Summary
We beschrijven een eenvoudige celgebaseerde bioassay voor het detecteren, kwantificeren en volgen van de activiteit van leden van de vasculaire endotheliale groeifactor familie van liganden. De test maakt gebruik van chimère receptoren tot expressie gebracht in een factor-afhankelijke cellijn die een semi-kwantitatieve of kwantitatieve beoordeling van receptorbinding en verknoping verschaffen door het ligand.
Abstract
De analyse van receptor tyrosine kinases en hun interactie liganden betrokken bij vasculaire biologie is vaak moeilijk als gevolg van de constitutieve expressie van families van verwante receptoren, een groot aantal verwante liganden en de moeilijkheid van het omgaan met primaire, gespecialiseerde endotheelcellen. Hier beschrijven we een bioassay voor de detectie van liganden aan de vasculaire endotheliale groeifactor receptor-2 (VEGFR-2), een belangrijke transducer signalen die angiogenese en lymfangiogenese bevorderen. Een cDNA coderend voor een fusie van het extracellulaire (ligand bindend) regio VEGFR-2 met de transmembraan- en cytoplasmatische regio van de receptor erytropoëtine (EpoR) wordt uitgedrukt in een factor-afhankelijke cellijn Ba / F3. Deze cellijn groeit in aanwezigheid van interleukine-3 (IL-3) en het intrekken van deze factor resulteert in dood van de cellen binnen 24 uur. Expressie van het VEGFR-2 / EpoR receptor fusie een alternatief mechanisme voor overleving en potentia bevorderenlly proliferatie van stabiel getransfecteerde Ba / F3-cellen bij aanwezigheid van een ligand kan binden en verknopen van het extracellulaire deel van het fusie-eiwit (dat wil zeggen, een die kan verknopen de VEGFR-2 extracellulaire gebied). De test kan worden uitgevoerd op twee manieren: a semi-kwantitatieve benadering waarbij kleine hoeveelheden ligand en cellen maken een snel resultaat in 24 uur en een kwantitatieve benadering waarbij surrogaat markers van een levensvatbare celaantal. De test is relatief gemakkelijk uit te voeren, reageert zeer bekende VEGFR-2 liganden en geschikt extracellulaire remmers van VEGFR-2 signalering zoals monoklonale antilichamen tegen de receptor of liganden, en oplosbare ligand vallen.
Introduction
De vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) familie van uitgescheiden eiwitten groeifactoren en hun verwante celoppervlakreceptoren is een belangrijk en diverse groep van oplosbare liganden en receptoren membraan ingebedde respectievelijk althans in transduceren signalen over cellulaire membranen. Zij functioneren voornamelijk in endotheelcellen, maar ook in cellen van epitheliale oorsprong en van het immuunsysteem 1,2. Signaalroutes die door ligand geactiveerde VEGF receptoren (VEGFRs) zijn kritisch belangrijke pathologieën, zoals leeftijdsgebonden maculadegeneratie en kanker en therapeutische ze gericht zijn veelvuldig klinisch gebruik (bijvoorbeeld het monoklonale antilichaam bevacizumab dat VEGF-A target) 3,4.
Een van de complexiteit van de VEGF-familie is de diversiteit van oplosbare liganden in de natuur (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF eiwitten waarvoor de parapox virusfamilie orf en slangengif VEGF, plus andere remmendeisovormen van VEGF-A) 2.
