Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Простой биопроб для оценки факторов роста эндотелия сосудов

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

Мы опишем простой клеток на основе биопробы для выявления, количественной оценки и мониторинга активности членов фактора роста эндотелия сосудов семейства лигандов. Анализ использует химерные рецепторы, выраженные в клеточной линии фактор-зависимой, чтобы обеспечить полуколичественного или количественную оценку связывания рецептора и перекрестного связывания с лигандом.

Abstract

Анализ рецепторных тирозинкиназ и их взаимодействующих лигандов, участвующих в сосудистой биологии часто сложным из-за нерегулируемой экспрессии семейств родственных рецепторов, широкого спектра родственных лигандов и трудность работы с первичной культуры специализированных эндотелиальных клеток. Здесь мы опишем биопробы для выявления лигандов сосудистого эндотелиального фактора роста рецептора-2 (VEGFR-2), ключевой преобразователь сигналов, которые способствуют ангиогенез и лимфангиогенез. КДНК, кодирующую слитый внеклеточной (лиганд-связывающий) области VEGFR-2 с трансмембранного и цитоплазматического областей рецептора эритропоэтина (Epor) выражается в фактор-зависимой клеточной линии Ba / F3. Эта клеточная линия растет в присутствии интерлейкина-3 (IL-3) и вывода этого фактора приводит к гибели клеток в течение 24 часов. Экспрессии слитого рецептора VEGFR-2 / Epor обеспечивает альтернативный механизм для содействия выживанию и PotentiaLLY пролиферацию стабильно трансфецированных Ba / F3 клеток в присутствии лиганда , способного связываться и сшивающий внеклеточную часть гибридного белка (то есть, тот , который может прошивают внеклеточной области VEGFR-2). Анализ может быть выполнен двумя способами: полуколичественный подход, в котором небольшие объемы лиганда и клеток позволить быстрый результат в 24 ч и количественного подхода с участием суррогатных маркеров количество жизнеспособных клеток. Анализ относительно легко выполнить, весьма реагирует на известные VEGFR-2 лигандов и может вместить внеклеточные ингибиторы VEGFR-2 сигнализации, такие как моноклональные антитела к рецептору или лигандов, а также растворимых лигандов ловушек.

Introduction

Семейство сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), секретируемых факторов роста белков и их родственными рецепторами на поверхности клетки является важной и разнообразной группой растворимых лигандов и мембранных встраиваемый рецепторов соответственно этой функции в трансдукции сигналов через клеточные мембраны. Они действуют в основном в эндотелиальных клетках , но и в клетках эпителиального происхождения и организации системы 1,2 иммунной. Сигнальных путей, занимающихся рецепторами лиганд-активированных VEGF (VEGFRs) имеют решающее значение для основных патологий, таких как возрастная макулярная дегенерация и рака, а также терапии целятся в частых клинического использования (например, моноклональное бевацизумаб антитело, которое предназначается для VEGF-A) 3,4.

Одна из сложностей семейства VEGF является разнообразие растворимых лигандов, присутствующих в природе (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF белков, кодируемых parapox вирусом семейства ORF и змеиный яд VEGF, а также другие тормозящийизоформы VEGF-A) 2.

Эти лиганды взаимодействуют с тремя членами рецепторных тирозинкиназ семейства, а именно VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3. Эти рецепторы переменно выражены в различных типах клеток , но часто применяют совместно экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток, выстилающих кровеносные и лимфатические сосуды всех размеров 5. VEGFR-2 может связать млекопитающих лигандов VEGF-A 6, VEGF-C 7 и VEGF-D 8,9, а также вирус ORF VEGF 10 и змеиный яд VEGF 11. VEGFR-2 играет важную роль в стимулировании ангиогенеза (рост новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосудов) в эмбриональном развитии, заживление ран, рака и заболеваний глаз. В этих контекстах, лиганды , такие как VEGF-A, -C и -D связывают и активируют рецептор на кровеносных сосудов эндотелиальных клеток 12-15. На лимфатическим эндотелиальных клетках, VEGFR-2 играет роль в лимфангиогенеза, образование новых лимфатических сосудов 16. VEGF рецептором2 также может способствовать расширение и расширение основных артерий и лимфатических сосудов в здоровых тканях и болезней 17. Полное понимание VEGFR-2 - лиганд: Поэтому очень важно для развития ингибиторов для применения в лечении зависимых от ангиогенеза заболеваний 18. В то время как большинство изоформы VEGF-A связываются с VEGFR-2, протеолитическое расщепление VEGF-C и VEGF-D необходим , чтобы освободить фрагмент , состоящий из домена СЭФР-гомологии , который проявляет высокую аффинность связывания с VEGFR-2 19,20.

Мы разработали биопробы для мониторинга лигандов VEGFR-2 , который предназначен , чтобы обойти потребность в первичных эндотелиальных клеток, которые являются технически трудно прохода, дорого приобретать и культуры (требующих специальных среды) 21 и выражают несколько VEGFRs и связанных с ними скоордини- рецепторов 22. Гетеродимеризация из VEGFR-2 с другими рецепторами VEGF или корецепторами может вызвать нежелательные сложности при прицеливании на шпилькеу бинарных рецептор-лиганд взаимодействия, оценивающих деятельность , относящаяся к специфическим рецептором, или оценки влияния ингибирующих реагентов. 23. Биологический анализ сохраняет подвижность соответствующего рецептора в клеточной мембране и позволяет оценить способность лигандом связывать и сшивку внеклеточной области VEGFR-2.

Биологический анализ опирается на создание химерных рецептора, в котором внеклеточной области рецептора VEGF (в данном случае VEGFR-2), слит с трансмембранным и внутриклеточным областей рецептор эритропоэтина (Epor), член семейства рецепторов цитокина 8,24. Этот слитый белок затем экспрессируется в фактор-зависимой про-В-клеточной линии Ba / F3, при котором стимуляция с лигандом, способного связываться и сшивающий внеклеточный домен рецептора вызывает активацию цитоплазматической эффекторной области, которая способна трансдукции сигнала выживания через Янус киназ (Jaks) содействовать клеткивыживания и / или пролиферации. В противоположность этому, экспрессия полноразмерного VEGFR-2 в том же типе клеток, и стимуляцию с лигандом, не способствует выживанию и пролиферации клеток, что свидетельствует о том, что проксимальные сигнальные эффекторы VEGFR-2 пути не доступны в этом типе клеток.

Мы использовали пробу в различных контекстах для изучения связывания новых VEGFR-2 лигандов 10,19,20,24-29. В сочетании с / F3 анализа VEGFR-3-Epor-Ба, мы сравнили относительную деятельность VEGF-C и факторы роста VEGF-D для связывания и сшивания VEGFR-2 и VEGFR-3 30. Анализ используют для характеристики ингибирующей активности нейтрализующие моноклональные антитела к VEGFR-2 или VEGF-D, растворимого VEGFR-2 ловушки и пептидомиметики , ориентированных на семью СЭФР 31. Этот анализ также используется, чтобы показать способность VEGFs от различных вирусных штаммов ORF связывать и сшивка VEGFR-2 перед тестированием в первичных эндотелиальных клетках 25 или при оценке протоколов для роста очищающий факторов 27.

Анализ мы описываем легко выполнить, а полуколичественный версия позволяет быстро определений, которые иногда требуются при мониторинге производства или очистки факторов роста, антител или растворимых рецепторов доменов для других экспериментов. Легкость использования анализа делает его идеальным дополнением к дальнейшему и более полных исследований, проведенных с первичными эндотелиальных клеток, полученных из крови или лимфатических сосудов из определенных тканей или органов и систем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Источник IL-3 и подготовка WEHI-3D ​​кондиционером Средний

Примечание: лейкоз линия клеток мыши гранулоцитарного WEHI-3D ​​культивируют для генерации кондиционированной среды, содержащей IL-3.

  1. Культура WEHI-3D ​​в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 1% долговечный глютамин добавка, 50 мкг / мл гентамицина. Инокулируйте 5 × 10 6 клеток в логарифмической фазе роста в 50 мл свежей культуральной среды в T175 см 3 тканевой культуры колбы и расти в течение приблизительно 7 дней или до тех пор , пока клетки не прошли их в лог - фазе роста примерно на 24 - 48 ч (во избежание чрезмерной гибели клеток в культуре). Кондиционированную среду может храниться в течение нескольких лет при -20 ° С, так что порции 200 - 500 мл может быть произведено за один раз.
  2. Слейте жидкость и клетки из колб и спина при 1000 х г в течение 15 мин для удаления клеток и клеточных остатков. Снимите верхнюю 90% supernatant. Фильтр через блок с фильтром 0,22 мкм.
  3. Аликвоты WEHI-3D ​​среда кондиционером (СМ) в 1 мл, 50 мл и 200 мл объема для хранения при -20 ° С или -70 ° С. Более мелкие аликвоты полезны для подготовки анализа, промежуточных объемов для изготовления культуральной среды для прохождения линий фактор-зависимых клеток, а также больших объемов для длительного хранения. IL-3, является относительно стабильным при 4 ° С, так протаявшая среда может храниться в течение нескольких недель, если они используются в стерильных условиях.
  4. В качестве альтернативы используют рекомбинантную мышь IL-3 в количестве 50 нг / мл разводили в культуральной среде, после чего фильтровали через блок фильтра, 0,22 мкм.

2. Культура и оценка VEGFR-2-Epor-Ba / F3 и управления Ba / F3 клеточных линий

  1. Культура управления Ba / F3 клетки в DMEM, 10% FBS, 50 мкг / мл гентамицина или пенициллин / стрептомицин добавка, 1% стабилизированный L-глутамина и 10% WEHI-3D-CM. Прохождение клетки в 1:15 разведениях примерно каждые три дня из клетокрастет в логарифмической фазе.
  2. Культура VEGFR2-Epor-Ba / F3 клеток в DMEM, 10% FBS, 50 мкг / мл гентамицина, 1% стабилизированный L-глутамина и 10% WEHI-3D-CM и 1 мг / мл G418. Прохождение клетки в 1:15 разведений из клеток, растущих в лог-фазе. См 24 для более подробной информации о конструкции и экспрессии химерного рецептора.
  3. Контроль Harvest Ba / F3 или / F3 клетки VEGFR2-Epor-Ba с середины лог-фазы культуры. Аккуратно пипеткой, чтобы удалить эти неприкрепленных клеток со дна колбы. Промыть три раза в мыши тоничности фосфатно-солевом буфере, рН 7,3 (PBS), (10 мл, центрифуге при 750 х г в течение 5 мин для восстановления клеточного осадка) , чтобы удалить среду , содержащую IL-3.
  4. Промыть клетки один раз с DMEM и добавками, без WEHI-3D-CM или рекомбинантным IL-3, а затем ресуспендируют в этой среде при концентрации 7,4 × 10 4 клеток / мл (то есть 1000 клеток на 13,5 мкл; 10000 клеток на 135 мкл как было определено путем подсчета с помощью гемоцитометра) дляиспользовать в полуколичественного или количественного вариантов анализа соответственно.
  5. Оценка жизнеспособности клеток для от трипанового синего (ОСТОРОЖНО!). Смешайте трипанового синего в PBS (0,4%) 1: 1 с популяцией клеток и подсчета минимум 100 клеток на гемоцитометра. Клетки, которые занимают краситель считаются мертвыми или умирают. Жизнеспособность более 98% требуется для выполнения анализа.

3. Полу-количественный анализ

  1. Добавить промытые клетки (1000 клеток), содержащихся в 13,5 мкл IL-3-дефицитной среды в лунки 72-луночного планшете при комнатной температуре. Будьте осторожны, чтобы смешать клеточной суспензии во время aliquotting для обеспечения клеток заселение тяжести не концентрации смещения клеток. Используйте хорошо калиброванный P20 автоматизированный пипетку и автоклавного советы.
  2. Добавьте тестовые образцы и контроля в лунки на 10% по объему (1,5 мкл, что делает конечный объем 15 мкл, содержащих 1000 клеток на лунку) с помощью калиброванного P20 пипетку или, предпочтительно, P2 пипетку. Возьмите чаповторно, чтобы гарантировать, что образцы совместимы с условиями культивирования для Ba / F3 клеток в условиях рН, соли и других потенциально цитотоксических / цитостатической веществ. Там , где это возможно, использовать совместимый носитель или буфер (например, DMEM или PBS, соответственно) или разбавить в такой среде или буфере. Растирание с тем же наконечником обеспечит перемешивание.
  3. нет контрольных образцов, включают (I) только питательной среды, содержащей не IL-3; (II) WEHI-3BD-СМ добавляют к среде без добавок на 10% конечного объема; и / или (III), VEGF-A разбавляют до 100 нг / мл в среде без, не содержащую IL-3.
  4. Заполните все неиспользованные лунки планшете стерильной водой, PBS или средой и поместите пластину в увлажненной контейнере (с водой замачивают папиросной бумаги), что позволяет газообмен. Инкубируйте клетки в контейнерах в увлажненной атмосфере , содержащей 10% СО 2. Этот анализ может быть удобно установить в 3 ч на одного человека, если тестовые образцы и компоненты среды доступны.
  5. Оценка пластин, как правило, после 16 часов изинкубация при которой время различение между положительными и отрицательными образцами очевидна. Смотрите рисунок 3 для примеров того , как появляются клетки в культуре. Анализ пластин с использованием стандартного перевернутую фазового контрастного микроскопа при 40 - 100-кратном увеличении.
    Примечание: Лунки, содержащие поддерживающие факторы роста, такие как IL-3 или VEGF-A будет содержать клетки, которые появляются круглые и полупрозрачными. Лунки без поддерживающих факторов роста или только со средой снизят число круглых клеток, а также мертвых или умирающих клеток и клеточных остатков (например, рис 3C). Оценка анализа на 24-48 ч после инкубации является оптимальным для чувствительности.

4. Количественный биопроб

  1. Добавьте промытые клетки (10000 клеток в 135 мкл) в IL-3-дефицитной среды в лунки 96-луночного стандарта микротитрационных планшетов при комнатной температуре. Будьте осторожны, чтобы смешать клеточной суспензии во время aliquotting, чтобы обеспечить оседание клеток под действием силы тяжести не влияет на сеКонцентрация LL.
  2. Добавьте тестовые образцы и контроля в лунки на 10% по объему (15 мкл) с помощью калиброванной пипетки (P20). Позаботьтесь, чтобы гарантировать, что образцы совместимы с условиями культивирования для Ba / F3 клеток в условиях рН, соли или других потенциально цитотоксических / цитостатической веществ. Там , где это возможно, использовать совместимый носитель или буфер (например., DMEM или PBS) , или развести в такой среде или буфере. Фильтр стерилизовать небольшие объемы с использованием 0,22 мкм пор ацетата целлюлозы блок фильтровальную центрифугу трубку.
  3. Выдержите смесь клеток, факторы роста и / или ингибитор агентов в увлажненной атмосфере 10% CO 2 в течение 48 часов. Выполнение анализа в увлажненной контейнере, который имеет папиросной бумаги водянистыми и позволяет газообмена. По окончании инкубационного периода, оценить анализ, используя один из альтернативных методов, перечисленных ниже, которые являются суррогатными маркерами жизнеспособного количества клеток в скважине.
  4. Вариант № 1: 3 H-thymidiВключение пе
    Примечание: Этот Количественное предназначен для формата 96-луночного планшета.
    1. После инкубации планшеты для анализа в течение 48 ч при температуре 37 ° С (объем 150 мкл на лунку), добавляют 3 H-тимидина в объеме 50 мкл среды для анализа (Ba / F3 , культуральной среды без IL-3 / WEHI-3D ​​CM) на лунку при концентрации 20 мкКи / мл, получая конечную дозу 1 мкКи на лунку.
    2. Инкубируйте пластины в течение еще 4 ч при 37 ° С до сбора клеток с использованием харвестера клеток. Извлечение отдельных образцов путем размещения фильтров в сцинтиллятор и количественно с помощью сцинтилляционного счетчика Liquid.
  5. Вариант № 2: Биолюминесценция Обнаружение клеточной АТФ
    Примечание: Этот подход использует АТФ реагент мониторинга, который при сочетании с лизата клеток может генерировать сигнал биолюминесценции, который отражает жизнеспособных клеток в популяции.
    1. Лизировать клетки для извлечения АТФ и использовать ATP Реагент мониторинга для генерированиялюминесцентного сигнала в соответствии с инструкциями изготовителя. Read люминесценцию с помощью фотометра, совместимый с форматом пластины 96-луночного.
  6. Вариант № 3: Ферментативный Снижение показателя красителя жизнеспособными клетками
    Примечание: Анализы, основанные на ресазурин показывают хорошую корреляцию с жизнеспособности клеток.
    1. Объединить культивируемые клетки с красителем на основе резазурин и количественного анализа с использованием флуоресцентного ридера пластины в соответствии с инструкциями изготовителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В данном разделе представлены результаты эксперимента , демонстрирующие существенные черты VEGFR-2-Epor-Ba / F3 биопроб (см рисунок 1 для принципов анализа). Другие опубликованные исследования демонстрируют расширение сферы применения анализа альтернативных VEGFR-2 лигандов, мутантных молекул VEGF и ингибирующих моноклональных антител 8,10,19,24-30.

