Introduction
Frühe embryonale Verlust in hoher produzierenden Milchkühe ist eine der größten Herausforderungen in der Milchindustrie 1, 2. Bovine hat sich ein interessantes Modell menschlichen preimplantation Embryoentwicklung zu studieren aufgrund ihrer ähnlichen Entwicklungsprozess 3, 4. Jedoch ist mehr Forschung erforderlich besseres Verständnis über Gene in bovinen frühen Embryonalentwicklung beteiligt zu haben.
Nach zwanzig Jahren seit Technologie der ersten Microarray 1995 entwickelte 5, 6 die Entwicklung anspruchsvollerer Sonde Herstellungstechnologie reduziert Druckfehler und Variabilität von Array - Chips innerhalb und zwischen verschiedenen Microarray - Plattformen. Verbesserte Mikroarray - Technologie führte zu einer weit Anwendung dieser Technologie in der klinischen Forschung 7 und in jüngster Zeit in frühen Embryos quality Bewertung 8.
Die große Menge an benötigten Materialien für Microarray-Technologie ist der Hauptgrund, warum der Microarray-Technologie zunächst eine Reihe von Forschungsgebieten wie der frühen Embryonalentwicklung zu betreten gescheitert. In jüngerer Zeit wurden Verfahren RNA - Amplifikation verbessert RNA linear zu amplifizieren bis 9 Mikrogramm Ebene von Unter Nanogramm- Ausgangs - RNA - Material. Es gibt mehrere kommerzielle RNA Amplifizierung Kits auf dem Markt erhältlich; jedoch sind die immer beliebter gut entwickelten Kits im Zusammenhang mit Ribo-Einzel Primer isothermen Amplifikation 10 und T7 - Promotor 11 Methoden angetrieben. Die beliebtesten Antisense - RNA - Amplifikation verwendet in - vitro - Transkription mit einem Primer Oligo - dT - Verknüpfung mit einem T7 - Promotor am 5' - Ende 12. Diese Technologie ermöglicht es, das Beste aus repräsentativen Antisense-Transkripte nach linearer Verstärkung f Aufrechterhaltungoder Arrays Hybridisierung 13. Dieses Verfahren wurde angepasst Picogramm Ebene der Gesamt - RNA aus Rinderembryo 8 extrahiert zu amplifizieren.
Universal - Linkage System (ULS) ist das Markierungsverfahren , die direkt die DNA oder RNA verstärkt mit Platin-gebundenen Fluoreszenzfarbstoff entweder Cyanine 547 oder Cyanine 647, durch eine koordinative Bindung an N7 - Position von Guanin 14 bildet enthält. Diese Methode wurde in Embryonen Forschung angepasst stabiler amplifizierten aRNA ohne Modifikation zu erzeugen im Vergleich zu dem aminoallyl modifizierten aRNA durch enzymatische Verfahren 15 erzeugt. Sowohl Einzel- als Farbstoff und zwei Farbstoffe Markierungsverfahren wurden mit Universal Linkage System in Microarray angepasst. Eine große Microarray - Vergleiche Studie war , dass es eine gute Korrelation der Datenqualität ist zwischen den Ein- und Zwei-Farben - Array - Plattformen 6.
Vor kurzem beide T7-Promotor-Laufwerkn - Antisense - RNA - Amplifikation und ULS Markierungsverfahren wurden eine zuverlässigere Protokoll bereitzustellen entwickelt eine ausreichende Menge von hoher Qualität zu erzeugen , gekennzeichnet aRNA Materialien für Mikroarray - Hybridisierungs 8, 16. Daher stellt diese Studie ein Protokoll in Zweifarb-Mikroarray mit Tag 7 Rinderembryonen als Beispiel beteiligt einige der wichtigen Schritte von der RNA-Extraktion bis zur Datenanalyse zu demonstrieren.
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Protocol
Das Tier Teil dieser Studie wurde an der Metabolic Research Unit der University of Alberta, Edmonton, Kanada, mit allen tierexperimentellen Verfahren genehmigt (Protokoll # AUP00000131) von der University of Alberta Animal Care und Use Committee, geleitet und Tiere betreut nach an den Canadian Council of Animal Care-Richtlinien (1993).
1. Embryo Produktion, Isolierung von Gesamt-RNA und DNase-Behandlung
- Für die Tierversuchsprotokolle und Embryo - Entnahme beziehen sich in unseren bisherigen Publikationen 17, 18.
- Pool und Snap einfrieren ähnliche Stufe Embryonen aus jeder Kuh in flüssigem Stickstoff und dann halten bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion.
- Extrahieren Sie die Gesamt - RNA über eine spaltenbasierte RNA - Extraktions - Kits , die RNA aus pico-Skala Proben zu extrahieren ermöglicht (Kit Informationen finden Sie in der Materialliste zur Verfügung).
HINWEIS: Empfohlene Kit enthält: Konditionierungspuffer, Extraktion Buffer, 70% Ethanol, Waschpuffer 1, Waschpuffer 2, Elutionspuffer, RNA Reinigungskolonnen mit Sammelröhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen. - In 10 & mgr; l Extraktionspuffer zu Röhrchen mit Embryonen und Inkubation für 30 min bei 42 ° C. Zentrifugenröhrchen bei 800 × g für 2 min Zellextrakt in das Reaktionsgefäß zu sammeln.
- Pipette 250 ul Konditionierungspuffer auf die Reinigungskolonne Filtermembran. Inkubieren der RNA Reinigungskolonne mit Konditionierungspuffer für 5 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Reinigungskolonne in dem Sammelröhrchen bei 16.000 × g für 1 min.
- Pipette 10 & mgr; l 70% Ethanol in dem Gemisch aus RNA Extraction Buffer und Embryonen. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Pipette-Gemisch in die vorkonditioniert Reinigungskolonne.
- RNA zu binden, zentrifugieren der Reinigungskolonne für 2 min bei 100 xg und sofort von einer Zentrifugation bei 16.000 xg für 30 s folgen, um Strömung durch entfernen.
- Je 10081; L Waschpuffer 1 in die Reinigungskolonne und zentrifugieren für 1 min bei 8.000 x g.
HINWEIS: DNase-Behandlung, wenn die Durchführung der reversen Transkription oder Verstärkung nach der RNA-Isolierung empfohlen. - Digest genomische DNA direkt nach dem Schritt 1.8.
HINWEIS: Empfohlene DNase Kit ist in der Materialliste zur Verfügung. Empfohlene Kit enthält: DNase I-Stammlösung und Puffer. - Bereiten Mischung DNase Inkubation von 5 ul DNase I-Stammlösung mit 35 & mgr; l Puffer zu mischen. Mischen Sie vorsichtig invertieren.
- Pipette, um die 40 & mgr; l DNase Inkubationsmischung direkt in die Reinigungskolonne Membran. für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Pipette 40 & mgr; l Waschpuffer 1 in die Säule Membranreinigung und dann bei 8000 × g für 15 s zentrifugiert.
- Je 100 & mgr; l Waschpuffer 2 in die Reinigungskolonne und zentrifugieren für 1 min bei 8.000 x g.
- Pipette weitere 100 & mgr; l Waschpuffer 2 in die Reinigungskolonne und Zentrifugefür 2 Minuten bei 16.000 x g.
- Übertragen Sie die Reinigungskolonne zu einem neuen 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pipette 11 ul Elutionspuffer direkt auf die Membran der Reinigungskolonne. Um eine maximale Absorption von Elutionspuffer in die Membran zu gewährleisten, sanft berühren die Spitze der Pipette auf die Oberfläche der Membran, während die Elutionspuffer Abgabe.
- Inkubieren der Säule für 1 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren der Säule für 1 min bei 1000 × g Elution Buffer in der Säule zu verteilen, und dann drehen für 1 min bei 16.000 xg RNA zu eluieren.
- Verwenden Bioanalyzer Instrument nach den Anweisungen des Herstellers , die RNA - Qualität und Quantität 19 zu bewerten.
- Lagern Sie die RNA-Probe bei -80 ° C bis zur Verwendung.
2. RNA-Amplifikation und Markierung für Microarray-Analyse
HINWEIS: Zum ersten Mal Benutzer arbeiten mit RNA-Amplifikation und Kennzeichnungsverfahren, verwenden fünf ng spike in RNA aloden tatsächlichen aRNA Proben ng der Qualitätskontrolle Messung der RNA-Amplifikation und Hybridisierung zu überwachen. Der Spike-in RNA - Mix enthält zehn in vitro synthetisierten, polyadenylierte Transkripte in vorbestimmten Verhältnissen. Wenn das Verfahren korrekt durchgeführt, hybridisieren die markierten Transkripte spezifisch nur an komplementäre Kontrollsonden in Arrays und können die Daten abgetastet werden Qualitätskontrollsicherung mit minimaler Selbst- oder Kreuzhybridisierung zu verfolgen. Weitere Details Beschreibung in Bezug auf die mit Spikes-Kontrolle Intensitäten und Normalisierungsverfahren nach der Anordnung und Datenanalyse Scannen 20 zur vorherigen Publikationen verweisen, 21. Das folgende Verfahren wird auf die Routine Microarray-Benutzer gegeben.
- Bereiten 100 pg hoher Qualität RNA-Probe (RNA Integrity Number (RIN) Wert mindestens> 7,0) in einem Gesamtvolumen von 10 - 11 & mgr; l.
- Amplify die RNA-Proben mit einem Amplifikationskit in der Lage,arbeiten mit Pico-Skala Proben (weniger als 100 pg).
HINWEIS: Empfohlene Amplifikationskit Informationen finden Sie in der Materialliste zur Verfügung und folgt den Anweisungen des Herstellers ohne jegliche Änderung. - Verwenden, um eine fluoreszenzbasierte Quantifizierung des Profils der Größenbereich der amplifizierten aRNA auszuwerten.
- Verwenden Sie das Spektralphotometer Instrument (bezogen auf die Absorption bei 260 und 280 nm), um die Konzentration der amplifizierten aRNA zu messen.
- Lagern Sie den verstärkten aRNA bei -80 ° C bis sie bereit zur Kennzeichnung.
- Verwenden Sie 2 ug amplifizierte RNA für die Fluoreszenzmarkierung gemäß ULS aRNA Labeling Kit Benutzerhandbuch.
HINWEIS: Da Cyanine 547 und Cyanine 647 Farbstoff empfindlich auf Photoabbau und Cyanine 647 Farbstoff leicht durch Ozon abgebaut wird, nimmt das Markierungsverfahren in einer minimalen Menge an Licht und unter einer ozonfreien Umgebung. - Schalten Sie den Ozonfeld (1A) , bis das Niveau des Ozons 0,001 ppm.
- Vorsichtig mischen und die Röhrchen in einem Thermocycler bei 85 ° C für 15 min. Proben auf Eis stellen für mindestens 1 min. Spin down zum Inhalt von Rohren zu sammeln, bevor sie mit RNA-Extraktions-Kits fortfahren, mit Ausnahme Schritte im Zusammenhang mit DNase-Behandlung (1,9 bis 1,11), die Cy-Farbstoff-markierte amplifizierte RNA zu reinigen.
- Verwenden Sie das Spektralphotometer Instrument zu messen und die Konzentration der markierten amplifizierten RNA bestimmen und halten Sie die markierten aRNA bei -80 ° C maximal für 3 Tage vor dem Gebrauch.
3. Microarray-Hybridisierung und Waschen
HINWEIS: Die folgenden wichtigen Schritte angepasst sind, nach Zwei-Farben-Biochip-basierten Genexpressionsanalyse-Protokoll (Version6.5, Mai 2010).
- In gleicher Höhe von 825 von jedem Cyanine ng 547- und Cyanine 647-markierte aRNA und mischen sich mit 25x Fragmentierung und 10x Blockierpuffer.
- Das Gemisch wird bei 60 ° C für 15 min und kühl auf Eis für 1 min.
- In die gleiche Menge von 2x Hybridisierungspuffer und gut mischen.
- Zentrifuge bei 13000 rpm, dann ist die Mischung fertig für die Hybridisierung.
- Last 100 & mgr; l aus der Mischung auf das Array Rutsche und versiegeln Sie die Folie im Inneren der Hybridisierungskammer.
- Laden die zusammengesetzte Kammer in den Hybridisierungsofen für 17 h bei 65 ° C bei 10 Umdrehungen pro Minute im Ofen zu drehen.
- Waschen Sie die Arrays gemäß Protokoll mit Ozonschutzbehandlung durch in Stabilisierung Tauchen und Trocknen Lösung für 30 s.
- Entfernen Sie die Felder aus der Lösung und stellen Sie sicher, dass der Array-Oberfläche ohne Staubpartikel trocken ist
4. Scanning Microarray Slide
- Halten Sie die Arrays in dunklen Ort und schalten Sie scanner bis es gebrauchsfertig (15 Minuten Wartezeit).
- Legen Sie das Array-Barcode auf der linken Seite, in den Scanner und Scanvorgang zu starten. Führen Sie die Analyse vor Ort nach dem Software-Benutzerhandbuch und speichern die Daten als (GPR) Dateiformat.
5. Statistische Analyse
- Laden Sie die Software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Klicken Sie auf "Import Rohdaten" und laden Sie die GPR - Dateien in FlexArray.
- Führen Sie die Normalisierung und die statistische Analyse bei Bedarf durch die Anweisung folgen. Hinweis: Berechnen Sie den Grenzwert für positive Punktauswahl in dieser Studie , wie es zuvor 22 beschrieben wurde.
- Wählen Sie das Drop-Down-Handbuch aus dem Grundstück Betrachter des FlexArray alle Signale, die die hybridisierten Spots und Hintergrund zu sehen. Hinweis: Ein ähnliches Bild von Spike bei den Kontrollen nach der Hybridisierung auf dem Microarray kann in früheren Studie 8 zu sehen.
- Wählen Sie einLöss Normalisierung innerhalb des Arrays durch ein Quantil zwischen Prozessanordnungen Normalisierung folgende von der FlexArray Drop-Down-Handbuch entsprechend.
- Exportieren Sie alle normalisierten Daten von FlexArray in eine Excel zur weiteren Verwendung einreichen.
6. Bioinformatik-Analyse
Die ursprüngliche Anmerkung der Sondensequenzen von Rinderembryonen spezifische Transkripte (BESTv1) Microarray zuvor 8 beschrieben worden ist . In dieser Studie, 20.403 einzigartige Gene Symbole (GS) wurden (erhalten Supplement File1 ) durch das EmbryoGENE Labor - Informations - Management - System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Eine Liste von 6765 einzigartige Gene ( Supplement File2 ) wurde auf die alle positiven Signale nach Microarray - Normalisierungsprozess (Schritt 5 ausgewählt und entsprach0,5) aus Rinder Tag 7 Embryonen Genexpressionsprofil. Positive Signalschwelle wurde berechnet basierend auf durchlässigen Veröffentlichung 16 von der Signalintensität eines A - Wert.
- Zur Funktionsanalyse mit PANTHER (Protein - Analyse durch evolutionäre Beziehungen) Klassifizierungssystem 23, 24, führen Sie über den folgenden Link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
- Laden Sie eine Liste von 6765 embryospezifischen GS spezifischen biologischen Prozess zu identifizieren , während der embryonalen Entwicklung mit Hilfe von statistischen Überrepräsentierung Test und verwenden Standardeinstellung von Bos taurus (alle Gene in der Datenbank) als Referenzliste 25.
HINWEIS: Dies ermöglicht die Identifizierung von entwicklungsbezogenen Prozesse von den GO Begriffe, die statistisch über- oder unterdrückten eine binomische Test. - Stellen Sie P-Wert Schwelle bei <0,05 als Software-Standard. Die Daten können heruntergeladen und Exportet in Excel - Datei zur weiteren Auswahl 16.
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Representative Results
Ein repräsentatives Ergebnis der Gesamt - RNA und verstärkt aRNA von Tag 7 Rinderembryonen ist in Abbildung 3 und zusammengefasst in Tabelle 1 dargestellt.
RNA-Integrität und das Profil kann nach der RNA-Extraktion beurteilt werden. Qualitätsbewertung von RNA könnte durch Bioanalyzer (3A) und nur diesen Proben mit RIN - Wert höher als 7,0 sind qualifiziert werden verwendet für die Amplifikation (Tabelle 1) durchgeführt werden.
Die Qualität und die Menge amplifizierter RNA sollte nach der Verstärkung ausgewertet werden. Die Ähnlichkeit der amplifizierte RNA - Profil und entsprechenden Größenbereich sind die wichtigsten Faktoren für die Qualitätskontrolle (3B). Nach zwei Runden der Amplifikation die amplifizierten RNA - Fragmente sind sehr ähnlich in Größe, im Bereich zwischen 200 und 800 bp (3B) undAlle Arnas ähnlicher Größenbereich werden für die weitere Fluoreszenzmarkierung ausgewählt. Auch ist eine erfolgreiche Amplifikation der ursprünglichen Gesamt - RNA mindestens mehr als tausendfache Erhöhung der aRNA (Tabelle 1) erhalten wurden .
Fluoreszenzmarkierungseffizienz kann entsprechend Markierungsgrad-Verhältnis berechnet werden. Die Formel ist in der ULS aRNA Labeling Kit Bedienungsanleitung zur Verfügung. Die Benutzerführung schlägt der Markierungsgrad Verhältnis sollte 1,0 sein - 3,6%, was darauf hinweist, dass ein durchschnittlich 1 - 3,6 ULS-Molekülen pro 100 Nukleotiden.
Die Bilddateien nach der Hybridisierung und Scannen kann von FlexArray betrachtet werden. Eine gute Qualität gescannte Bild nach Microarray - Hybridisierung und Waschen ist in 4A gezeigt. Wenn markierten Materialien niedriger oder höher als dieser Bereich sind, werden Signale zu niedrig sein, zu erkennen oder zu hohen Hintergrundwerten wird nach Scanni erkannt werdenng (4B).
In der aktuellen Studie wurde positive Signalschwelle bei 7,6 (Sondensignal höher als 7,6 oder Hintergrund <7,6 als positiv) gesetzt. Etwa 46% der Sondensätze repräsentieren 20.826 positive Punkte werden in der roten Farbe in Rinder-Tag 7 Embryonen (Abbildung 5) angegeben. Nach dem Entfernen unkommentierte und doppelte Gen Symbole, nur 6765 einzigartige Gen Symbole für PANTHER-Analyse gelassen wird.
Diese 6765 Gene repräsentieren die einzigartige RNA-Transkripte ausgedrückt in der 7. Tag Rinder Blastozyste. Um den biologischen Prozess spezifisch für Rinder-Blastozyste zu finden, wird PANTHER Überrepräsentation Test durchgeführt. Die Top - 10 - Gene Ontology (GO) Begriff IDs mit der höchsten fache Anreicherung Index ausgewählt wird (Abbildung 6). In der Regel stellen diese spezifischen GO Begriffe weitgehend den aktiven Zellteilungsprozess wie mitosis und Chromosomensegregation, die Regulierung des Zellzyklus und der Initiierung von cytoplasmatischen und mitochondriale Übersetzung.
Abbildung 1: Ozonfreie Box (A) und Array - Labeling - Reaktion (B). A) Ozone Free Box besteht aus einer Katalysatoreinheit , die die Luft rezykliert und zerstört Ozon und einen hochempfindlichen Ozonsensor die Ozonwerte in der Box während Microarray - Performance zu überwachen. B) Labeling Verfahren und Array - Hybridisierung durchführen im Strafraum von Ozon das fluoreszierende Cyanine 647 Farbstoff Abbau zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: PANTHER Gene Liste Analyse. Rote Pfeile zeigen die Fläche gefüllt werden müssen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Eine repräsentative Bioanalyzer Elektropherogramm von Gesamt - RNA (A) und das Gel Bild von Amplified RNA (B). A) Es werden Gesamtergebnis mit RIN - Wert, RNA - Konzentration und rRNA - Verhältnis. B) Das Profil von amplifizierte RNA nach zwei Runden Verstärkung. Amplifizierte RNA-Fragmente werden erwartet in einem Bereich zwischen 200 und 800 bp zu sein. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Bild von Array Intensitätskarte. (A) Ein gutes Bild eines Arrays Dia zeigt grünen und roten Kanal entsprechen 547 und Intensität Cyanine 647 Signale nach dem Scannen mit hoher Stelle Cyanin (angezeigt auf der linken Seite mit blau - grüne Farbe) und niedrigen Hintergrund (auf der rechten Seite mit dunkelblau angezeigt Farbe). (B) Ein schlechtes Bild eines Arrays Dia zeigt sehr hohe Hintergrundbild von roten Kanal (von der oberen Platte mit dem ähnlichen blau grüne Farbe aus dem Bild der Punkt Cyanine 647 Intensität angezeigt). Farbkarte zeigt die Intensität des Signals mit numerischen Werten an verschiedenen Farben entsprechen. Der Wert der Signalintensität ist die niedrigste im Bereich der dunkelblauen Farbe. Bitte klicken Sie hier eine große anzuzeigenr Version dieser Figur.
Abbildung 5: MA Parzelle zum Tag 7 von Rinderembryonen Genexpressionsprofil. 20.826 rote Flecken dargestellt positive Signale über den Hintergrundsignalen. Hintergrund-Spots sind in schwarzer Farbe hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Die Top 10 Gene Ontology (GO) Begriff IDs mit dem Höchsten fache Anreicherung Index. Diese spezifischen GO Begriffe repräsentieren weitgehend die aktive Zellteilung Prozess wie Mitose und Chromosomensegregation, die Regulierung des Zellzyklus und der Initiierung von cytoplasmatischen und mitochondriale translation. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Sample | Anzahl der Embryo | Art | Embryo morphologische Qualität | RNA - Konzentration (pg / ul) | RIN | Gebrauchte Gesamt - RNA für die Amplifikation (pg) | Amplified RNA - Konzentration (ng / ul) | ||||||||
| S1 | 4 | Blastozyste | Grade 1 & 2 | 101 | 8.6 | 858,5 | 3.498,4 | ||||||||
| S2 | 1 | Blastozyste | Note 2 | 142 | 7.4 | 1207 | 1.682,4 | S3 | 2 | Blastozyste | 1. Klasse | 135 | 8.8 | 1.147,5 | 3.185,3 |
| S4 | 3 | Blastozyste | 1. Klasse | 177 | 9 | 1.504,5 | 2.906,4 | ||||||||
| S5 | 5 | Blastozyste | 1. Klasse | 636 | 8.3 | 5406 | 3.437,5 | ||||||||
| S6 | 3 | Blastozyste | Grade 1 & 2 | 159 | 9.1 | 1.351,5 | 1.689,8 | ||||||||
| S7 | 3 | Blastozyste | 1. Klasse | 154 | 9 | 1309 | 4.507,1 | ||||||||
| S8 | 4 | Blastozyste | 1. Klasse | 304 | 8.5 | 2584 | 3.089,3 | ||||||||
| S9 | 5 | Blastozyste | 1. Klasse | 282 | 9.1 | 2397 | 3.917,8 | ||||||||
| S10 | 6 | Blastozyste | Grade 1 & 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | Blastozyste | 1. Klasse | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | Blastozyste | 1. Klasse | 206 | 9 | 1751 | 2.567,9 |
Tabelle 1: Probe und RNA - Informationen. Die Konzentration und die Qualität der RNA sollte nach der Extraktion ausgewertet werden. RNA-Integrität und Konzentration kann von jedem Bioanalyzers beurteilt werden. RNA-Integrität Zahl sollte mehr als 7,0 sein. Die RNA-Konzentration sollte durch Spektralphotometer Instrument nach Verstärkung untersucht werden. Embryo Qualität wurde gemäß dem Handbuch des Internationalen Embryo Transfer Society ausgewertet (3. Aufl., Savoy, IL).
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Discussion
Das erste Problem, Microarray-Analyse unter Verwendung von Tag 7 Rinderembryonen durchzuführen, ist nicht ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA immer Genexpression für das Studium. Traditionellen Phenol / Chloroform-RNA-Extraktion und Ethanol-Fällungsverfahren ist nicht für den Tag 7 Embryonen empfohlen, was zu einer geringen Ausbeute und mögliche Überbleibsel phenol inhibierende RNA-Amplifikationsreaktion. Stattdessen wird eine Standard-Spalte-basierte Methode ist besser Gesamt-RNA zu isolieren und dann die RNA mit einem Minimum an Elutionspuffer eluieren die Konzentration zu erhöhen. Ein Durchschnitt von 780 pg Gesamt - RNA pro Embryo wird in der aktuellen Studie erhalten , die mit anderen Berichten vergleichbar ist derzeit eine identische Methodik 26 und die gleiche RNA - Extraktions - Kits 27, 28 verwendet werden. Für die RNA-Extraktion, ist es empfehlenswert, vor Niederschlag zu lösen durch gründliches Mischen zu verwenden oder das Extraktionspuffer Phiole erwärmen der Extraktionspuffer vor dem Wieder auflösenbenutzen. Darüber hinaus ist die Inkubationszeit auch wichtig für die RNA-Ausbeute in Extraktionsschritt. Die Inkubationszeit weniger als eine volle 30 Minuten bei 42 ° C reduziert RNA-Ausbeute.
Auf Säule ist DNase Verdauung während genomischen DNA-Kontamination zu entfernen notwendig Gesamt-RNA-Reinigung. Die DNase-Enzym ist sehr empfindlich gegen vortex und zentrifugieren. Daher sollte DNase und Puffer durch sanftes Umdrehen gemischt werden.
Die Qualität der RNA ist sehr wichtig in Mikroarray-Analyse und Proben mit einem RIN niedriger als 7 sollte nicht für die Hybridisierung in Betracht gezogen werden. In der aktuellen Studie sind die Gesamt - RNA Profile von Bioanalyzers erhalten vergleichbar, die sich zuvor in den Studien aus Rinder Blastozysten 26, 27. Es lohnt sich zu beachten, dass dann, wenn zuvor schraffierten Embryonen, insbesondere RNA, hergestellt aus Eizellen und Embryonen vor dem mütterlichen zu embryonalen Übergang, der RIN-Wert ist oft niedriger als 7 im Vergleichzum Gesamt - RNA von Tag 7 Embryonen und dies ist aufgrund einer Variation in der 28S / 18S - rRNA - Verhältnis 27.
Die Menge der extrahierten RNA aus Rinderembryonen zur Plattform Hybridisierung nicht ausreichend ist, daher wird die RNA-Amplifikation erforderlich. Es gibt mehrere Methoden zur RNA - Amplifikation, wie PCR, in - vitro - Transkription (IVT) und Ribo-SPIA (Einzelprimer isothermen Amplifikation). Obwohl das letztere Verfahren ist schneller und in einem Tag bietet genügend Material für Arrays, benötigt sie mindestens 5 als ng Ausgangsmaterial 29. Daher wählten wir die IVT Methode , die 12 mit niedrigen Ausgangsmaterialien arbeiten kann (so wenig wie 100 pg). Außerdem wurde bereits erfolgreich getestet worden 29 aus bovine embryo extrahierte Gesamt - RNA zu amplifizieren. In der aktuellen Studie, unsere Amplifikationsverfahren erzeugt wurde ~ 28 ug amplifizierte RNA pro Embryo von 598 pg Gesamt-RNA pro Embryo. additioschließlich, nach der zwei Runde der Verstärkung, unsere Proben zeigten ein ähnliches Profil und entsprechenden Größenbereich (zwischen 200 und 800 bp) , die 13 mit früheren Studien einverstanden sind, 15.
In diesem Protokoll verwendeten wir eine nicht-enzymatische Markierungsprotokoll, Platin-linked Cyanin (Cyanine 547 und Cyanine 647) Farbstoffe. Dieses Verfahren ermöglicht die Kennzeichnung von verstärkten oder unverstärkten RNA. Mit Verstärkungsschritt vor der Markierung ermöglicht die Verwendung natürlicher Nukleotide, was zu höheren Ausbeuten RNA verstärkt, Bias reduzieren und längere Fragmente erzeugen im Vergleich zu enzymatischen Verfahren. Die Cyanine 547 und Cyanine 647 Farbstoffe sind häufig Fluoreszenzfarbstoffe für zweifarbige Array empfehlen. Allerdings ist Cyanine 647 Farbstoff Ozonabbau empfindlich. Hand Ozon-Monitor sollte unbedingt das Niveau von Ozon unter 2 ppb zu machen verwendet werden. Darüber hinaus Staub ist freie Umgebung notwendig Staubpartikel fallen in Hybridisierungslösung zu vermeiden oder during Scannen.
Microarray-Experiment kann in ein- oder zweifarbige Ansatz gestaltet werden. Jede experimentelle Ansatz hat einige Vorteile und Nachteile. Zweifarben-Designs eine deutliche Reduzierung der Variabilität und Hintergrundrauschen, ermöglicht den direkten Vergleich und für Loop-Designs mit einer gemeinsamen Referenzprobe definieren. Obwohl Farbstoff spezifische Verzerrungen im wesentlichen Ergebnisse beeinflussen können, wenn Experimente durchgeführt werden, unter Verwendung von Zweifarben-Designs können diese Verzerrungen durch die Durchführung Farbstoff Swaps gemildert werden. Solche technischen Replikation fügt experimentellen Kosten, sondern kann bei der Messung unterschiedliche Expression 31 sowohl Genauigkeit und Empfindlichkeit zu verbessern.
Im Vergleich zu anderen Bioinformatik - Software (wie gorilla) PANTHER ermöglicht den Vergleich Datensatz mit Bos taurus Genom als Referenz. Unsere Ergebnisse zeigen, dass bei Tag 7 Rinder- Embryonalentwicklung sind die folgenden biologischen Komponenten und Funktionen beteiligt: Regulierung der Metaphase / ANAPhase Übergang des Zellzyklus, die Regulierung von mitotischen Metaphase / Anaphase Übergang, der Regulierung der Chromosomensegregation, mitochondriale Übersetzung, Protein K48-verknüpften Ubiquitinierung, ER Vesikel-vermittelten Transport, nuklear transkribierten mRNA katabolen Prozess, Translationsinitiations, mitotische Schwesterchromatiden Segregation Golgi , mitotische Kernteilung.
Die Protokolle, die in diesem Papier, aus Fluoreszenzmarkierung der amplifizierten RNA zur Abtastung von Arrays sollten zusätzliche Sensibilisierung der genannten Umweltfaktoren ausgeführt werden, um hohe Qualitätsdaten zu erhalten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
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