Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

والأحيائي بسيط لتقييم العوامل الأوعية الدموية غشائي النمو

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

نحن تصف الأحيائي القائم على خلية بسيط للكشف، قياس ورصد النشاط من أعضاء البطانية الأسرة عامل نمو الأوعية الدموية بروابط. يستخدم فحص مستقبلات خيالية أعرب في خط الخلية التي تعتمد على عامل أن يقدم تقييما شبه كمي أو الكمي للمستقبلات ملزمة وعبر ربط بواسطة يجند.

Abstract

تحليل تحركات مستقبلات التيروزين وبروابط التفاعل على المشاركة في البيولوجيا الأوعية الدموية غالبا ما يكون صعبا بسبب التعبير التأسيسي للعائلات مستقبلات ذات الصلة، مجموعة واسعة من بروابط ذات الصلة، وصعوبة التعامل مع الثقافات الأولية من الخلايا البطانية المتخصصة. نحن هنا وصف الأحيائي للكشف عن بروابط إلى عامل النمو البطاني الوعائي مستقبلات-2 (VEGFR-2)، محول رئيسي للإشارات التي تعزز الأوعية الدموية وlymphangiogenesis. وأعرب كدنا] ترميز الانصهار في المنطقة خارج الخلية (ملزم يجند) من VEGFR-2 مع الغشاء والمناطق هيولي من مستقبلات الإريثروبويتين (EpoR) في خط الخلية التي تعتمد على عامل با / F3. ينمو هذا الخط خلية في وجود انترلوكين 3 (IL-3) والانسحاب من هذا العامل النتائج في موت الخلايا خلال 24 ساعة. التعبير عن / EpoR مستقبلات الانصهار VEGFR-2 يوفر آلية بديلة لتعزيز بقاء وامكاناتهاLLY انتشار الخلايا با / F3 ستابلي في وجود يجند قادرة على ربط وعبر ربط جزء خارج الخلية من البروتين الانصهار (أي واحد يمكن أن عبور الارتباط المنطقة خارج الخلية VEGFR-2). الفحص لا يمكن أن يؤديها بطريقتين: نهج شبه الكمية التي كميات صغيرة من يجند وخلايا تسمح نتيجة سريعة في 24 ساعة، والنهج الكمي التي تنطوي على علامات بديلة من عدد الخلايا قابلة للحياة. فحص من السهل نسبيا على القيام بها، هو استجابة للغاية أن تعرف VEGFR-2 بروابط ويمكن أن تستوعب مثبطات خارج الخلية من VEGFR-2 الإشارات مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لمستقبلات أو بروابط، والفخاخ يجند القابلة للذوبان.

Introduction

عائلة عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) من عوامل النمو بروتين يفرز والمشابهة مستقبلات سطح الخلية التي هي مجموعة هامة ومتنوعة من بروابط القابلة للذوبان ومستقبلات جزءا لا يتجزأ من غشاء، على التوالي أن وظيفة في transducing إشارات عبر الأغشية الخلوية. أنها تعمل بشكل رئيسي في الخلايا البطانية ولكن أيضا في خلايا المنشأ الظهارية وتلك من 1،2 الجهاز المناعي. مسارات الإشارات تعمل بواسطة مستقبلات تنشيط يجند VEGF (VEGFRs) تعتبر بالغة الأهمية في الأمراض الرئيسية، مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر والسرطان، والعلاجات التي تستهدف منهم في الاستخدام السريري المتكرر (على سبيل المثال، فإن الأجسام المضادة بيفاسيزوماب وحيدة النسيلة الذي يستهدف VEGF-A) 3،4.

واحدة من تعقيدات الأسرة VEGF هو تنوع بروابط القابلة للذوبان الموجودة في الطبيعة (VEGF-A، VEGF-B، VEGF-C، VEGF-D، والبروتينات عامل نمو بطانة الاوعية المشفرة بواسطة ORF parapox عائلة الفيروسات وسم الأفعى VEGF، بالإضافة إلى الآخر مكبحالإسوية من VEGF-A) 2.

هذه بروابط تتفاعل مع ثلاثة من أفراد عائلة مستقبلات التيروزين كيناز، وهي VEGFR-1، VEGFR-2 وVEGFR-3. يتم التعبير عن هذه المستقبلات بنسب مختلفة على أنواع مختلفة من الخلايا ولكن غالبا ما تشارك في أعربت على سطح الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية واللمفاوية من جميع الأحجام 5. VEGFR-2 يمكن ربط الثدييات بروابط VEGF-A 6، VEGF-C 7 و VEGF-D 8،9 وكذلك فيروس ORF VEGF 10 و سم الأفعى VEGF 11. VEGFR-2 يلعب دورا رئيسيا في دفع عجلة الأوعية الدموية (نمو أوعية دموية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا) في التطور الجنيني، التئام الجروح والسرطان وأمراض العيون. في هذه السياقات، بروابط مثل VEGF-A، -C و-D ربط وتفعيل مستقبلات على خلايا الدم بطانة الأوعية الدموية 12-15. على الخلايا البطانية اللمفاوية، يلعب VEGFR-2 دورا في lymphangiogenesis، وتشكيل الأوعية اللمفاوية الجديدة 16. VEGFR-2 يمكن أيضا أن تعزز تمدد وتوسع الشرايين والأوعية اللمفاوية الرئيسية في الأنسجة السليمة ومرض 17. فهم كامل من VEGFR-2: التفاعلات يجند غير ذلك من المهم لتطوير مثبطات لاستخدامها في علاج الأمراض التي تعتمد على الأوعية الدموية 18. في حين أن معظم الأشكال الإسوية من VEGF-A ربط لVEGFR-2، مطلوب انشقاق بروتين عامل نمو بطانة الاوعية-C وVEGF-D لاطلاق سراح جزء يتكون من المجال VEGF-التماثل التي يسلك قابلية عالية ملزما للVEGFR-2 19،20.

لقد قمنا بتطوير الأحيائي لمراقبة بروابط من VEGFR-2 التي تم تصميمها للتحايل على الحاجة إلى الخلايا الأولية البطانية، والتي يصعب من الناحية الفنية لمرور، ومكلفة لشراء والثقافة (التي تتطلب المتوسطة المتخصصة) 21 والتعبير عن VEGFRs متعددة والمشارك المرتبطة مستقبلات 22. Heterodimerization من VEGFR-2 مع مستقبلات عامل نمو بطانة الاوعية أخرى أو شارك في مستقبلات يمكن أن يسبب التعقيدات غير المرغوب فيه عندما تهدف إلى مسمارالتفاعلات ذ الثنائية مستقبلات يجند، وتقييم النشاط تعزى إلى مستقبلات محددة، أو تقييم أثر الكواشف المثبطة. 23. الأحيائي يحتفظ تنقل مستقبلات ذات الصلة في غشاء الخلية ويسمح تقييم قدرة يجند لربط وصلة عبر المنطقة خارج الخلية VEGFR-2.

يعتمد الأحيائي على خلق مستقبل خيالية في الذي تنصهر المنطقة خارج الخلية من مستقبلات عامل نمو بطانة الاوعية (في هذه الحالة VEGFR-2) إلى الغشاء والمناطق داخل الخلايا مستقبلات الإريثروبويتين (EpoR)، وهو عضو في عائلة مستقبلات خلوى 8،24. ثم يتم التعبير عن هذا البروتين الانصهار في خط خلية للمحترفين-B التي تعتمد على عامل با / F3، التي التحفيز مع يجند قادرة على ربط وعبر ربط المجال خارج الخلية من مستقبلات يسبب تنشيط المنطقة المستجيب حشوية، والتي هي قادرة على من transducing إشارة البقاء على قيد الحياة عن طريق يانوس تحركات (JAKs) لتعزيز خليةالبقاء على قيد الحياة و / أو انتشار الأسلحة النووية. في المقابل، تعبيرا عن كامل طول VEGFR-2 في نفس نوع من الخلايا، والتحفيز مع يجند، لا تعزز بقاء الخلايا وانتشار، مشيرا إلى أن المؤثرات الإشارات القريبة من مسار VEGFR-2 غير متوفرة في هذا نوع من الخلايا.

وقد استخدمنا الفحص في مجموعة متنوعة من السياقات لاستكشاف ملزمة من رواية VEGFR-2 بروابط 10،19،20،24-29. في توليفة مع VEGFR-3-EpoR با / F3 فحص ذلك قمنا بالمقارنة أنشطة النسبية للVEGF-C وعوامل النمو VEGF-D للربط وعبر ربط VEGFR-2 وVEGFR-3 30. وقد استخدم الاختبار لتميز النشاط المثبطة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لVEGFR-2 أو VEGF-D، قابل للذوبان VEGFR-2 فخ وpeptidomimetics التي تستهدف الأسرة VEGF 31. تم استخدام الفحص أيضا لإظهار قدرة VEGFs من مختلف سلالات فيروس ORF إلى ربط وعبر رابط VEGFR-2 قبل الاختبار في الخلايا البطانية الابتدائية 25 أو عندما بروتوكولات تقييم للنمو تنقية عوامل 27.

مقايسة وصفنا من السهل القيام بها، ونسخة شبه الكمي يسمح للقرارات سريعة مطلوبة في بعض الأحيان عندما مراقبة الإنتاج أو تنقية عوامل النمو، والأجسام المضادة أو المجالات مستقبلات للذوبان لتجارب أخرى. سهولة الاستخدام للمقايسة يجعلها عنصرا مكملا مثاليا لإجراء المزيد من الدراسات وأكثر اكتمالا القيام بها مع الخلايا البطانية الأولية المشتقة من الدم أو الأوعية اللمفاوية من أنسجة معينة أو أجهزة الجسم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

متوسط ​​مكيفة WEHI-3D ​​مصدر IL-3 وإعداد

ملاحظة: الماوس المحببات خط خلية سرطان الدم WEHI-3D ​​هو مثقف لتوليد المتوسطة مكيفة تحتوي على IL-3.

  1. ثقافة WEHI-3D ​​في Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ منذ فترة طويلة الحياة الجلوتامين ملحق، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. تطعيم 5 × 10 6 الخلايا في مرحلة سجل النمو إلى 50 مل من مستنبت الطازجة في T175 سم 3 الأنسجة قارورة الثقافة وتنمو لمدة 7 أيام أو حتى مرت الخلايا مرحلة سجل نموها بنحو 24 - 48 ساعة (تجنب موت الخلايا المفرط في الثقافة). وسائل الإعلام مكيفة هو قادر على تخزينها لعدة سنوات في -20 درجة مئوية، لذلك دفعات من 200-500 مل يمكن أن تنتج في وقت واحد.
  2. صب السوائل والخلايا من قوارير وتدور في 1000 ز س لمدة 15 دقيقة لإزالة الخلايا والبقايا الخلوية. إزالة أعلى 90٪ من supernatant. تصفية من خلال وحدة 0.22 ميكرون فلتر.
  3. قسامة WEHI-3D ​​المتوسطة مكيفة (CM) في 1 مل و 50 مل و 200 مل مجلدات لتخزين في -20 درجة مئوية أو -70 درجة مئوية. قسامات أصغر مفيدة لإعداد مقايسة، كميات متوسطة لصنع مستنبت لمرور خطوط الخلايا التي تعتمد على عامل، وكميات أكبر للتخزين على المدى الطويل. IL-3 غير مستقرة نسبيا في 4 درجات مئوية ويمكن تخزين المتوسطة إذابة ذلك لبضعة أسابيع إذا ما استخدمت تحت ظروف معقمة.
  4. بدلا من ذلك، استخدم الماوس المؤتلف IL-3 عند مستويات 50 نانوغرام / مل المخفف في مستنبت، بعد أن تمت تصفيتها من خلال وحدة 0.22 ميكرون فلتر.

2. الثقافة وتقييم VEGFR-2-EpoR با / F3 وتحكم با خطوط خلية / F3

  1. سيطرة ثقافة خلايا با / F3 في DMEM، و 10٪ FBS، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين أو البنسلين / تكملة الستربتومايسين، 1٪ واستقرت L-الجلوتامين و 10٪ WEHI-3D-CM. خلايا مرور في 1:15 التخفيفات حول كل ثلاثة أيام من خلايانموا في مرحلة السجل.
  2. ثقافة الخلايا VEGFR2-EpoR با / F3 في DMEM، و 10٪ FBS، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، استقرت 1٪ L-الجلوتامين و 10٪ WEHI-3D-CM و 1 ملغ / مل G418. خلايا مرور في 1:15 التخفيفات من نمو الخلايا في مرحلة السجل. انظر 24 لمزيد من التفاصيل حول بناء والتعبير عن مستقبلات خيالية.
  3. السيطرة الحصاد با / F3 أو VEGFR2-EpoR با خلية / F3 من الثقافات منتصف السجل المرحلة. ماصة بلطف لإزالة هذه الخلايا غير ملتصقة من أسفل القارورة. يغسل ثلاث مرات في الماوس تحظرب الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة 7.3 (PBS)، (10 مل، الطرد المركزي في 750 ز س لمدة 5 دقائق لاسترداد بيليه الخلية) لإزالة المتوسط ​​تحتوي IL-3.
  4. غسل خلايا مرة واحدة مع DMEM ومواد مضافة، من دون WEHI-3D-CM أو IL-3 المؤتلف، ثم resuspend في هذه الوسيلة عند تركيز 7.4 × 10 4 خلية / مل (أي 1000 خلية لكل 13.5 ميكرولتر، 10000 خلايا لكل 135 ميكرولتر على النحو الذي يحدده العد باستخدام عدادة الكريات) لاستخدام في الإصدارات شبه الكمية أو الكمية للفحص على التوالي.
  5. تقييم الخلايا للجدوى من الاستبعاد التريبان الأزرق (تنبيه). مزيج التريبان الأزرق في برنامج تلفزيوني (0.4٪) 1: 1 مع السكان الخلية وعدد لا يقل عن 100 الخلايا على عدادة الكريات. وتعتبر الخلايا التي تناول الصبغة القتلى أو الموت. مطلوب بقاء أكبر من 98٪ إلى إجراء فحص.