Данные , представленные здесь , представляют собой анализ , в котором / F3 , количественное определение биологической активности VEGFR-2-Epor-Ба используется для количественного определения активности трех рекомбинантных человеческих лигандов (VEGF-A 165, VEGF-C и VEGF-D) со специфичностью по отношению к VEGFR -2 в присутствии ингибиторного моноклональных антител (бевацизумаб) к VEGF-A 165. Данные были нормализованы по сравнению с ответом на VEGF-165 в одиночку (рисунок 2). Как и следовало ожидать, бевацизумаб блокировал действие VEGF-A 165 в анализе, ноне оказывает влияния на активность VEGF-C и VEGF-D.

В полуколичественного варианте анализа или при наблюдении анализа в ходе его разработки, просмотр анализа с использованием стандартного перевернутой микроскопа фазы может дать ценную информацию о ходе анализа. Анализ твердофазного иммуноферментного анализа (рисунок 3) показывает хорошую жизнеспособность VEGFR-2 Epor-Ba-биопроб клеток / F3 при инкубации среду , содержащую IL-3, или лигандом для VEGFR-2, например, VEGF-A. Эти клетки являются большими и полупрозрачными, и нет или минимальные свидетельства о зернистости в цитоплазме клеток или остатков клеток в культуре. В скважине без каких-либо дополнительных факторов роста уже существует доказательство уменьшенного числа клеток и несколько здоровых клеток. Клетки, присутствующие имеют значительную зернистость в их цитоплазме и остатки клеток является последовательным особенностью культуры. Через 48 часов не существует никаких признаков жизнеспособных клеток.


Рисунок 1. схематичным чертежом , описывающим Принципы VEGFR-2-Epor-Ba / F3 биологических испытаний. (А) Ba / F3 клетки фактор-зависимой и требуют экзогенный фактор роста , таких как ИЛ-3 , чтобы стимулировать рост клеток / жизнеспособность с помощью эндогенные IL-3 рецепторов и сигнальный путь JAK. Если Epor выражается в этих клетках спасение может также произойти через пути JAK. Экспрессия рецептора тирозинкиназы полноразмерного, такие как VEGFR-2 приводит к минимальной сигнализации в качестве нижестоящих мишеней активации VEGFR-2 не участвуют в пути JAK. Затем химерный рецептор с внеклеточной области VEGFR-2, слитого с трансмембранного и цитоплазматического областей Epor, при трансфекции в / F3 клеток Ba и стимулировали с конкретными VEGFR-2 лигандов, способен активировать путь JAK и вождение клеткивыживание и распространение. (B) VEGFR-2-Epor-Ba / F3 клетки экспрессируют значительные уровни химерного рецептора VEGFR-2-Epor , которые могут быть определены количественно с помощью проточной цитометрии. После того, как вымываются из IL-3, содержащие среду, клетки помещают в различных условиях культивирования, на каком диске выживание / пролиферацию клеток. Нетрансфецированной Ba / F3 клетки или VEGFR-2-Epor-Ba / F3 клетки без специфических факторов роста не растут / выживают. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2

Рисунок 2. Оценка VEGFR-2 ЛИГАНДАМИ в / F3. Биоанализа IL-3-зависимых Ba / F3 клеток VEGFR-2-Epor-Ba , выражающих мыши VEGFR-2-Epor химеры были высеяны в среде без IL-3 ( за исключением длякнопки + IL-3 подмножество, как было указано) плюс человеческого VEGF-A 165, VEGF-CΔNΔC (ВК) (это форма VEGF-C , который состоит из центральной области и исключает N и С-концевой пропептиды), или СЭФР-DΔNΔC (это является формой VEGF-D, которая включает в себя центральную область и исключает N и с-концевые пропептиды (VD)) при 100 нг / мл и гуманизированного нейтрализующее моноклональное бевацизумаба антитела (который связывает и ингибирует VEGF-A, но не VEGF-C или VEGF-D), или контролировать не-нейтрализующих антитело трастузумаб, как показано на 0,75 мкМ. NF = среда, не содержащая дополнительных факторов роста. Сорок восемь часов спустя, относительное число живых клеток количественно оценивали с помощью функции обнаружения биолюминесценции клеточного АТФ. Вертикальные столбики представляют собой средства (нормализованная по сравнению с ответом на VEGF-165, только первый бар) и стандартная ошибка среднего значения трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы VIEW большую версию этой фигуры.

Рисунок 3

Рисунок 3. VEGFR-2-Epor-Ba / F3 клетки зависят от внешних факторов роста для выживания. Примеры VEGFR-2-Epor-Ba / F3 биопроб , в которых IL-3-зависимых Ba / F3 клетки , экспрессирующие мышь VEGF рецептором 2-Epor химеры были высеяны в среде (А) , содержащей 10% WEHI-3D ​​кондиционированной среды , которая обеспечивает IL-3, (в) 100 нг / мл VEGF-A 165 (без ИЛ-3), или (C) , средний человек с нет IL-3 или дополнительные факторы роста. Культура изображается через 24 ч в анализе , показывающий высоко жизнеспособных клеток в присутствии IL-3 (а) или VEGF-A 165 (В), в то время как в культуре, без IL-3 или дополнительные факторы роста (C) гибель клеток и красныйuced жизнеспособность отчетливо видны. Весы бары 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ, описанный здесь, основан на использовании кювет высокой жизнеспособностью, которые зависят от факторов роста. Поэтому клетки должны быть тщательно культивируют, чтобы гарантировать, что они являются фактором-зависимыми, и сохраняют экспрессию химерного рецептора. Обеспечение того, что среда свежеприготовленные и не сохраняется в течение чрезмерно длительного периода и что WEHI-3D ​​СМ обладает высокой активностью имеет важное значение. Клетки должны быть тщательно отмывают от IL-3, содержащей среды в среду для анализа, чтобы гарантировать, что ни один остаточный ИЛ-3 не загрязняет анализа при экспозиции клеток с Спасении лигандов. В качестве лигандов могут прийти в ряде различных форм, уход должны быть приняты при подготовке их для опробования. Консерванты, антибактериальные агенты, соли или буферы различных рН могут повлиять на анализ, и поэтому параллельное тестирование нетрансфецированной Ba / F3 клетки могут сообщить о проблемах, связанных с буферными.

Мы используем как полуколичественный и количественные протоколы. Полу-quantitatiве анализа позволяет быстрой оценки активности образцов до совершения полностью количественного анализа, который требует больше времени и образца. Количественный метод используется исключительно при генерации данных для публикации. Альтернативные методы определения жизнеспособности культуры являются относительно простыми. Количественный анализ был адаптирован к ряду различных форматов для количественной оценки пролиферации, и мы использовали (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) МТТ 30, обнаружение биолюминесценции клеточного АТФ (неопубликованные), резазурин на основе красителя (рисунок 2) и 3 H-тимидина 31 с успехом. В последние годы мы эволюционировали от использования излучения для адаптации биолюминесценции подходы и использовали резазурин на основе красителя из-за его экономической эффективности. Все подходы дают соответствующие результаты, и выбор может зависеть от наличия реагентов и аssociated специализированных читателей пластины в данной лаборатории / института или знакомство с конкретными подходами.

Устранение неполадок вращается вокруг деятельности трех основных компонентов анализа, я) IL-3 СМ, II) VEGFR-2-Epor-Ba / F3 клеток и III) стимулирующие лиганды. Плохие уровни IL-3 в СМ из-за неадекватного WEHI 3D клеток в исходной культуре, плохие условия хранения, чрезмерных циклов замораживания-оттаивания или с использованием при слишком высокой концентрации могут создать плохо растущих культур, которые помешают анализа. Это, как правило, обнаруживается в контрольных лунках, как клеточные популяции растет медленно, теряют нормальный яркий и круглый внешний вид. VEGFR-2-Epor-Ba / F3 анализа клетки могут потерять клеточной поверхности экспрессию химерной конструкции с течением времени при хранении в культуре в течение длительных периодов времени. Поддержание хороших количества жидких запасов азота позволяет свежие культуры клеток высоко экспрессирующие химерный рецептор, чтобы быть доступны в любое время. Если требуется высокая выражающий население может бытьдостигается путем выращивания клеток в VEGFR-2 лигандов и выбора популяции, выражающую высокие уровни химерного рецептора с помощью проточной цитометрии сортировки. Эти клетки затем дополнительно расширен в культуре для замораживания.

В то время как методика является удобной и упрощенной альтернативой для анализа взаимодействия с VEGFR-2 внеклеточного домена не может быть видно, чтобы заменить более сложные эксперименты, в которых нативный рецептор на первичных эндотелиальных клетках зондируют в присутствии других VEGFRs, корецепторами, такие как neuropilins. Клетки, на которых основан этот анализ (В-клетки) отличаются от эндотелиальных клеток и поэтому не могут быть использованы для изучения цитоплазматические сигнальные пути и факторы транскрипции, которые реагируют на активацию VEGFR-2 в эндотелиальных клетках. Тем не менее, этот метод обеспечивает полезный подход к анализу взаимодействия рецептор-лиганд, который лежит между простым анализе связывания, рассматривающей взаимодействие лиганда с иммобилизованным РЕЦЭПтор построить (например, внеклеточной области рецептора растворимого или внеклеточной области рецептора, слитого с иммуноглобулином), а также при анализе связывания рецептора и вниз по течению воздействия, наблюдаемые в анализах связывания с первичным звеном эндотелиальных клеток. Он предоставляет систему для обеспечения связывания и сшивка рецепторов, первые два этапа, с помощью которых многие рецепторного типа тирозинкиназы обычно инициировать их сигнальный каскад трансдукции. Его применение в ряде академических и коммерческих установок показал, что принимается в качестве полезного анализа для изучения характеристик связывания, особенно при оценке вариантных лигандов или ингибиторов взаимодействия рецептор-лиганд.

Анализ также полезен для анализа новых ингибиторов с внеклеточным доменом рецептора или его лигандов. Анализ может быть дополнительно использован для быстрого скрининга варианты лигандов или рецепторов внеклеточные областей рассматривать в контексте геномных мутаций (как унаследованных и соматический) обнаружили в человеческом Геуказанные в другом месте при таких заболеваниях, как рак 32,33 , чтобы определить их функциональное последствие. Следовательно, применение этого VEGFR-2 теста могут увеличиваться в будущем. Кроме того, общий подход, лежащий в основе этого анализа могут быть использованы в более широком смысле для клеточной поверхности рецепторных тирозинкиназ, которые составляют большую и важную семейство сигнальных молекул в состоянии здоровья и болезни.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Стивен А. укладчик и Марк М. Эйкен являются акционерами циркадного Technologies Ltd., компании, разрабатывающей терапии путем воздействия на семью VEGF факторов роста.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
  2. Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
  3. Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
  4. Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
  5. Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
  6. Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  7. Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
  8. Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
  9. Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
  10. Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
  11. Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
  12. Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
  13. Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
  14. Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
  15. Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
  16. Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
  17. Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
  18. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
  19. Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
  20. McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
  21. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
  22. Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
  23. Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
  24. Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
  25. Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
  26. Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
  27. Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
  28. Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
  29. Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
  30. Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
  31. Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
  32. Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
  33. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).

Tags

Клеточной биологии выпуск 109 Рецептор СЭФР лиганд ингибитор сигнализации растворимые рецепторы фактор роста белка количественное определение биологической активности моноклональное антитело
Простой биопроб для оценки факторов роста эндотелия сосудов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stacker, S. A., Halford, M. M.,… More

Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter