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Biology

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.

Abstract

혈관 생물학 관련 수용체 티로신 키나제 및 작용 리간드 분석 인해 관련 수용체 관련 리간드의 다양한 전문 내피 세포의 일차 배양 취급의 어려움 가족의 구성 적 발현 종종 도전적이다. 여기서 우리는 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2), 혈관 및 림프관을 촉진 신호의 핵심 변환기에 리간드의 검출을위한 생물학적 검정을 기술한다. 횡단 및 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR)의 세포질 영역으로 VEGFR-2의 세포 외 (리간드 결합) 영역의 융합을 코드하는 cDNA를 인자 의존적 세포주 학사 / F3 표현된다. 이 세포주는 24 시간 이내에 세포 죽음 인터루킨 -3 (IL-3),이 계수 결과의 금단의 존재하에 성장한다. VEGFR-2 / EPOR 수용체 융합의 발현은 생존과 포텐을 촉진하기위한 대안 메커니즘을 제공합니다결합 및 융합 단백질 (즉, 하나의 수 크로스 - 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역)의 세포 외 부분을 가교 결합 할 수있는 리간드의 존재 하에서 안정하게 트랜 스펙 션 된 Ba / F3 세포의 증식 에서야. 리간드와 세포의 소량은 24 시간으로 신속한 결과를 허용하는 반 - 정량적 인 접근과 생존 세포 수의 대용 마커를 포함하는 정량 방법 : 분석은 두 가지 방법으로 수행 될 수있다. 분석 수행 비교적 쉽게, 알려진 VEGFR-2 리간드에 매우 응답 및 VEGFR-2는 수용체 나 리간드 및 수용성 리간드 트랩에 대한 단일 클론 항체로 신호의 세포 외 억제제를 수용 할 수 있습니다.

Introduction

분비 된 단백질 성장 인자 및 그들의 동족 세포 표면 수용체의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리는 가용성 리간드 및 막을 매립 수용체 세포막을 가로 질러 신호를 형질 도입에 각각 해당 기능에 중요하고 다양한 기이다. 이들은 내피 세포뿐만 아니라 상피 기원의 세포 및 면역계의 1,2-들에서 주로 기능한다. 자주 임상 사용을 목표로 리간드 활성화 VEGF 수용체 (VEGFRs) 연령 관련 황반 변성 및 암과 같은 주요 병리, 중요하고, 치료제에 의해 결합 신호 전달 경로입니다 (예를 들어, VEGF-A를 대상으로하는 단일 클론 항체 베바 시주 맙) 3,4.

VEGF를 가족의 복잡성 중 하나는 자연에 존재하는 수용성 리간드 (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D는 parapox 바이러스 가족 ORF와 뱀의 독 VEGF,과 기타에 의해 인코딩 VEGF 단백질의 다양성입니다 금지의VEGF-A) (2)의 이성체.

이러한 리간드 즉 수용체 티로신 키나제 군의 3 명, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 상호 작용. 이 수용체는 가변적으로 다른 세포 유형에 표현하지만 종종 모든 규모 5의 혈액과 림프 혈관을 줄 내피 세포의 표면에 공동으로 표현된다. VEGFR-2는 포유류가 VEGF-A 6, VEGF-C (7)와 VEGF-D 8,9뿐만 아니라 ORF 바이러스 VEGF (10)와 뱀의 독 VEGF (11) 리간드 바인딩 할 수 있습니다. VEGFR-2가 혈관 배아 발달의 (기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장), 상처 치료, 암, 안과 질환을 유도하는 중요한 역할을한다. 이러한 상황에서, 이러한 VEGF-A, -C와 -D 바인드로와 리간드는 혈액 혈관 내피 세포 12-15의 수용체를 활성화합니다. 림프관 내피 세포에서 VEGFR-2 림프관 형성에서 역할 새로운 림프관 (16)의 형성을 수행한다. VEGFR-2도 팽창하고 건강한 조직과 질병 (17)의 주요 동맥과 림프관의 확장을 홍보 할 수 있습니다. VEGFR-2의 완전한 이해 : 리간드 상호 작용은 혈관 신생 - 의존성 질환을 치료하는 (18)에 사용하기위한 억제제의 개발이 중요하다. VEGFR-2 VEGF-A 바인드 대부분의 동종은, VEGF-C와 VEGF-D의 단백질 분해 절단은 VEGFR-2 (19, 20)에 결합하는 높은 친 화성을 ​​나타내는 VEGF-상동 도메인으로 구성된 단편을 해제 할 필요가있다.

우리는 21 (전문 매체를 필요로) 차 내피 통로에 기술적으로 어려운 세포, 구입 비용과 문화에 대한 필요성을 우회하도록 설계 VEGFR-2의 리간드를 모니터링하는 생물 검정을 개발하고 여러 VEGFRs을 표현하고 코를 연결 한 (22) 수용체. 스터드 목표로 할 때 다른 VEGF 수용체 또는 공동 수용체와 VEGFR-2의 Heterodimerization 불필요한 복잡성을 야기 할 수Y 이진 수용체 - 리간드 상호 작용, 특정 수용체에 기인하는 활성을 평가하거나 억제 시약의 효과를 평가. 23. 생물학적 검정법은 세포막의 관련 수용체의 이동도를 유지하고 결합 리간드의 능​​력 크로스 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역의 평가를 허용한다.

생물학적 검정법 (이 경우 VEGFR-2)은 VEGF 수용체의 세포 외 영역은 상기 트랜스과 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR), 사이토 카인 리셉터 패밀리의 구성원의 세포 내 영역에 융합시킨, 키메라 수용체의 생성에 의존 8,24. 이 융합 단백질은 그 후, 인자 - 의존 프로 B 세포주 학사 / F3로 표현 결합 및 수용체의 세포 외 도메인이 가능한 세포질 효과기 영역의 활성화를 일으키는 가교 결합 할 수있는 리간드되는 자극에 따라 셀을 촉진하기 위해 야누스 키나제 (JAKs)를 통해 생존 신호를 열 변환의생존 및 / 또는 증식. 반면, 리간드와 전체 길이 VEGFR-2와 동일한 세포 유형, 그리고 자극의 발현은 VEGFR-2 통로의 근위 신호 이펙터이 세포 유형에서 사용할 수없는 것을 나타내는, 세포 생존 및 증식을 촉진하지 않습니다.

우리는 새로운 VEGFR-2 리간드 10,19,20,24-29의 결합을 탐구하는 다양한 상황의 분석을 사용했다. VEGFR-3 EPOR-BA / F3 분석과 함께, 우리는 바인딩 및 VEGFR-2 및 VEGFR-3 (30)을 가교하기위한 기준으로 VEGF-C의 활동 및 VEGF-D 성장 인자를 비교 하였다. 상기 분석은 VEGFR-2, VEGF-D, 가용성 VEGFR-2 트랩 및 VEGF 패밀리 31 타겟팅 펩티 모노클로 중화 항체의 억제 활성을 특성화하는데 사용되어왔다. 분석은 기본 내피 세포에 결합하는 다른 ORF 바이러스 균주에서 VEGFs의 능력과 가교 VEGFR-2 이전 테스트에 표시하는 데 사용 25시 정화 성장을위한 평가 프로토콜 (27) 요인에 도입되기 전에 신속하게 활동 평가 될 수있다 VEGFs의 돌연변이의 빠른 검사에 특히 유용합니다.

우리가 묘사 분석을 수행하기 용이하며, 반 정량적 버전은 성장 인자, 항체 또는 다른 실험 가용성 수용체 도메인의 제조 또는 정제를 모니터링 할 때 종종 필요한 빠른 결정을 허용한다. 분석의 사용의 용이성은 특정 조직 또는 기관 시스템에서 혈액이나 림프 혈관에서 파생 된 차 내피 세포로 수행 더욱 더 완벽한 연구에 이상적인 보완한다.

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Protocol

IL-3의 제조의 소스 WEHI-3D​​ 에어컨 중간

주 : 마우스 과립 구성 백혈병 세포주 WEHI-3D​​는 IL-3을 함유하는 합성 배지를 생성하기 위해 배양한다.

  1. 둘 베코 변형 이글 배지에서 배양 WEHI-3D​​ (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 긴 수명 글루타민 보충제, 50 μg의가 / ㎖ 젠타 마이신. T175의 cm 3 조직 배양 플라스크에서 신선한 배지 50 ㎖로 성장 로그 단계에서 5 × 106 세포를 접종하고 약 7 일 동안 성장 또는 세포를 약 24으로 성장 그 로그 상을 통과 할 때까지 - 48 시간 (문화 과도한 세포 사멸을 방지). 500 mL를 한번에 제조 할 수있다 - (200)의 배치가되도록 조정 배지는 -20 ° C에서 여러 해 동안 저장 될 수있다.
  2. 15 분은 세포와 세포 파편을 제거하기 위해 1,000 × g으로 플라스크와 스핀에서 유체 및 세포를 가만히 따르다. supern의 최고 90 %를 제거atant. 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 필터링합니다.
  3. 1 ml를 50 mL 및 -20 ° C에서 저장을위한 200 ml의 볼륨 또는 -70 ° C ~로 나누어지는 WEHI-3D​​ 에어컨 매체 (CM). 작은 분취 량의 장기 저장을위한 분석 준비 인자 의존적 세포주의 통과를위한 배양 배지를 제조하기위한 중간 볼륨 큰 볼륨에 유용하다. IL-3는 무균 조건 하에서 사용하는 경우 너무 해동 매체가 몇 주 동안 저장 될 수있다 4 ° C에서 상대적으로 안정적이다.
  4. 대안 적으로, 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 여과 된 후 배지로 희석하여 50 ng를 / ㎖의 농도로 재조합 마우스 IL-3를 사용한다.

VEGFR-2-EPOR - 바 / F3 및 제어 바 / F3 셀 라인 2. 문화 및 평가

  1. DMEM에서 배양 바 제어 / F3 세포를 10 % FBS, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신 또는 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 안정화. 세포로부터 3 일에 대한 1시 15분 희석에서 통과 세포로그 상에 성장합니다.
  2. DMEM에서 배양-VEGFR2 EPOR-BA / F3 세포를 10 % FBS가를 50㎍ / ml의 겐타 마이신, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 및 1 ㎎ / ㎖의 G418을 안정화. 로그 상에 성장하는 세포에서 1시 15분 희석에 통로 세포. 키메라 수용체의 구조와 표현에 대한 자세한 내용은 24를 참조하십시오.
  3. 중앙 로그 상 문화에서 수확 제어 바 / F3 또는 VEGFR2-EPOR - 바 / F3 세포. 천천히 플라스크의 바닥으로부터 이들 비 - 부착 세포를 제거하기 위해 피펫. 매체 IL-3를 함유 제거 (세포 펠렛을 회수하기 위해 5 분 동안 750 x g에서 10 ㎖, 원심 분리), 마우스 긴장성 인산 완충 식염수, pH가 7.3 (PBS)으로 세 번 세척 하였다.
  4. 10,000 세포 당 후 세척 상기 WEHI-3D-CM 또는 재조합 IL-3없이 회 DMEM 및 첨가제와 함께 세포, 및 7.4 × 104 세포 / ㎖ (즉, 13.5 μL 당 1000 세포의 농도로이 배지에 재현 탁 혈구를 사용하여 계산에 의해 결정된 135 μL)에 대한각각 분석의 반 정량적 또는 정량 버전에서 사용할 수 있습니다.
  5. 트리 판 블루 제외 (주의)에 의해 생존을위한 세포를 평가합니다. 세포 집단으로 1 혈구 100 셀들의 최소 개수 : PBS (0.4 %) (1)에 트리 판 블루를 섞는다. 염료을 차지 세포가 죽었거나 죽어 간주됩니다. 98 % 이상의 생존율 분석을 수행 할 필요가있다.

3. 반 정량 분석

  1. RT에서 72 웰 마이크로 웰 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 매체의 13.5 μL에 포함 된 세척 세포 (1,000 세포)를 추가합니다. 중력 바이어스 세포 농도를하지 않습니다에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의하십시오. 잘 보정 P20 자동 피펫 및 멸균 팁을 사용합니다.
  2. 교정 P20 피펫 또는, 바람직하게는, P2 피펫을 사용하여 (물론 1,000 세포를 포함하는 15 μL의 최종 볼륨을, 1.5 μL) 10 % 볼륨 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 캘리포니아를 타고재는 샘플의 pH, 소금 및 기타 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인합니다. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예를 들면, DMEM 또는 PBS, 각각) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 같은 팁 분쇄 혼합 보장합니다.
  3. 대조 시료를 들어, (ⅰ) 보통 단독으로 함유 더 포함 IL-3,하지 (ⅱ) WEHI-3BD CM-10 %의 최종 부피에서 단독 배지에 첨가; 및 / 또는 (ⅲ) VEGF-A에는 IL-3를 함유하지 않는 단독 배지에서 100ng의 / ㎖로 희석 하였다.
  4. 멸균, PBS 또는 매체와 마이크로 웰 플레이트의 사용하지 않는 우물을 채우고 수 있도록 가스 교환 (물 티슈 페이퍼 젖과) 가습 컨테이너 내에서 접시를 놓습니다. 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 컨테이너 내에 세포를 인큐베이션. 테스트 샘플 및 미디어 구성 요소를 사용할 수있는 경우이 분석은 편안하게 한 사람이 3 시간에 설정할 수 있습니다.
  5. 일반적으로 16 시간 후 번호판을 평가배양이되는 포지티브 및 네거티브 샘플 사이의 시간 차별은 분명하다. 세포 배양에 표시하는 방법의 예 그림 3을 참조하십시오. 100 × 배율 - 40 표준 역 위상차 현미경을 사용하여 번호판을 분석합니다.
    참고 : 웰스 둥근 반투명 표시 셀을 포함 이러한 IL-3 또는 VEGF-A로지지 성장 인자를 포함. 지지 성장 인자없이 또는 배지 단독 웰 둥근 세포뿐만 아니라 죽었거나 죽어가는 세포 및 세포 찌꺼기 (예컨대,도 3c)의 수를 감소한다. 24 ~ 48 시간 게시물 배양에서 분석 평가하는 것은 감도 최적입니다.

4. 양적 생물 검정

  1. RT에서 표준 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 배지에서 세정 균체 (135 μL 10,000 세포)를 추가한다. 가전​​ 영향을주지 않습니다 중력에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의LL 농도.
  2. 10 % 볼륨 (15 μL) 보정 피펫 (P20)를 사용에서 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 샘플의 pH, 소금 또는 다른 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인하기 위해주의하십시오. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예., DMEM 또는 PBS) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 필터는 0.22 ㎛의 세공 셀룰로오스 아세테이트 원심 관 필터 유닛을 이용하여 소량 살균.
  3. 48 시간 동안 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 세포 성장 인자 및 / 또는 억제제 제의 혼합물을 인큐베이션. 물에 적신 휴지를 가지고 있으며, 가스 교환을 할 수있는 가습 컨테이너 내에서 분석을 수행합니다. 잘 내 생존 세포 수의 대용 마커 배양 기간의 종료에서, 이는 아래에 나열된 다른 방법 중 하나를 사용하여 분석 평가이다.
  4. 대안 1 : 3 H-thymidi북동 설립
    참고 :이 정량은 96 웰 플레이트 형식을 위해 설계되었습니다.
    1. 37 ° C (웰 당 150 ㎕의 부피)에서 48 시간 동안 분석 플레이트를 배양 한 후 (IL-3 / WEHI-3D ​​CM없이 학사 / F3 배지) 분석 배지 50 ㎕의 부피로 3 H 티미 딘을 추가 웰 당 1 μCi를 최종 투여 20 μCi를주고 잘 / ml의 농도로 당.
    2. 셀 수확기를 사용하여 세포를 수확하기 전에 37 ° C에서 추가로 4 시간 동안 접시를 품어. 섬광에 필터를 배치하여 각각의 샘플을 추출하여 액체 섬광 계수기로 정량화.
  5. 대안 # 2 : 셀룰러 ATP의 생물 발광 검출
    주 :이 방법은 집단의 생존 세포를 반영하는 생물 발광 신호를 생성 할 수있는 세포 용 해물과 결합 된 ATP 모니터링 시약을 사용한다.
    1. 를 Lyse 세포 ATP를 추출하고, 생성하는 ATP 모니터링 시약을 사용제조업체의 지시에 따라, 발광 신호를 출력한다. 96 웰 플레이트 형식과 호환 루미를 사용하여 발광을 읽어보십시오.
  6. 대안 3 : 실행 가능한 세포에 의한 표시 염료의 효소 감소
    참고 : 레사 주린 기반 분석은 세포 생존에 좋은 상관 관계를 보여줍니다.
    1. 레사 주린 계 염료로 배양 된 세포를 결합하고 제조자의 지시에 따른 형광 플레이트 판독기를 사용하여 분석을 정량화.

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Representative Results

이 섹션에서는, 우리는 VEGFR-2-EPOR - 바 / F3의 생물 검정 (분석의 원리 그림 1 참조)의 필수 기능을 보여주는 실험의 결과를 보여줍니다. 다른 발표 된 연구는 다른 VEGFR-2 리간드, 돌연변이 VEGF 분자 및 저해 모노클로 날 항체 8,10,19,24-30에 대한 분석의 광범위한 응용 프로그램을 보여줍니다.

여기에 제시된 데이터는 VEGFR-2 EPOR-BA / F3 생물 검정법은 세 가지 재조합 인간 리간드 (VEGF-165, VEGF-C 및 VEGF-D) VEGFR 대한 특이 활성을 정량화하는데 사용되는 분석법을 나타낸다 -2 저해 성 모노클로 날 항체 (베바 시주 맙)의 존재 하에서 VEGF-A (165)의 데이터는 VEGF-A (165)를 단독 (도 2)에 대한 응답 대 정규화되었다. 예상대로, 베바 시주 맙은 VEGF-A 분석 165의 효과를 차단하지만,VEGF-C 및 VEGF-D의 활성에 영향을 미치지 않았다.

분석의 진행 상황에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있는 표준 역 위상 현미경을 이용하여 분석을보고, 그 개발 기간 동안 분석을 관찰 할 때 분석의 반 정량적 버전 또는. VEGFR-2, 예를 들어 VEGF-A를위한 매체 IL-3을 포함하는, 또는 리간드와 함께 배양했을 때 분석 (도 3)의 분석 VEGFR-2 EPOR-BA는 / F3 생물 검정법 세포의 우수한 생존율을 나타낸다. 이들 세포는 많은 반투명하고, 배양 세포의 세포질 또는 세포 파편 입도 없거나 최소한의 증거는 없다. 잘 추가 성장 인자와 감소 세포 수와 몇 건강한 세포의 증거가 이미 있습니다. 본 세포는 세포질에 중요한 단위가 세포​​ 파편은 문화의 일관성있는 기능입니다. 48 시간 후 생존 세포의 흔적이 없다.


VEGFR-2 EPOR-BA / F3 생물 분석의 원리를 설명하면도 1 회로도. (A) 학사 / F3 세포 인자 의존적이며 같은 외인성 성장 인자를 필요 IL-3을 통해 세포 성장 / 생존 자극 내인성 IL-3 수용체 및 JAK 신호 전달 경로. EPOR이 셀 구조로 표현하는 경우도 JAK 경로를 통해 발생할 수 있습니다. 이러한 VEGFR-2 활성화의 다운 스트림 대상으로 최소한의 신호에 VEGFR-2의 결과로 전체 길이 수용체 티로신 키나제의 발현은 JAK 경로를 관여하지 않습니다. 바륨 / F3 세포에 형질 때 EPOR의 막 횡단 및 세포질 영역에 융합 VEGFR-2의 세포 외 영역과 키메라 수용체 특정 VEGFR-2 리간드 자극은 JAK 경로를 활성화하고 세포를 구동 할 수있다생존과 증식. (B) VEGFR-2 EPOR-BA / F3 세포는 유세포 정량화 할 수있는 키메라 VEGFR-2 수용체 EPOR 상당한 수준의 표현. 일단 IL-3 함유 배지에서 세정 한 후, 세포는 세포 생존 / 증식를 유도 배양 조건의 다양한 배치된다. 형질 감염되지 않은 바 / F3 세포 또는 VEGFR-2-EPOR - 바이 / F3 셀 특정 성장 인자없이이 / 성장 생존하지 못한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2

도 2는 마우스 VEGFR-2 EPOR 키메라를 발현 VEGFR-2 EPOR-BA / F3 생물 검정법. IL-3 의존적 학사 / F3 세포에서 VEGFR-2 리간드 평가하기 (IL-3없이 매체에 시딩 ...에 대한+ IL-3 서브 세트 표시) 더하기 인간 VEGF-A (165), VEGF-CΔNΔC (VC) (이는 중앙 영역으로 구성하고, N과 C 말단 propeptides 제외 VEGF-C의 형태) 또는 VEGF-DΔNΔC (이 중앙 영역을 포함하고 제외 VEGF-D의 형태 인 N과 C 말단 propeptides (VD))와 결합하여 VEGF-A 억제 100 NG / ㎖ 및 인간화 중화 모노클로 날 항체 베바 시주 맙 (AT, 하지만 VEGF 또는 VEGF-C-D), 또는 0.75 μM에서 나타낸 바와 같이, 항체 트라 스투 주맙 비 중화 제어한다. 추가로 성장 인자를 함유하지 NF = 매체. 48 시간 후, 상대 생균 수는 세포의 ATP 생물 발광 검출을 이용하여 정량 하였다. 수직 막대와 3 개의 독립적 인 실험의 평균의 표준 오차 (혼자 VEGF-A (165), 첫 번째 막대에 대한 응답 대 정규화) 수단을 나타냅니다. V 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.

그림 3

그림 3. VEGFR-2-EPOR - 바 / F3 세포는 생존을위한 외부 성장 요인에 따라 달라집니다. VEGFR-2-EPOR - 바 / F3의 생물 검정의 예는있는 IL-3에 의존 바 / F3 세포는 마우스를 표현 VEGFR- 2 EPOR 키메라 10 % WEHI-3D는 IL-3, (B) 100 NG / ㎖로 인간 VEGF-A 165 (NO IL-3), 또는 (C) 매체를 제공 매체 에어컨 함유 배지 (A)에 시딩 아니오 IL-3 또는 추가적인 성장 인자. 배양은, IL-3 (A) 또는 VEGF-A 165 (B)의 존재 하에서 고도로 생존 세포를 나타내는 분석에 24 시간을 나타낸 반면없는 IL-3 또는 추가적인 성장 인자 (C) 세포의 사멸과 함께 배양하고 빨간uced 생존 명확하게 알 수 있습니다. 바는 100 μm의입니다 조정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 설명 된 분석은 성장 인자에 의존 높은 생존 세포를 사용하는 방법에 의존한다. 세포는 따라서 그들이 인자 의존 확인하고 키메라 수용체의 발현을 유지하기 위해주의 깊게 배양 할 필요가있다. 매체가 갓과 지나치게 긴 기간 동안 및 WEHI-3D​​ CM이 중요 매우 활성화되어 저장되지 않도록. 세포를 완전히 구출 리간드에 세포를 노출 할 때 잔류 IL-3 분석을 오염되지 않도록 상기 분석 배지에 IL-3 포함 매체로부터 세정 될 필요가있다. 리간드는 상이한 형태의 숫자에 올 수있는 바와 같이, 케어 시금 이러한 제조 할 때 수행되어야한다. 방부제, 항균제, 소금 또는 다른 산도의 버퍼 분석에 영향을 미칠 수 있고, 형질 감염되지 않은 바 / F3 세포의 병렬 테스트 버퍼 관련 문제에 대해 알릴 수 있습니다 이유입니다.

우리는 모두에게 반 정량 및 정량 프로토콜을 사용합니다. 반 quantitati적이 분석은 이전 시간과 샘플을 요구하는 완전히 정량 분석​​에 투입, 샘플의 활성의 신속한 평가를 허용한다. 게시에 대한 데이터를 생성 할 때 정량적 방법이 독점적으로 사용됩니다. 배양 가능성을 검출하기위한 다른 방법은 비교적 간단하다. 정량 분석​​은 증식 정량 다른 포맷의 수에 적응 한 내용 및 우리가 사용한 (3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드) MTT (30), 휴대 ATP (미 출판), 레사 주린 계 염료 (그림 2) 성공 3 H-티미 딘 (31)의 생물 발광 검출. 최근에서는 생물 발광 방식을 적응 방사선의 사용으로 얻어 진화 및 경제성으로 인해 기반 레사 주린 염료를 사용했다. 접근법 모두는 적절한 결과를 제공하고, 선택 시약의 이용하고 A에 의존특정 방식으로 주어진 실험실 / 연구소 또는 친숙 전문 플레이트 리더를 지을.

문제 해결 분석의 세 가지 주요 구성 요소, ⅰ) IL-3 CM, ⅱ) VEGFR-2-EPOR - 바이 / F3 세포 및 ⅲ) 자극 리간드의 활동을 중심으로 돌아 가지. 때문에 초기 문화에 부적절한 WEHI 3D 세포, 가난한 보관 조건, 과도한 동결 융해 사이클 또는 분석을 방해합니다 저조한 성장 문화를 만들 수 있습니다 너무 높은 희석에 사용하는 IL-3 CM에서의 빈약 한 수준. 세포 인구가 정상 밝고 둥근 모양을 잃고, 천천히 성장으로 이것은 일반적으로 제어 우물에서 발견된다. 장기간 배양에 보관하면 VEGFR-2-EPOR-BA는 / F3 세포 분석은 시간 키메라 구조의 세포 표면 발현을 잃을 수있다. 액체 질소 주식의 좋은 번호를 유지하는 것은 매우 키메라 수용체를 발현하는 세포의 신선한 문화가 항상 사용할 수 있습니다. 필요한 경우, 높은 인구 표현 될 수있다VEGFR-2 리간드의 세포 성장 및 정렬 유세포 키메라 수용체의 높은 수준의 발현 집단을 선택하였습니다. 이 세포는 더 동결에 대한 문화에 확장됩니다.

이 기술은 VEGFR-2 세포 외 도메인의 상호 작용을 분석 더욱 단순화 대안있는 동안 차 내피 세포에 천연 수용체 다른 VEGFRs 공동 수용체 등의 존재 프로빙 더 정교한 실험을 대체 볼 수없는 neuropilins. 이 분석의 기초가되는 세포 (B 세포)는 내피 세포와 구별하고, 따라서 내피 세포에서 VEGFR-2의 활성화에 반응하는 세포질 신호 전달 경로 및 전사 인자를 연구하는 데 사용되어서는 안된다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 고정화 레셉과 리간드의 상호 작용을 조사하는 간단한 결합 분석 사이에있는 수용체 - 리간드 상호 작용을 분석하기위한 유용한 방법을 제공한다토와 수용체 결합 분석 및 차 내피 세포 결합 분석에서 본 하류 효과 (예를 들면, 가용성 수용체의 세포 외 영역 또는 면역 글로불린 융합 수용체의 세포 외 영역으로) 구성. 이 수용체의 결합 및 가교는, 처음 두 단계가있는 많은 유형 수용체 티로신 키나제는 그들의 일반적으로 신호 전달 캐스케이드를 개시 할 수 있도록하는 시스템을 제공한다. 학술 및 상업 설정의 숫자에있는 그것의 응용 프로그램은 변형 리간드 또는 수용체 - 리간드 상호 작용의 억제제를 평가, 특히이 바인딩 특성을 조사하기위한 유용한 분석으로 허용됩니다 보여 주었다.

분석은 또한 수용체 세포 외 도메인 또는 리간드의 새로운 억제제의 분석에 유용합니다. 분석은 또한 인간에서 발견 GE (모두 상속 체세포) 빠르게 유전자 돌연변이의 맥락에서 볼 수있는 리간드 또는 수용체의 세포 외 영역의 변이체를 스크리닝하기 위해 사용될 수있다암 (32, 33)과 같은 질병에 NES는 기능적 결과를 확인합니다. 따라서 본 VEGFR-2 분석의 어플리케이션은 향후 확장 가능성이 높다. 또한,이 분석을 기초 일반적인 방법은 더 넓게 건강과 질환에서의 신호 전달 분자의 큰 중요한 가정을 구성하는 세포 표면 수용체 티로신 키나제에 대해 이용 될 수있다.

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Disclosures

스티븐 A. 스태커 및 마크 M. Achen은 일주기 기술 (주), 성장 인자의 VEGF 가족을 대상으로 치료제를 개발하는 회사의 주주입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

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References

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세포 생물학 판 (109) 수용체 VEGF 리간드 억제제 시그널링 가용성 수용체 단백질 성장 인자 생물 검정 모노클로 날 항체
혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정
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Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

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