3. الفحص شبه الكمية

  1. إضافة خلايا غسلها (1000 خلايا) الواردة في 13.5 ميكرولتر من المتوسطة IL-3-نقص في الآبار لوحة microwell 72-جيدا في RT. الحرص على خلط تعليق خلية خلال aliquotting لضمان تصفية خلية عن طريق الجاذبية لا تركيز خلية التحيز. استخدام معايرة جيدا P20 الآلي ماصة، ونصائح تعقيمها.
  2. إضافة عينات الاختبار والضوابط إلى الآبار في حجم 10٪ (1.5 ميكرولتر، مما يجعل الحجم النهائي من 15 ميكرولتر تحتوي على 1000 خلية لكل جيدا) باستخدام ماصة P20 معايرة أو من الأفضل، P2 ماصة. خذ كاليفورنياإعادة لضمان أن عينات متوافقة مع الظروف الثقافة لخلايا با / F3 من حيث درجة الحموضة والملح وغيرها من المواد التي لها تأثير السامة للخلايا / تثبيط الخلايا. حيثما كان ذلك ممكنا، واستخدام وسيلة متوافق أو المخزن المؤقت (على سبيل المثال، DMEM أو برنامج تلفزيوني، على التوالي) أو تمييع هذه الوسائط أو العازلة. سوف سحن مع نفس الطرف ضمان خلط.
  3. لعينات السيطرة، وتشمل (ط) متوسطة وحدها تحتوي على أي IL-3؛ (ب) وأضاف WEHI-3BD-CM والمتوسطة وحدها في الحجم النهائي 10٪. و / أو (ج) VEGF-A تضعف إلى 100 نانوغرام / مل في المتوسط ​​وحده، لا تحتوي على IL-3.
  4. ملء أي الآبار غير المستخدمة من لوحة microwell مع الماء المعقم، في برنامج تلفزيوني أو المتوسطة ووضع لوحة داخل حاوية ترطيب (مع الماء المنقوع المناديل الورقية) مما يسمح بتبادل الغازات. احتضان الخلايا داخل حاويات في جو مرطب من 10٪ CO 2. هذا الاختبار يمكن تعيين مريح يصل في 3 ساعات قبل شخص واحد إذا هي عينات الاختبار ومكوناته وسائل الإعلام المتاحة.
  5. تقييم لوحات عادة بعد 16 ساعة منحضانة الذي التمييز الوقت بين العينات الإيجابية والسلبية واضح. انظر الشكل 3 للحصول على أمثلة من كيفية ظهور الخلايا في الثقافة. تحليل لوحات باستخدام معيار مقلوب المجهر على النقيض من المرحلة في 40-100 × التكبير.
    ملاحظة: ويلز التي تحتوي على عوامل النمو الداعمة مثل IL-3 أو VEGF-A وتحتوي على خلايا التي تظهر جولة وشفافة. سوف الآبار دون عوامل النمو الداعمة أو مع المتوسط ​​وحده قد خفضت أعداد الخلايا المستديرة، وكذلك الخلايا الميتة أو التي تحتضر والحطام الخلوي (على سبيل المثال، الشكل 3C). تقييم الفحص في 24-48 ساعة بعد الحضانة هو الأمثل للحساسية.

