a 8000 x g.
NOTA: DNase tratamento é recomendado se realizar a transcrição reversa ou amplificação após o isolamento do RNA. - Digerir o ADN genómico direita após o passo 1.8.
NOTA: Recomendado kit DNase está disponível na lista de materiais. kit recomendado contém: solução de DNase I e solução tampão. - Prepare a mistura de incubação com DNase por mistura de 5 mL de ADNase I solução de reserva com 35 mL de buffer. Misture invertendo suavemente.
- Pipetar a pL de DNase mistura de incubação de 40 directamente para a membrana da coluna de purificação. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
- Pipetar 40 ul de tampão de lavagem 1 para a membrana da coluna de purificação e então centrifugar a 8000 xg durante 15 s.
- Tampão Pipetar 100 mL de lavagem 2 para a coluna de purificação e centrifugar durante 1 min a 8000 x g.
- Pipetar outro 100 uL de tampão de lavagem 2 para a coluna de purificação e centrifugardurante 2 minutos a 16.000 x g.
- Transferir a coluna de purificação para um novo tubo de microcentrifugação de 0,5 mL. Pipetar 11 ul de tampão de eluição directamente para a membrana da coluna de purificação. Para garantir a absorção máxima de tampão de eluição na membrana, tocar suavemente a ponta da pipeta para a superfície da membrana, enquanto a distribuição do tampão de eluição.
- Incubar a coluna durante 1 min à temperatura ambiente. Centrifugar a coluna durante 1 min a 1000 xg para distribuir tampão de eluição na coluna, e em seguida girar durante 1 min a 16.000 xg, para eluir o ARN.
- Use Bioanalyzer instrumento de acordo com as instruções do fabricante para avaliar a qualidade e quantidade de ARN de 19.
- Armazenar a amostra de ARN a -80 ° C até à sua utilização.
2. RNA amplificação e Rotulagem de Análise de Microarray
NOTA: Para o primeiro usuário tempo de trabalho com procedimentos de amplificação de RNA e de rotulagem, use cinco ng de pico-in RNA along com as amostras reais arna para controlar a medição da amplificação de ARN e hibridação de controlo de qualidade. O pico-in mix RNA contém dez in vitro sintetizados, transcrições poliadenilados em proporções predeterminadas. Quando o procedimento realizado adequadamente, as transcrições rotulados especificamente hibridizam apenas para sondas de controlo complementares em matrizes e os dados podem ser digitalizados para rastrear garantia de controle de qualidade com a auto-mínimo ou hibridação cruzada. Mais detalhes descrição sobre o procedimento cravado-in intensidades de controle e normalização após a digitalização da análise da matriz e de dados é referir-se a publicações anteriores 20, 21. O procedimento que se segue é dada para os utilizadores de microarranjos de rotina.
- Prepare (valor de número de ARN Integridade (NIR), pelo menos> 7,0) de 100 pg de alta qualidade amostra de ARN num volume total de 10 - 11 mL.
- Amplificar a amostras de ARN com um estojo de amplificação de ser capaz detrabalhar com amostras escala pico (tão pouco quanto 100 pg).
NOTA: Recomendado informações kit de amplificação está disponível em Lista de materiais e segue as instruções do fabricante, sem qualquer modificação. - Usar uma quantificação à base de fluorescência para avaliar o perfil da gama de tamanhos do ARNA amplificado.
- Utilizar o instrumento de espectrofotômetro (com base na absorvância a 260 e 280 nm) para medir a concentração da ARNA amplificado.
- Armazenar o ARNA amplificado a -80 ° C até estar pronto para rotulagem.
- Use 2 mg de RNA amplificado para marcação fluorescente de acordo com o guia do usuário ULS ARNA kit rotulagem.
NOTA: Uma vez que Cyanine 547 e 647 Cyanine corante são sensíveis a foto-degradação e Cyanine 647 corante é facilmente degradada pelo ozono, o procedimento de marcação tem lugar em uma quantidade mínima de luz e sob um ambiente livre de ozono. - Ligue a caixa de ozono (Figura 1A) até que o nível de ozono é de 0,001 ppm.
- Misturar suavemente e incuba-se os tubos em um termociclador a 85 ° C durante 15 min. Colocar as amostras em gelo durante pelo menos 1 min. Girar para baixo para recolher o conteúdo de tubos, antes de prosseguir com o estojo de extracção de ARN, excepto passos relacionados com tratamento de DNase (1,9-1,11), para limpar o ARN amplificado Cy-corante-rotulados.
- Utilizar o instrumento espectrofotómetro para medir e determinar a concentração de ARN amplificado marcado e manter o ARNA marcado à temperatura de -80 ° C no máximo durante 3 dias antes da utilização.
3. Microarray hibridação e de lavagem
NOTA: Os seguintes passos importantes são adaptados de acordo com duas cores à base de Microarray Gene Expression Análise de Protocolo (versão6.5, maio de 2010).
- Adicionar uma quantidade igual de 825 ng de cada Cyanine 547- e Cyanine 647 marcado ARNA e misture com 25x e 10x fragmentação buffers de bloqueio.
- Aquecer a mistura a 60 ° C durante 15 minutos e arrefece-se em gelo durante 1 min.
- Adicionar uma quantidade igual de 2x tampão de hibridização e misturar bem.
- Centrifuga-se a 13000 rpm, em seguida, a mistura está pronta para hibridação.
- Carga de 100 mL da mistura sobre a lâmina de matriz e vedar a corrediça no interior da câmara de hibridação.
- Carregar a câmara montada no forno de hibridação durante 17 h a 65 ° C em rotação a 10 rpm em forno.
- Lave as matrizes de acordo com o protocolo com tratamento de protecção de ozono por imersão em solução de estabilização e secagem durante 30 s.
- Retirar as matrizes a partir da solução e certificar-se da superfície da matriz é seca com as partículas de poeira não há
4. Digitalização Microarray Deslize
- Mantenha as matrizes no lugar escuro e ligue scannER até que esteja pronta a utilizar (15 min de tempo de espera).
- Coloque o código de barras matriz na esquerda, no scanner e iniciar a digitalização. Fazer a análise local de acordo com o guia do usuário do software e salvar os dados como (GPR) formato de arquivo.
5. Análise Estatística
- Faça o download do software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Clique em "dados brutos de importação" e carregar os arquivos de GPR em FlexArray.
- Realizar a normalização e a análise estatística, se necessário, seguindo as instruções. Nota: o cálculo do limiar para a seleção local positiva neste estudo como foi descrito anteriormente 22.
- Selecione no menu suspenso o manual do visualizador gráfico da FlexArray para ver todos os pontos cruzados e sinais de fundo. Nota: Um quadro semelhante das cravado nos controlos, após hibridação com o micro-arranjo pode ser visto no estudo anterior 8.
- Selecione umanormalização Loess dentro matriz seguinte por um quantil entre o processo de matrizes normalização do FlexArray suspensa manual de conformidade.
- Exportar todos os dados normalizados de FlexArray em um arquivo do Excel para posterior utilização.
6. Análise Bioinformatics
A anotação original das sequências de sondas de transcrições específicas de embriões bovinos (BESTv1) microarray foi descrita anteriormente 8. No presente estudo, foram obtidos 20,403 símbolos único gene (GS) ( Suplemento File1 ) através do Sistema de Gestão EmbryoGENE Laboratório de Informação (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Uma lista de 6.765 genes únicos ( Suplemento File2 ) foi seleccionado e correspondiam aos sinais positivos após todo processo de normalização de microarray (Passo 50,5) a partir do dia 7 gene embriões perfil de expressão bovina. Limite sinal positivo foi calculado com base na publicação permeável 16 da intensidade do sinal de um valor A.
- Para realizar a análise funcional com PANTHER (análise de proteínas através de relações evolucionárias) Classification System 23, 24, abra o seguinte link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
- Carregar uma lista de 6.765 GS específicas do embrião para identificar processo biológico específico durante o desenvolvimento embrionário por meio do teste sobre-representação estatística e usar a configuração padrão do Bos taurus (todos os genes no banco de dados), como lista de referência 25.
NOTA: Este permite a identificação de processos de desenvolvimento relacionadas com a de os termos GO que são estatisticamente super ou sub-expresso utilizando um teste binomial. - Definir limite P-valor em <0,05 como padrão de software. Os dados podem ser baixados e exported em arquivo de Excel para posterior selecção 16.
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Representative Results
Um resultado representativo de ARN total e amplificado ARNA desde o dia 7 embriões é mostrada na Figura 3 e resumidos no Quadro 1.
integridade do RNA e do perfil pode ser avaliada após a extração do RNA. Avaliação da qualidade do ARN podia ser realizado por instrumento Bioanalyzer (Figura 3A) e apenas as amostras com um valor superior a 7,0 RIN estão qualificados para ser usado para amplificação (Tabela 1).
A qualidade e a quantidade de ARN amplificado deve ser avaliada após a amplificação. A semelhança do perfil RNA amplificado e faixa de tamanho apropriado são os principais fatores para controle de qualidade (Figura 3B). Após a amplificação de duas voltas, os fragmentos de ARN amplificados são muito semelhantes em tamanho, variando entre 200 e 800 pb (Figura 3B) etodos Arnas de faixa de tamanho semelhante são seleccionados para posterior rotulagem de fluorescência. Além disso, uma amplificação bem sucedida do ARN total inicial irá produzir, pelo menos, mais do que um aumento de mil vezes de ARNA (Tabela 1).
Fluorescência eficiência de marcação pode ser calculada de acordo com o grau de relação de rotulagem. A fórmula está disponível no manual do utilizador ULS ARNA kit rotulagem. O guia de utilizador sugere que o grau de relação de etiquetagem deve ser 1,0-3,6%, o que indica que uma média de 1 - 3,6 moléculas ULS por 100 nucleótidos.
Os arquivos de imagem após hibridação e de digitalização pode ser visto a partir FlexArray. A boa qualidade de imagem digitalizada após a hibridização microarray e lavagem é mostrado na Figura 4A. Se os materiais são rotulados inferior ou superior a esta gama, sinais será muito baixa para detectar ou altos níveis de fundo será detectado após scanning (Figura 4B).
No estudo corrente, o limiar de sinal positivo foi fixado em 7,6 (sinal da sonda superior a 7,6 ou fundo <7,6 considerados positivos). Aproximadamente 46% dos conjuntos de sondas que representam 20826 pontos positivos são indicados na cor vermelha no Dia 7 embriões de bovino (Figura 5). Depois de retirar símbolos gene não anotadas e duplicado, apenas 6.765 símbolos de genes únicos é deixado para análise PANTHER.
Estes 6.765 genes representam as transcrições de RNA únicas expressas no blastocisto bovina Dia 7. A fim de encontrar o processo biológico específico para blastocisto bovina, a Panther Sobre-representação de teste é realizado. O Top 10 Gene Ontology (GO) IDs prazo com o maior índice de enriquecimento vezes é selecionada (Figura 6). Em geral, estes termos GO específicos representam em grande parte o processo de divisão celular activa, tais como mitosis e cromossoma segregação, a regulação do ciclo celular e iniciação de tradução citoplasmática e mitocondrial.
Figura 1: livre de Ozono Box (A) e de matriz reacção de marcação (B). A) O ozono caixa de Free consiste de uma unidade de conversor catalítico que recicla o ar e destrói o ozono e um sensor de ozono altamente sensível para monitorar o nível de ozono dentro da caixa durante o desempenho de microarray. B) Procedimento de Rotulagem e hibridização matriz executar dentro da caixa para evitar o fluorescente Cyanine 647 corante degradação por ozônio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: PANTHER Gene Lista Analysis. As setas vermelhas indicam precisam ser preenchidos a área. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Um representante Bioanalyzer eletroferograma de ARN total (A) e a imagem do gel de ARN amplificado (B). A) Mostrando resultado global com valor RIN, a concentração de RNA e relação de rRNA. B) O perfil de RNA amplificado após a amplificação de duas voltas. fragmentos de ARN amplificados Espera-se que se situe num intervalo entre 200 e 800 pb. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem da matriz Intensidade Mapa. (A) Uma boa imagem de um slide de matriz mostrando canal verde e vermelho correspondem a cianina 547 e Cyanine 647 sinais após digitalizar com alta intensidade local (indicado na esquerda com cor verde azul) e baixo fundo (indicado na direita com azul escuro cor). (B) A má imagem de um slide de matriz mostrando imagem muito alto de fundo de canal vermelho (indicado a partir do painel superior com a cor verde azul semelhante a partir da imagem de Cyanine 647 intensidade spot). Carta de cor indica a intensidade de sinal com valores numéricos que correspondem às cores diferentes. O valor da intensidade do sinal é a mais baixa na faixa de cor azul escuro. Por favor clique aqui para ver um grander Versão desta figura.
Figura 5: MA Plot para o dia 7 de bovino Gene Expression Embryo perfil. 20,826 manchas vermelhas representada sinais positivos acima sinais de fundo. manchas de fundo são destacados na cor preta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Os Top 10 Gene Ontology (GO) IDs prazo com o mais alto Fold Índice de Enriquecimento. Estes termos GO específicos representam em grande parte o processo de divisão celular activa, tais como a mitose e a segregação cromossoma, a regulação do ciclo celular e iniciação de citoplasmática e mitocondrial translação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostra | Número de embriões | Tipo | Qualidade morfológica de embriões | A concentração de RNA (pg / mL) | RIN | RNA total utilizado para amplificação (pg) | A concentração de RNA amplificado (ng / mL) | ||||||||
| S1 | 4 | blastocisto | Grade 1 & 2 | 101 | 8.6 | 858,5 | 3498,4 | ||||||||
| S2 | 1 | blastocisto | Grau 2 | 142 | 7,4 | 1207 | 1682,4 | S3 | 2 | blastocisto | grau 1 | 135 | 8,8 | 1147,5 | 3185,3 |
| S4 | 3 | blastocisto | grau 1 | 177 | 9 | 1504,5 | 2906,4 | ||||||||
| S5 | 5 | blastocisto | grau 1 | 636 | 8.3 | 5406 | 3437,5 | ||||||||
| S6 | 3 | blastocisto | Grade 1 & 2 | 159 | 9.1 | 1351,5 | 1689,8 | ||||||||
| S7 | 3 | blastocisto | grau 1 | 154 | 9 | 1309 | 4507,1 | ||||||||
| S8 | 4 | blastocisto | grau 1 | 304 | 8,5 | 2584 | 3089,3 | ||||||||
| S9 | 5 | blastocisto | grau 1 | 282 | 9.1 | 2397 | 3917,8 | ||||||||
| S10 | 6 | blastocisto | Grade 1 & 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | blastocisto | grau 1 | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | blastocisto | grau 1 | 206 | 9 | 1751 | 2567,9 |
Tabela 1: Exemplo de informação e de ARN. A concentração e a qualidade do RNA devem ser avaliadas após extracção. a integridade de ARN e a concentração pode ser avaliada por qualquer Bioanalyzer. número de integridade do RNA deve ser superior a 7,0. A concentração de ARN deve ser analisado por espectrofotómetro instrumento após a amplificação. EmbryO qualidade foi avaliada de acordo com o Manual da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (3 rd ed., Savoy, IL).
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Discussion
O primeiro problema a realizar análise de microarray utilizando Dia 7 embriões não é obter quantidades suficientes de ARN de alta qualidade para estudar a expressão do gene. extração de RNA fenol tradicional / clorofórmio e método de precipitação de etanol não é recomendado para o dia 7 embriões, resultando em baixo rendimento e possíveis fenol restante inibir reação de amplificação de ARN. Em vez disso, um método baseado em coluna padrão é melhor para isolar o ARN total e, em seguida, eluir o ARN com tampão de eluição mínimo para aumentar a concentração. Uma média de 780 pg de RNA total por embrião é obtido no estudo atual, que é comparável com outros relatórios utilizando uma metodologia idêntica 26 e o kit de extração de RNA mesmo 27, 28 utilizado actualmente. Para extracção de RNA, recomenda-se a dissolver precipitado antes da utilização por agitação enérgica ou aquecer o frasco tampão de extracção para re-dissolver o tampão de extracção préviausar. Além disso, o tempo de incubação é também importante para a produção de ARN no passo de extracção. O tempo de incubação menos do que um total de 30 min a 42 ° C reduziu o rendimento de ARN.
Na coluna ADNase digestão é necessária para remover a contaminação do ADN genómico durante a purificação de RNA total. A enzima ADNase é muito sensível a vórtice e centrifugação. Portanto, DNase e tampão deve ser misturado, invertendo suavemente.
A qualidade do ARN é muito importante nas análises de microarray e amostras com um RIN inferior a 7 não devem ser considerados para a hibridação. No estudo actual, os perfis de ARN total, obtidos por Bioanalyzer são semelhantes aos observados anteriormente em estudos de blastocistos bovinos 26, 27. Vale a pena notar-se que quando da utilização de embriões pré-eclodidos, especialmente ARN preparado a partir de oócitos e embriões antes da transição para materna embrionário, o valor Rin é muitas vezes menor do que 7 comparadopara o ARN total de embriões Dia 7 e isto é devido a uma variação na proporção 28S / 18S de rRNA 27.
A quantidade de ARN extraído de embriões de bovino não é suficiente para a hibridação plataforma, por isso, a amplificação de RNA é necessária. Existem vários métodos disponíveis para a amplificação de ARN, tais como PCR, a transcrição in vitro (IVT), e ribo-SPIA (único iniciador de amplificação isotérmica). Embora o último método é mais rápida e em um dia fornece material suficiente para matrizes, é necessário pelo menos 5 ng como material 29 de partida. Por isso, escolhemos o método IVT que é capaz de trabalhar com baixos materiais de partida 12 (tão pouco quanto 100 pg). Além disso, já foi testado para amplificar ARN total extraído de embriões de bovino com sucesso 29. No estudo atual, o nosso método de amplificação produzido ~ 28 ug de ARN amplificado por embrião a partir de 598 RNA total pg por embrião. additiofinalmente, após a amplificação de duas voltas, nossas amostras apresentaram um perfil semelhante e faixa de tamanho apropriado (entre 200 e 800 pb), que estão de acordo com estudos anteriores 13, 15.
Neste protocolo, foi utilizado um protocolo de rotulagem não enzimática, cyanine ligados a platina (Cyanine 547 e Cyanine 647) corantes. Este método permite a rotulagem de ARN amplificado ou não amplificado. Tendo passo de amplificação antes da marcação permite o uso de nucleotídeos naturais, levando a rendimentos mais elevados de ARN amplificados, reduzir o preconceito e gerar fragmentos mais longos em comparação com método enzimático. Os Cyanine 547 e 647 Cyanine corantes são comuns corantes fluorescentes recomendar para array de duas cores. No entanto, Cianina 647 corante é sensível à degradação do ozono. Mão monitor de ozono realizada deve ser usado para garantir que o nível de ozono abaixo de 2 ppb. Além disso, o ambiente livre de poeira é necessário para evitar as partículas de pó que cai na solução de hibridação ou durang digitalização.
experimento de microarray pode ser concebido de aproximação de um ou dois cor. Cada abordagem experimental tem algumas vantagens e desvantagens. Usando modelos de duas cores reduz a variabilidade e ruído de fundo, permite a comparação directa e para o laço projeta com a definição de uma amostra de referência comum. Embora preconceitos específicos de corantes podem afetar substancialmente os resultados quando as experiências são realizadas utilizando modelos de duas cores, essas tendências podem ser mitigados através da realização de swaps de corante. Essa replicação técnica aumenta os custos experimentais, mas pode melhorar a precisão e sensibilidade na medição expressão diferencial 31.
Compare com o outro software de bioinformática (como Gorilla) PANTHER permite comparar dataset com genoma taurus Bos como referência. Nossos resultados indicam que, durante o Dia 7 bovina desenvolvimento embrionário os seguintes componentes biológicos e funções estão envolvidos: regulação da metáfase / ANAPtransição hase do ciclo celular, a regulação da transição mitótico metaphase / anaphase, regulação da segregação cromossômica, tradução mitocondrial, proteína ubiquitination ligada-K48, ER de Golgi transporte mediado por vesícula, processo catabólico mRNA nuclear transcrita, de iniciação da tradução, irmã mitótico chromatid segregação , divisão nuclear mitótico.
Os protocolos apresentados neste trabalho, a partir de marcação fluorescente do RNA amplificado para a digitalização de matrizes deve ser executado com a consciência extra de fatores ambientais acima de manter dados de alta qualidade.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
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