Deze liganden interactie met drie leden van de receptor tyrosine kinase familie, namelijk VEGFR-1, VEGFR-2 en VEGFR-3. Deze receptoren zijn variabel tot expressie gebracht op verschillende celtypes evenwel vaak samen op het oppervlak van endotheelcellen die bloed- en lymfevaten in vele afmetingen 5 lijn. VEGFR-2 kan binden liganden zoogdier VEGF-A 6, VEGF-C en VEGF-7 D 8,9 en orf-virus 10 VEGF en VEGF slangengif 11. VEGFR-2 speelt een belangrijke rol bij het stimuleren angiogenese (de groei van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande vaten) in embryonale ontwikkeling, wondgenezing, kanker en oogziekten. In deze context, liganden zoals VEGF-A, -C en -D binden en activeren van de receptor op bloed vasculaire endotheelcellen 12-15. Op lymfatische endotheelcellen, VEGFR-2 een rol speelt in lymfevaten, de vorming van nieuwe lymfevaten 16. VEGFR-2 kan ook leiden tot verwijding en de uitbreiding van de grote slagaders en lymfevaten in gezonde weefsels en de ziekte 17. Een volledig begrip van VEGFR-2: ligand interacties is daarom belangrijk voor de ontwikkeling van remmers voor toepassing bij de behandeling van angiogenese-afhankelijke ziekten 18. Terwijl de meeste isovormen van VEGF-A binden aan VEGFR-2, proteolytische splitsing van VEGF-C en VEGF-D is vereist om een fragment dat uit de VEGF-homologie domein dat hoge affiniteit binden aan VEGFR-2 19,20 vertoont vrijgeven.
We hebben een bioassay liganden van VEGFR-2 die is ontworpen om de noodzaak van primaire endotheelcellen, die technisch moeilijk om doorgang, duur in aanschaf en cultuur omzeilen monitor (die gespecialiseerde gemiddeld) 21 ontwikkeld en tot expressie meerdere VEGFRs en geassocieerde co- receptoren 22. Heterodimerisatie van VEGFR-2 met andere VEGF-receptoren of co-receptoren kunnen ongewenste complexiteit veroorzaken wanneer gericht op study binary receptor-ligand interacties evalueren activiteit toegeschreven aan een specifieke receptor of het effect van remmende reagentia. 23. De bioassay behoudt mobiliteit van de relevante receptor in de celmembraan en maakt evaluatie van het vermogen van een ligand om te binden en verknopen van de VEGFR-2 extracellulaire gebied.
De bioassay gebaseerd op het creëren van een chimère receptor waarin het extracellulaire gebied van een VEGF-receptor (in casu VEGFR-2) is gefuseerd aan de transmembrane en intracellulaire gebieden van de erytropoëtine-receptor (EpoR), een lid van de cytokinereceptorfamilie 8,24. Dit fusie-eiwit wordt vervolgens uitgedrukt in een factor-afhankelijke pro-B cellijn Ba / F3, waarop stimulatie met ligand kan binden en verknopen van het extracellulaire domein van de receptor leidt tot activering van het cytoplasmatische effector regio, die in staat is transduceren een survival signaal via Janus kinase (JAK) naar cel te bevorderenoverleving en / of proliferatie. Daarentegen expressie van volledige lengte VEGFR-2 in hetzelfde celtype en stimulatie met ligand, is niet bevorderlijk voor celoverleving en proliferatie, wat aangeeft dat het proximale signalering effectoren van het VEGFR-2 route beschikbaar zijn in dit celtype.
We hebben de test gebruikt in verschillende contexten binding van nieuwe VEGFR-2 liganden 10,19,20,24-29 te verkennen. In combinatie met een VEGFR-3-EpoR-Ba / F3-assay, hebben we de relatieve activiteiten van de VEGF-C en VEGF-D groeifactoren voor binding en crosslinking VEGFR-2 en VEGFR-3 30 vergeleken. De assay is gebruikt om de remmende activiteit van neutraliserende monoklonale antilichamen tegen VEGFR-2 of VEGF-D, VEGFR-2 oplosbaar trap en peptidomimetica gericht op de VEGF-familie 31 karakteriseren. De test werd ook gebruikt om het vermogen van VEGF's van verschillende ORF virusstammen te binden en verknopen VEGFR-2 voor het testen in primaire endotheelcellen tonen
De test beschrijven we is gemakkelijk uit te voeren en de semi-kwantitatieve uitvoering maakt een snelle bepaling die soms nodig zijn bij het monitoren van de productie of zuivering van groeifactoren, antilichamen of oplosbare receptor domeinen andere experimenten. Het gebruiksgemak van de test maakt het een ideale aanvulling op verder en meer volledige studies uitgevoerd met primaire endotheelcellen afkomstig van bloed of lymfevaten van specifieke weefsels of orgaansystemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bron van IL-3 en bereiding van WEHI-3D-geconditioneerd medium
Opmerking: De muis myeloïde leukemie cellijn WEHI-3D is gekweekt om een geconditioneerd medium dat IL-3 te genereren.
- Cultuur WEHI-3D in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS), 1% houdbare glutamine supplement, 50 ug / ml gentamicine. Inoculeer 5 x 10 6 cellen in de log-groeifase in 50 ml vers kweekmedium in een T175 cm 3 weefselkweek kolf en kweken gedurende 7 dagen of totdat de cellen de log groeifase zijn gepasseerd ongeveer 24 - 48 uur (voorkomen dat te veel dodencel in de cultuur). Geconditioneerde media kan worden opgeslagen voor meerdere jaren bij -20 ° C, zodat batches van 200 - 500 ml kan worden geproduceerd in een keer.
- Decanteer fluïdum en cellen uit flessen en centrifugeren bij 1000 x g gedurende 15 minuten om cellen en celresten te verwijderen. Verwijder de bovenste 90% van de supernatant. Filtreer door een 0,22 pm filter.
- Aliquot WEHI-3D geconditioneerd medium (CM) in 1 ml, 50 ml en 200 ml volumes voor opslag bij -20 ° C of -70 ° C. Kleinere hoeveelheden zijn bruikbaar voor assay preparaat tussenproduct volumes maken kweekmedium voor passage van factor-afhankelijke cellijnen en grotere volumes voor langdurige opslag. IL-3 is relatief stabiel bij 4 ° C zodat ontdooide medium kan worden opgeslagen gedurende enkele weken bij gebruik onder steriele omstandigheden.
- Alternatief, recombinant muis IL-3 in gehalten van 50 ng / ml verdund in kweekmedium, na te zijn gefilterd door een 0,22 urn filter.
2. Cultuur en evaluatie van VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 and Control Ba / F3 cellijnen
- Cultuur control Ba / F3 cellen in DMEM, 10% FBS, 50 ug / ml gentamicine of penicilline / streptomycine supplement, 1% gestabiliseerde L-glutamine en 10% WEHI-3D-CM. Passage cellen bij 1:15 verdunningen om de drie dagen van cellengroeien in log-fase.
- Cultuur VEGFR2-EpoR-Ba / F3 cellen in DMEM, 10% FBS, 50 ug / ml gentamycine, 1% gestabiliseerde L-glutamine en 10% WEHI-3D-CM en 1 mg / ml G418. Passage cellen op 1:15 verdunningen van cellen groeien in log-fase. Zie 24 voor meer informatie over de constructie en expressie van het chimere receptor.
- Harvest controle Ba / F3 of VEGFR2-EpoR-Ba / F3 cellen van half log-fase culturen. Voorzichtig pipet aan deze niet-hechtende cellen van de bodem van de kolf te verwijderen. Was driemaal in muizen toniciteit fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7,3 (PBS), (10 ml gecentrifugeerd bij 750 x g gedurende 5 minuten tot celpellet herstellen) naar medium dat IL-3 te verwijderen.
- Was de cellen eenmaal met DMEM en additieven zonder WEHI-3D-CM of recombinant IL-3 en vervolgens resuspenderen in dit medium bij een concentratie van 7,4 x 10 4 cellen / ml (dat wil zeggen 1000 cellen per 13,5 pi; 10.000 cellen per 135 pl zoals bepaald door het tellen met een hemocytometer) voorgebruiken respectievelijk de semi-kwantitatieve of kwantitatieve versies van de test.
- Beoordelen van cellen voor levensvatbaarheid door trypan Blue uitsluiting (LET). Meng trypan blauw in PBS (0,4%) 1: 1 met de celpopulatie en tel minste 100 cellen op een hemocytometer. Cellen die nemen de kleurstof zijn dood of stervend beschouwd. Levensvatbaarheid van meer dan 98% is vereist om de analyse uit te voeren.
3. Semi-kwantitatieve Assay
- Voeg gewassen cellen (1000 cellen) in 13,5 pl IL-3-deficiënt medium aan de putjes van een 72-well microtiterplaat plaat bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de celsuspensie te mengen tijdens aliquotting om ervoor te zorgen cel bezinking door de zwaartekracht niet vooringenomenheid cel concentratie. Gebruik een goed gekalibreerde P20 geautomatiseerde pipet en geautoclaveerd tips.
- Voeg testmonsters en controles aan de putjes bij 10% volume (1,5 pl, waardoor een eindvolume van 15 pl met 1000 cellen per putje) met een gekalibreerde pipet P20 of bij voorkeur P2 pipet. Neem care opdat monsters verenigbaar met de kweekomstandigheden voor Ba / F3 cellen met betrekking tot pH, zout en andere potentieel cytotoxische / cytostatische stoffen. Waar mogelijk, gebruik dan een compatibele medium of buffer (bijvoorbeeld DMEM of PBS, respectievelijk) of te verdunnen in een dergelijk medium of buffer. Wrijven met dezelfde tip waarborgen mengen.
- Voor controlemonsters bevatten (i) alleen medium bevattende geen IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM toegevoegd aan medium alleen op 10% uiteindelijke volume; en / of (iii) VEGF-A verdund tot 100 ng / ml in medium alleen, zonder IL-3.
- Vul ongebruikte putjes van de microwell plaat met steriel water, PBS of medium en plaats de plaat in een vochtige container (met water geweekt zijdepapier), waardoor de gasuitwisseling. Incubeer cellen in de houders in een vochtige atmosfeer van 10% CO2. Deze test kan gemakkelijk worden opgezet in 3 uur door één persoon als proefmonsters en media componenten beschikbaar.
- Assess platen doorgaans na 16 hrincubatietijd waarna discriminatie tussen positieve en negatieve monsters is evident. Zie Figuur 3 voor voorbeelden van hoe cellen worden in kweek. Analyseer platen met een standaard omgekeerde fasecontrastmicroscoop bij 40-100 x vergroting.
Opmerking: Putjes die positief groeifactoren zoals IL-3 of VEGF-A zullen cellen die rond en doorschijnend te bevatten. Waterloze ondersteunende groeifactoren of met medium alleen zal zijn verminderd aantal knoopcellen, evenals dode of stervende cellen en celresten (bijvoorbeeld, figuur 3C). Het evalueren van de test bij 24-48 uur na incubatie is het optimum voor gevoeligheid.
4. Kwantitatieve Bioassay
- Voeg gewassen cellen (10.000 cellen in 135 pl) in IL-3-deficiënt medium aan de putjes van een standaard 96-putjes microtiterplaat bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de celsuspensie te mengen tijdens aliquotting naar cel bezinking door de zwaartekracht heeft geen invloed op ce verzekerenll concentratie.
- Voeg testmonsters en controles aan de putjes bij 10% volume (15 ul) met een gekalibreerde pipet (P20). Let erop dat de monsters compatibel zijn met de kweekomstandigheden voor Ba / F3 cellen in termen van pH, zout of andere potentieel cytotoxische / cytostatische stoffen. Waar mogelijk, gebruik dan een compatibele medium of buffer (bijv., DMEM of PBS) of te verdunnen in een dergelijk medium of buffer. Filter steriliseren kleine volumes met een 0,22 urn poriën celluloseacetaat centrifugebuis filtereenheid.
- Incubeer het mengsel van cellen, groeifactoren en / of remmer middelen in een bevochtigde atmosfeer van 10% CO2 gedurende 48 uur. Voer de test binnen een bevochtigde container die water doordrenkte tissue papier en maakt het mogelijk gas-uitwisseling. Na afloop van de incubatieperiode evalueren de test via een van de waaronder genoemde andere methoden surrogaat markers van het haalbare celaantal in de put.
- Alternatief # 1: 3 H-thymidine Incorporation
Opmerking: Deze kwantificering is ontworpen voor de 96-well plaat formaat.- Na incubatie assay platen gedurende 48 uur bij 37 ° C (150 gl volume per putje), voeg 3 H-thymidine in een volume van 50 pl testmedium (Ba / F3 cultuurmedium zonder IL-3 / WEHI-3D CM) per putje in een concentratie van 20 uCi / ml, waardoor een uiteindelijke dosis van 1 uCi per putje.
- Incubeer de platen gedurende nog 4 uur bij 37 ° C vóór oogst cellen met behulp van een celoogster. Extract afzonderlijke monsters door het plaatsen van de filters en scintillatiemiddel kwantificeren met een vloeistofscintillatieteller.
- Alternatief # 2: bioluminescentie Detectie van Cellular ATP
Opmerking: Deze benadering gebruikt een ATP controle reagens dat in combinatie met cellysaat kan bioluminescentie signaal dat de levensvatbare cellen in de populatie weerspiegelt genereren.- Lyse cellen te halen ATP en het gebruik van een ATP Monitoring Reagent naar een te genererenluminescente signaal volgens de instructies van de fabrikant. Lees luminescentie met een luminometer compatibel met een 96-well plaat formaat.
- Alternatief # 3: Enzymatische Vermindering van een Indicator Dye door levensvatbare cellen
Opmerking: Resazurin gebaseerde testen vertonen een goede correlatie met cellevensvatbaarheid.- Combineer gekweekte cellen met de kleurstof en Resazurin gebaseerde assays kwantificeren met fluorescentie- plaatlezer volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit gedeelte tonen we de resultaten van een experiment, de essentiële kenmerken van een VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioassay (zie Figuur 1 voor de beginselen van de assay). Andere gepubliceerde studies tonen bredere toepassing van de test voor alternatieve VEGFR-2 liganden, VEGF mutant moleculen en remmende monoklonale antilichamen 8,10,19,24-30.
De hier gepresenteerde gegevens vormen een assay waarbij het VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioassay wordt gebruikt om de activiteit van de drie recombinant humaan liganden (VEGF-A 165, VEGF-C en VEGF-D) met specificiteit voor VEGFR kwantificeren -2 in aanwezigheid van een remmend monoklonaal antilichaam (bevacizumab) tegen VEGF-A 165. de gegevens zijn genormaliseerd ten opzichte van de respons op VEGF-A 165 alleen (figuur 2). Zoals verwacht, bevacizumab blokkeerde het effect van VEGF-A 165 in de assay, maarhad geen effect op de activiteit van VEGF-C en VEGF-D.
In de semi-kwantitatieve versie van de bepaling of bij het observeren van de test tijdens de ontwikkeling, het bekijken van de test met een standaard omgekeerde fase microscoop kan waardevolle informatie over het verloop van de assay te verschaffen. Een analyse van een assay (figuur 3) toont de goede levensvatbaarheid van VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioassay cellen geïncubeerd met medium dat IL-3 of ligand voor VEGFR-2, bijvoorbeeld VEGF-A. Deze cellen zijn groot en doorschijnend, en geen of weinig bewijs granulariteit in het cellulaire cytoplasma of celresten in de kweek. In de put zonder extra groeifactoren is er al bewijs van afname van het aantal cellen en weinig gezonde cellen. Cellen aanwezig significante granulariteit in hun cytoplasma en celresten is consistent is van de cultuur. Na 48 uur is er geen teken van levensvatbare cellen.
Figuur 1. Schematisch diagram dat de principes van het VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 biotest. (A) Ba / F3 cellen factorafhankelijke en vereisen een exogene groeifactor zoals IL-3 celgroei / betrouwbaarheid stimuleren via endogene IL-3-receptoren en het JAK signaalroute. Als EpoR wordt uitgedrukt in deze cellen redding kan ook optreden via de JAK-route. Expressie van een full-length receptortyrosinekinase zoals VEGFR-2 leidt tot minimale seinstelsel stroomafwaartse doelwitten van VEGFR-2 activering niet het JAK route grijpen. Een chimere receptor met het extracellulaire gebied van VEGFR-2 gefuseerd aan het transmembraan en cytoplasmatische gebieden van EpoR, wanneer getransfecteerd in Ba / F3-cellen en gestimuleerd met specifieke VEGFR-2 liganden, kan activeren de JAK route en rijden celloverleving en proliferatie. (B) VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 cellen brengen significante niveaus van het chimere VEGFR-2-EpoR receptor die kan worden gekwantificeerd met flowcytometrie. Eenmaal uit IL-3 bevattend medium gewassen worden cellen geplaatst in verschillende kweekomstandigheden die ofwel overleving / proliferatie van cellen drijven. Ongetransfecteerde Ba / F3 cellen of VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 cellen zonder specifieke groeifactoren niet om te groeien / overleven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Evaluatie van VEGFR-2 liganden in het VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 biotest. IL-3-afhankelijke Ba / F3 cellen die een muis VEGFR-2-EpoR chimeer werden uitgezaaid in medium zonder IL-3 (behalve voorde + IL-3 deelverzameling, zoals aangegeven) plus humaan VEGF-A 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (dit is een vorm van VEGF-C dat uit het centrale gebied en sluit de N- en C-eindstandige pro-peptiden) of VEGF-DANAC (dit is een vorm van VEGF-D dat het centrale gebied bevat maar niet de N- en C-eindstandige pro-peptiden (VD)) en 100 ng / ml en gehumaniseerde neutraliserend monoklonaal antilichaam bevacizumab (dat bindt en remt VEGF-a, maar niet VEGF-C of VEGF-D), of controle niet-neutraliserend antilichaam trastuzumab, zoals aangeduid bij 0,75 uM. NF = medium dat geen additionele groeifactoren. Achtenveertig uur later, werd de relatieve live cell nummer gekwantificeerd met behulp van bioluminescentie detectie van cellulaire ATP. Verticale balken vertegenwoordigen middelen (genormaliseerd ten opzichte van de reactie op VEGF-A 165 alleen al in de eerste bar) en de standaardafwijking van het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3. VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 cellen zijn afhankelijk van externe groeifactoren te overleven. Voorbeelden van VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioassay waarbij IL-3-afhankelijke Ba / F3 cellen die een muis VEGFR- 2-EpoR chimeer werden uitgezaaid in medium (A) met 10% WEHI-3D geconditioneerd medium dat IL-3, (B) 100 ng / ml humaan VEGF-A 165 (geen IL-3) of (C) medium met voorziet geen IL-3 of andere groeifactoren. Cultuur afgebeeld 24 uur in de assay toont zeer levensvatbare cellen in de aanwezigheid van IL-3 (A) of VEGF-A 165 (B), terwijl in de kweek zonder IL-3 of andere groeifactoren (C) celdood en rooduced leefbaarheid zijn duidelijk zichtbaar. Weegschalen bars zijn 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven assay gebaseerd op het gebruik van hoge levensvatbaarheid cellen, die afhankelijk groeifactoren. Cellen moeten daarom zorgvuldig gekweekt te zijn om te zorgen dat ze factor-afhankelijke, en expressie van de chimere receptor te behouden. Ervoor zorgen dat het medium is vers gemaakt en niet opgeslagen voor een te lange periode en dat WEHI-3D CM is zeer actief is belangrijk. Cellen moeten wel van IL-3 bevattend medium worden gewassen in het testmedium te verzekeren dat geen residuele IL-3 vervuilt de test bij het blootstellen van de cellen aan het redden liganden. Als liganden kan komen in een aantal verschillende vormen, zorg moet worden genomen bij de voorbereiding van deze voor het testen. Conserveringsmiddelen, antibacteriële middelen, zout of buffers met verschillende pH kan invloed hebben op de test, en daarom parallel testen van getransfecteerde Ba / F3 cellen hoogte-buffer kwesties.
Wij gebruiken zowel de semi-kwantitatieve en kwantitatieve protocollen. De semi-quantitative test zorgt voor een snelle beoordeling van de activiteit van de monsters voorafgaande aan het plegen van een volledig kwantitatieve analyse, die meer tijd en sample vereist. De kwantitatieve methode wordt uitsluitend gebruikt bij het genereren van gegevens voor publicatie. De alternatieve werkwijzen voor het detecteren van de levensvatbaarheid van de cultuur zijn relatief eenvoudig. De kwantitatieve bepaling is aangepast om een aantal verschillende formaten voor kwantificering van proliferatie, en we hebben gebruikt (3- (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) MTT 30, bioluminescentie detectie van cellulaire ATP (niet gepubliceerd), resazurine-gebaseerde kleurstof (figuur 2) en 3 H-thymidine 31 succesvol. De laatste jaren hebben wij ons van het gebruik van straling voor bioluminescentie benaderingen passen geëvolueerd en de Resazurin gebaseerde kleurstof vanwege de kosteneffectiviteit gebruikt. Alle benaderingen geven bevredigend resultaat en de keuze kan afhangen van de beschikbaarheid van reagentia en eenssociated gespecialiseerde plaat lezers in een bepaald laboratorium / instelling of vertrouwdheid met bepaalde benaderingen.
Probleemoplossing draait om de activiteit van verschillende componenten in de test i) IL-3 CM, ii) VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-cellen en iii) stimulering liganden. Lage niveaus van IL-3 in CM gevolg van onvoldoende 3D WEHI cellen in de initiële kweek, slechte opslagomstandigheden, overmatig bevriezen-ontdooien cycli ofwel gebruik makend van een te hoge verdunning slecht groeiende kweken dat de test belemmeren maken. Dit wordt meestal ontdekt in de controle putten als celpopulaties langzaam groeiende, verliezen hun normale lichte en rond voorkomen. De VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-assay cellen kunnen celoppervlak expressie van het chimère construct verliezen na verloop van tijd als het wordt bewaard in de cultuur voor langere perioden. Behoud goede aantallen bestanden vloeibare stikstof maakt verse celkweken tot expressie sterk de chimere receptor ter beschikking te allen tijde. Desgewenst een hoge expressie wordende bevolkingbereikt door groeiende cellen in VEGFR-2 liganden en selecteren van de populatie die hoge niveaus van de chimere receptor met flowcytometrie sorteren. Deze cellen worden vervolgens verder uitgebreid in de cultuur voor het invriezen.
Terwijl de techniek is een handige en eenvoudiger alternatief voor het analyseren van interacties met de VEGFR-2 extracellulaire domein kan niet worden gezien verfijndere experimenten waarbij de natieve receptor van primaire endotheelcellen wordt afgetast in de aanwezigheid van andere VEGFRs, co-receptoren zoals vervanging neuropilins. De cellen waarop deze assay is gebaseerd (B-cellen) verschillen van endotheelcellen en derhalve niet worden gebruikt voor de cytoplasmatische signaalwegen en transcriptiefactoren die reageren op VEGFR-2 activatie van endotheliale cellen te bestuderen. Toch is de werkwijze een nuttige benadering om receptor-ligand interactie te analyseren die tussen een eenvoudige bindingstest die interactie van een ligand met een geïmmobiliseerd onderzoekt receptor construct (zoals een oplosbare receptor extracellulaire gebied of extracellulaire gebied receptor gefuseerd aan immunoglobuline) en de analyse van receptorbinding en stroomafwaartse effecten bij bindingstesten primaire endotheelcellen. Het een systeem waarmee binding en verknoping van receptoren, de eerste twee etappes voor vele receptortype tyrosinekinasen gewoonlijk gestart bij signaaltransductie cascade. De toepassing ervan in een aantal academische en commerciële omgevingen heeft aangetoond dat wordt geaccepteerd als een bruikbare test voor het onderzoeken bindingseigenschappen, vooral bij het evalueren variante liganden of remmers van de receptor-ligand interactie.
De test is ook bruikbaar voor de analyse van nieuwe remmers van de receptor extracellulaire domein of de liganden ervan. De test kan verder worden gebruikt om snel te screenen varianten van de liganden of receptor extracellulaire gebieden in de context van genomische mutaties (zowel erfelijke en somatische) in humaan genes bij ziekten zoals kanker 32,33 hun functionele gevolg bepalen. Vandaar de toepassingen ervan VEGFR-2 assay dat deze productie in de toekomst. Verder kan de algemene benadering onderliggende assay breder de celoppervlak receptor tyrosine kinases, die een grote en belangrijke familie van signaalmoleculen in gezondheid en ziekte vormen worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Steven A. Stacker en Marc M. Achen zijn aandeelhouders in circadiaanse Technologies Ltd., een bedrijf dat de ontwikkeling van therapieën door zich te richten de VEGF-familie van groeifactoren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester | |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K.
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K.
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