4. الكمية الأحيائي

  1. إضافة خلايا غسلها (10،000 الخلايا في 135 ميكرولتر) في IL-3-نقص المتوسطة إلى الآبار لوحة microtiter 96-جيدا القياسية في RT. الحرص على خلط تعليق خلية خلال aliquotting لضمان تصفية خلية عن طريق الجاذبية لا يؤثر متركيز ليرة لبنانية.
  2. إضافة عينات الاختبار والضوابط إلى الآبار في حجم 10٪ (15 ميكرولتر) باستخدام ماصة معايرة (P20). الحرص على التأكد من أن عينات متوافقة مع الظروف الثقافة لخلايا با / F3 من حيث درجة الحموضة أو الملح أو غيرها من المواد السامة للخلايا يحتمل أن تكون / تثبيط الخلايا. حيثما كان ذلك ممكنا، واستخدام وسيلة متوافق أو المخزن المؤقت (على سبيل المثال، DMEM أو برنامج تلفزيوني) أو تمييع هذه الوسائط أو العازلة. فلتر تعقيم كميات صغيرة باستخدام 0.22 ميكرون المسام خلات السليلوز أنبوب الطرد المركزي تصفية وحدة.
  3. احتضان خليط من الخلايا، عوامل النمو و / أو المانع وكلاء في جو مرطب من 10٪ CO 2 لمدة 48 ساعة. إجراء فحص داخل حاوية مرطب يحتوي على المناديل الورقية غارقة في المياه وتسمح الغاز الصرف. عند الانتهاء من فترة الحضانة، وتقييم الفحص باستخدام إحدى الطرق البديلة المدرجة أدناه والتي هي علامات بديلة من عدد الخلايا قابلة للحياة في البئر.
  4. البديل رقم 1: 3 H-thymidiشمال شرق التأسيس
    ملاحظة: تم تصميم هذا القياس الكمي لتنسيق لوحة 96-جيدا.
    1. بعد مرور فترة الحضانة لوحات فحص لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية (حجم 150 ميكرولتر لكل بئر)، إضافة 3 H-الثيميدين في حجم 50 ميكرولتر من المتوسطة فحص (با / F3 الثقافة وسيط وبدون IL-3 / WEHI-3D ​​CM) لكل بئر بتركيز 20 μCi / مل، وإعطاء الجرعة النهائية من 1 μCi لكل بئر.
    2. احتضان لوحات ل4 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية قبل حصاد الخلايا باستخدام حصادة الخلية. استخراج عينات فردية عن طريق وضع المرشحات في scintillant وقياس مع السائل التلألؤ عداد.
  5. البديل رقم 2: كشف ضوء بارد من الخلوية ATP
    ملاحظة: يستخدم هذا النهج كاشف مراقبة ATP التي عند دمجها مع الخلايا المحللة يمكن أن تولد إشارة تلألؤ بيولوجي الذي يعكس خلايا قابلة للحياة في عدد السكان.
    1. خلايا ليز لاستخراج ATP واستخدام كاشف رصد اعبي التنس المحترفين لتوليدإشارة الانارة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. قراءة التألق باستخدام luminometer متوافق مع شكل لوحة 96-جيدا.
  6. البديل رقم 3: الحد الأنزيمية لصبغ المؤشر من قبل خلايا قابلة للحياة
    ملاحظة: فحوصات ريسازورين مقرها تظهر علاقة جيدة لبقاء الخلية.
    1. الجمع بين الخلايا المستزرعة مع صبغ أساس ريسازورين وتحديد فحوصات باستخدام قارئ لوحة مضان وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا القسم، وتبين لنا نتائج التجربة يدل على السمات الأساسية لالأحيائي VEGFR-2-EpoR با / F3 (انظر الشكل رقم 1 لمبادئ الفحص). وتبين الدراسات التي نشرت غيرها من التطبيقات الأوسع للفحص عن بديلة VEGFR-2 بروابط، جزيئات VEGF متحولة والاجسام المضادة المثبطة 8،10،19،24-30.

البيانات المقدمة هنا تمثل الفحص الذي يتم استخدام VEGFR-2-EpoR با / F3 الأحيائي لقياس نشاط بروابط الإنسان المؤتلف ثلاثة (VEGF-A 165، VEGF-C وVEGF-D) مع خصوصية لVEGFR -2 في وجود الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المثبطة (بيفاسيزوماب) لVEGF-A تم تطبيع 165. البيانات مقابل استجابة لعامل نمو بطانة الاوعية-A 165 وحده (الشكل 2). كما هو متوقع، ومنعت بيفاسيزوماب تأثير عامل نمو بطانة الاوعية-A 165 في الفحص، ولكن لم يكن لها تأثير على نشاط VEGF-C وVEGF-D.

في النسخة شبه الكمي للفحص أو عند مراقبة الفحص أثناء تطورها، وعرض الفحص باستخدام معيار مقلوب المرحلة المجهر يمكن أن توفر معلومات قيمة حول سير الفحص. تحليل لفحص (الشكل 3) يبين جدوى جيدة من VEGFR-2-EpoR با / خلايا الأحيائي F3 عندما حضنت مع المتوسط ​​تحتوي IL-3، أو يجند لVEGFR-2، على سبيل المثال، VEGF-A. هذه الخلايا هي كبيرة وشفافة، وليس هناك دليل أو أدنى من التفاصيل في السيتوبلازم الخلوي أو الحطام الخلية في الثقافة. في البئر مع عدم وجود عوامل نمو إضافية هي بالفعل هناك دليل على انخفاض أعداد الخلايا وعدد قليل من الخلايا السليمة. خلايا الحاضر ما تحبب كبير في السيتوبلازم والحطام الخلية هو سمة ثابتة من الثقافة. بعد 48 ساعة هناك أي علامة على خلايا قابلة للحياة.

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل 1

الشكل 1. الرسم التخطيطي اصفا مبادئ VEGFR-2-EpoR با / F3 الأحيائي. (أ) الخلايا با / F3 والتي تعتمد على عامل ويتطلب عامل نمو خارجي مثل IL-3 لتحفيز نمو الخلايا / الجدوى عبر الذاتية IL-3 مستقبلات ويشير مسار جاك. إذا ما يعبر عنه EpoR في هذه الخلايا الإنقاذ يمكن أن يحدث أيضا من خلال مسار جاك. التعبير عن كامل طول مستقبلات التيروزين كيناز مثل VEGFR-2 النتائج في الحد الأدنى من الإشارات كأهداف المصب VEGFR-2 تنشيط لا تشارك في مسار جاك. ومستقبلات خيالية مع المنطقة خارج الخلية من VEGFR-2 تنصهر فيها إلى المناطق الغشاء وحشوية من EpoR، عندما transfected في الخلايا / F3 با وحفز مع محددة VEGFR-2 بروابط، غير قادرة على تفعيل مسار جاك وخلية القيادةالبقاء على قيد الحياة والانتشار. (ب) VEGFR-2-EpoR با خلية / F3 تعبر عن مستويات عالية من مستقبلات VEGFR-2-EpoR خيالية والتي يمكن قياسها كميا باستخدام التدفق الخلوي. مرة واحدة غسلها من IL-3 تحتوي على المتوسط، وتوضع الخلايا في مجموعة متنوعة من الظروف والثقافة التي تدفع إما البقاء على قيد الحياة / تكاثر الخلايا. Untransfected خلايا با / F3 أو VEGFR-2-EpoR با / خلايا F3 دون عوامل النمو المحددة تفشل في النمو / البقاء على قيد الحياة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2

الشكل 2. تم المصنف تقييم VEGFR-2 الليجندات في / F3 الأحيائي. IL-3-تعتمد خلايا / F3 VEGFR-2-EpoR با با تعبر عن الماوس VEGFR-2-EpoR الوهم في وسيط وبدون IL-3 (باستثناء إلىفرعية + IL-3، كما هو مبين)، بالإضافة إلى عامل نمو بطانة الاوعية-A البشري 165، VEGF-CΔNΔC (VC) (هذا هو شكل من أشكال VEGF-C الذي يتكون من المنطقة الوسطى ويستبعد N و C-محطة propeptides)، أو VEGF-DΔNΔC (هذا هو شكل من أشكال VEGF-D الذي يشمل المنطقة الوسطى ويستبعد N و C-محطة propeptides (VD)) في 100 نانوغرام مل وأنسنة تحييد وحيدة النسيلة الأجسام المضادة بيفاسيزوماب / (الذي يربط ويمنع VEGF-A، ولكن ليس VEGF-C أو VEGF-D)، أو السيطرة غير تحييد الأجسام المضادة تراستوزوماب، كما هو مبين في 0.75 ميكرومتر. NF = المتوسطة التي لا تحتوي على عوامل النمو إضافية. وبعد ثمانية وأربعين ساعة، كان كميا النسبي عدد الخلايا الحية باستخدام الكشف عن تلألؤ بيولوجي للاعبي التنس المحترفين الخلوي. تمثل القضبان العمودية وسيلة (تطبيع مقابل استجابة لعامل نمو بطانة الاوعية-A 165 وحده، شريط الأول) والخطأ المعياري للمتوسط ​​لثلاث تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لضدiew نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)

الرقم خلايا 3. VEGFR-2-EpoR با / F3 تعتمد على عوامل النمو الخارجية من أجل البقاء. أمثلة من VEGFR-2-EpoR با / F3 الأحيائي التي IL-3-تعتمد با خلية / F3 معربا عن الماوس VEGFR- تم المصنف الوهم 2-EpoR في المتوسط ​​(A) التي تحتوي على 10٪ WEHI-3D ​​المتوسطة التي توفر IL-3، (ب) 100 نانوغرام / مل VEGF-A (لا IL-3)، أو (ج) المتوسطة البشري 165 مع مكيفة لا IL-3 أو عوامل نمو إضافية. ويصور ثقافة 24 ساعة في الفحص تبين خلايا قابلة للحياة غاية في وجود IL-3 (A) أو VEGF-A 165 (ب)، في حين أنه في ثقافة بلا IL-3 أو عوامل نمو إضافية (C) موت الخلايا و أحمرuced جدوى واضحة بوضوح. الميزان الحانات هي 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مقايسة الموصوفة هنا يعتمد على استخدام خلايا الجدوى العالية، والتي تعتمد على عوامل النمو. لذا الخلايا تحتاج إلى أن تكون تربيتها بعناية للتأكد من أنها تعتمد على عامل، والاحتفاظ بها التعبير عن مستقبلات خيالية. ضمان المتوسطة وتقدم طازجة وليس تخزينها لفترة طويلة للغاية، وأنه WEHI-3D ​​CM نشطة للغاية هو المهم. لا بد من غسلها جيدا من IL-3 تحتوي على المتوسط ​​في المتوسط ​​فحص للتأكد من عدم المتبقية IL-3 يلوث فحص عند تعريض الخلايا إلى بروابط إنقاذ الخلايا. كما بروابط يمكن أن تأتي في عدة أشكال مختلفة، تحتاج إلى أن تؤخذ عند إعداد هذه ليعاير الرعاية. المواد الحافظة، والعوامل المضادة للبكتيريا والملح أو مخازن درجة الحموضة المختلفة التي يمكن أن تؤثر على الفحص، وهذا هو السبب في اختبار الموازي للخلايا با / F3 untransfected يمكن إبلاغ عن القضايا المتعلقة العازلة.

نحن نستخدم كل من البروتوكولات شبه الكمية والكمية. شبه quantitatiلقد فحص يسمح للتقييم السريع للنشاط العينات قبل ارتكاب لفحص الكمية بالكامل الأمر الذي يتطلب المزيد من الوقت وعينة. يتم استخدام الأسلوب الكمي حصرا عند إنشاء البيانات للنشر. الطرق البديلة للكشف عن صلاحية الثقافة هي واضحة نسبيا. وقد تم تكييف الفحص الكمي لعدد من الأشكال المختلفة لتقدير الانتشار، واستخدمنا (3- (4،5-Dimethylthiazol-2-YL) -2،5-Diphenyltetrazolium الميثيل) MTT 30، كشف تلألؤ بيولوجي الخلوية ATP (غير منشورة)، صبغ القائم على ريسازورين (الشكل 2) و 3 H-الثيميدين 31 مع النجاح. في السنوات الأخيرة قمنا تطورت بعيدا عن استخدام الإشعاع على التكيف مع النهج تلألؤ بيولوجي واستخدمت للصباغة على أساس ريسازورين المقرر أن فعاليتها من حيث التكلفة. كل من النهج تعطي نتائج مناسبة وقد يتوقف الاختيار على مدى توفر الكواشف ولssociated القراء لوحة المتخصصة في إعطاء مختبر / المعهد أو الألفة مع نهج معينة.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها تدور حول النشاط من ثلاثة عناصر رئيسية للمقايسة، ط) IL-3 سم، ب) خلايا VEGFR-2-EpoR با / F3 والثالث) بروابط محفزة. ضعف مستويات IL-3 في سم بسبب عدم كفاية خلايا WEHI 3D في الثقافة الأولية، وظروف التخزين السيئة، والإفراط في دورات تجميد ذوبان أو استخدام في عالية جدا تخفيف يمكن أن تخلق ثقافات بطيئة النمو التي من شأنها أن تعيق الفحص. وعادة ما يتم الكشف عن هذه في آبار المراقبة كما السكان الخلية تنمو ببطء، وفقدان العادي مظهرهم مشرق وجولة. وVEGFR-2-EpoR با / خلايا فحص F3 يمكن أن يفقد التعبير سطح الخلية لبناء خيالية مع مرور الوقت إذا كان يحتفظ بها في الثقافة لفترات طويلة. الحفاظ على عدد لا بأس به من أسهم النيتروجين السائل يسمح ثقافات جديدة من الخلايا معربا عن درجة عالية من مستقبلات خيالية لتكون متاحة في جميع الأوقات. إذا كنت بحاجة لسكان معربا عن أعلى مستوى يمكن أن يكونتحقق من خلال زراعة خلايا في VEGFR-2 بروابط واختيار السكان معربا عن مستويات عالية من مستقبلات خيالية عن طريق التدفق الخلوي الفرز. ثم يتم توسيع نطاق استخدام هذه الخلايا في الثقافة لتجميد.

في حين أن الأسلوب هو بديل مناسب ومبسط لتحليل التفاعلات مع المجال خارج الخلية VEGFR-2 لا يمكن أن ينظر إلى محل تجارب أكثر تطورا حيث سبرت مستقبلات الأصلي على الخلايا البطانية الأولية في وجود VEGFRs البعض، وشارك في مستقبلات مثل neuropilins. الخلايا التي يستند إليها هذا الاختبار (خلايا B) تختلف عن الخلايا البطانية وبالتالي لا ينبغي استخدامها لدراسة مسارات الإشارات حشوية وعوامل النسخ التي تستجيب لVEGFR-2 تنشيط الخلايا البطانية. ومع ذلك، يوفر طريقة نهجا مفيدا لتحليل التفاعل بين مستقبلات يجند التي تقع بين فحص ملزم بسيط هو أن يدرس تفاعل يجند مع رجب يجمدتور بناء (مثل منطقة مستقبلات للذوبان الخلية أو منطقة خارج الخلية المستقبلة لتنصهر المناعي)، وتحليل مستقبلات ملزمة والآثار المصب ينظر في المقايسات إلى الخلايا البطانية الابتدائية ملزمة. أنه يوفر النظام للسماح ملزم وعبر ربط المستقبلات، المرحلتين الأولى التي كثير من تحركات التيروزين مستقبلات من نوع يشرع عادة من سلسلة نقل الإشارة. وقد أظهرت تطبيقه في عدد من الأوساط الأكاديمية والتجارية فليس من المقبول فحص مفيدة لدراسة خصائص ملزمة، وخاصة عند تقييم بروابط البديل أو مثبطات للتفاعل مستقبلات يجند.

الفحص مفيد أيضا لتحليل مثبطات جديدة في المجال خارج الخلية المستقبلة أو بروابط لها. الفحص يمكن زيادة استخدامها للكشف بسرعة المتغيرات من بروابط أو مناطق خارج الخلية المستقبلة ينظر إليها في سياق من الطفرات في الجينوم (سواء الموروثة والجسدية) وجدت في شركة جنرال الكتريك البشريالأخبار في أمراض مثل السرطان 32،33 لتحديد نتيجة الوظيفية. وبالتالي من المرجح أن توسع في المستقبل تطبيقات هذا الاختبار VEGFR-2. وعلاوة على ذلك، فإن النهج العام الكامنة وراء هذا الاختبار يمكن استخدامها على نطاق أوسع لسطح الخلية تحركات مستقبلات التيروزين، والتي تشكل عائلة كبيرة ومهمة من جزيئات الإشارة في الصحة والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ستيفن الشوكة ومارك م Achen هي المساهمين في الساعة البيولوجية للتكنولوجيا المحدودة، وهي شركة تطوير العلاجات التي تستهدف الأسرة VEGF من عوامل النمو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
  2. Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
  3. Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
  4. Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
  5. Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
  6. Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  7. Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
  8. Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
  9. Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
  10. Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
  11. Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
  12. Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
  13. Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
  14. Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
  15. Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
  16. Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
  17. Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
  18. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
  19. Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
  20. McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
  21. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
  22. Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
  23. Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
  24. Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
  25. Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
  26. Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
  27. Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
  28. Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
  29. Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
  30. Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
  31. Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
  32. Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
  33. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 109، مستقبلات، VEGF، يجند، المانع، مما يشير، مستقبلات للذوبان، عامل نمو البروتين، الأحيائي، الأجسام المضادة وحيدة النسيلة
والأحيائي بسيط لتقييم العوامل الأوعية الدموية غشائي النمو
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stacker, S. A., Halford, M. M.,… More

Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter