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Immunology and Infection

Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

In diesem Beitrag wird ein Protokoll für die schnelle und standardisierte Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Vollblut-Proben beschrieben. Dieses Verfahren wird auf der hypotonischen Lyse der Erythrozyten basieren und kann als an Blut von nicht-menschlichen Ursprungs sowie für die menschliche Proben angewendet werden. Die geringe anfängliche Probenvolumen von etwa 50 bis 100 & mgr; l macht dieses Verfahren für wiederkehrende Blutentnahme von kleinen Labortieren. Darüber hinaus wird Leukozyten Anreicherung innerhalb von Minuten und mit geringem Material Anstrengungen in Bezug auf Chemikalien und Instrumentierung erreicht, ist dieses Verfahren anwendbar in mehreren Laborumgebungen.

Standardisierte Reinigung von Leukozyten wird mit einem hochselektiven Färbeverfahren kombiniert Halogenierung Peroxidaseaktivität von Häm - Peroxidasen, Myeloperoxidase (MPO) und eosinophile Peroxidase (EPO), dh die Bildung von unterchloriger und hypobromige Säure (HOCl und HOBr) auszuwerten. Während MPO stark in neut ausgedrücktrophils, die häufigste Immunzelltyp im menschlichen Blut sowie in Monozyten, die verwandten Enzym EPO wird ausschließlich in Eosinophilen exprimiert wird. Die Halogenierung Aktivität dieser Enzyme wird unter Verwendung der fast HOCl- und HOBr-spezifischen Farbstoff aminophenyl fluorescein (APF) und den primären Peroxidasesubstrat Wasserstoffperoxid behandelt. Bei der anschließenden Durchflusscytometrieanalyse alle Peroxidase-positive Zellen (Neutrophile, Monozyten, Eosinophilen) unterscheidbar und ihre Halogenierung Peroxidase-Aktivität quantifiziert werden können. Da APF Färbung kann mit der Anwendung von Zelloberflächenmarkern kombiniert werden, kann dieses Protokoll speziell verlängert werden, um Leukozyten-Unterfraktionen adressieren. Das Verfahren ist für HOCl und HOBr Produktion sowohl in der Human- und in Nagetier Leukozyten zu erkennen.

Angesichts der breiten und mannigfaltig diskutiert immunologische Rolle dieser enzymatischen Produkte in chronisch-entzündlichen Erkrankungen kann dieses Protokoll zu einem besseren Verständnis des beitragenimmunologischer Relevanz von Leucocyten abgeleitetes Häm Peroxidasen.

Introduction

Polymorphkernigen Leukozyten (PMNs, die auch als Granulozyten) und Monozyten sind wichtige zelluläre Komponenten des angeborenen Immunsystems im Blut 1,2. Sie tragen zur primäre Abwehr von Krankheitserregern sowie zur Aktivierung des erworbenen Immunsystems und die Einleitung einer systemischen Entzündungsreaktion 2-4. Doch vor allem Neutrophile, die am häufigsten vorkommende Art von Granulozyten und Monozyten tragen auch wesentlich zur Regulierung und die Beendigung der akuten entzündlichen Ereignisse 5. Daher können diese Zellen auch eine wichtige Rolle bei chronisch - entzündlichen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis 6,7 spielen. In der Tat, Asthma, eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege, wird durch eine beeinträchtigte Apoptose von Eosinophilen gekennzeichnet, die zweithäufigste Granulozyten Typ im Blut 8. Doch die Apoptose von Granulozyten und deren schnelle Beseitigung durch Makrophagen sind zwei wesentliche Schritte, die während der zellulären BeendigungEntzündungs ​​11.09.

In den genannten Immunzellen zwei eng verwandte Enzyme, nämlich Myeloperoxidase (MPO, Neutrophilen und Monozyten) und eosinophile Peroxidase (EPO, Eosinophilen) können 12,13 gefunden werden. Diese Häm Peroxidasen klassisch sind mit der humoralen Immunantwort , wie sie im Zusammenhang mit zwei elektronisch zu oxidieren (pseudo-) -halogenide zu dem entsprechenden hypo (pseudo) halogenhaltige Säuren , die für ihre bakterizide Eigenschaften 14-16 bekannt sind. Unter physiologischen Bedingungen MPO hauptsächlich Formen Hypochlorsäure (HOCl) und hypothiocyanite (- OSCN) , während die letztere und Hypobromsäure (HOBr) durch EPO 17-19 gebildet werden. Neue Ergebnisse deuten darauf hin , dass diese (pseudo-) Halogenierung Enzymaktivität auch für die Regulierung der Entzündungsreaktionen und zur Beendigung von Immunreaktionen 20,21 beitragen. In der Tat wurden die HOCl Produktion von MPO und daraus abgeleitete Produkte gezeigt T - Zell-basierte adaptive Immunantwort 22-2 zu unterdrücken4.

Um weitere Einblicke in die immunologischen Rolle der Leukozyten aus dem angeborenen Immunsystems bei chronischen Entzündungskrankheiten zu gewinnen und den Beitrag von MPO und EPO dieser physiologischen Funktion zu bestimmen, haben wir ein Verfahren, um schnell Leukozyten aus kleinen Blutproben für einen nachfolgenden spezifischen reichern Bestimmung der Halogenierung Peroxidase-Aktivität in diesen Zellen. Für Erythrozyten-Depletion haben wir ein standardisiertes Verfahren mit zwei nachfolgenden hypotone Lyse Schritte mit destilliertem Wasser ausgewählt, die bei niedrigen Materialkosten zu einer schnellen Leukozyten-Anreicherung führt. Für die anschließende Bestimmung der Halogenierung MPO und Aktivität EPO die HOCl- und HOBr-spezifischen Farbstoff aminophenyl Fluorescein (APF) wurde 25-27 verwendet. Im Gegensatz zu der Anwendung von unspezifischen Peroxidase Färbemethoden 28,29, ermöglicht dieser Ansatz die selektive Erfassung der Halogenierung Peroxidase - Aktivität, die häufig bei schweren infl beeinträchtigt wirdammation 30,31.

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Protocol

Alle menschlichen Blutproben wurden von gesunden Freiwilligen erhalten und die angelegte Leukozyten-Anreicherung Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig. Die Versuche mit Rattenblut wurden von der zuständigen örtlichen Ethikkommission (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege und Verwendung zugelassen.

1. Experimenteller Aufbau

Hinweis: Da die hypotone Lyse Verfahren zur Abreicherung von Erythrozyten aus den Blutproben eine zeitkritische Verfahren, bereiten alle notwendigen Geräte (zB Puffer) für diesen Teil des Protokolls im Voraus.

  1. Beschriften Sie ein 15 ml Zentrifugenröhrchen für hypotone Lyse und ein 1,5-ml-Probenröhrchen für die nachfolgende aminophenyl Fluorescein (APF) Färbung pro Blutprobe.
    1. Wenn die Leukozyten-Anreicherung wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, führen Sie diese Kennzeichnung unter einem FlussBox.
  2. Bereiten etwa 12 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10 mM) pro Probe. Je nachdem, ob die Leukozyten werden unter sterilen Bedingungen oder nicht isoliert werden, bereiten entweder PBS durch sterile gebrauchsfertige Lösung von einem Anbieter oder durch PBS Tabletten in destilliertem Wasser gelöst. Überprüfen Sie den pH-Wert und bei Bedarf einstellen auf pH 7,4 durch geringe Mengen an 0,1 M HCl und NaOH Lösungen.
    1. Löse PBS-Tabletten (siehe Tabelle der Materialien) in 200 ml destilliertem Wasser mit einer nicht-sterilen Pufferlösung für etwa 16 Proben ausreichend zu erhalten. Falls gewünscht, sterilisiert diese Lösung durch Sterilfiltration.
  3. Bereiten etwa 1 ml Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) mit Ca 2+ ergänzt pro Probe.
    1. Man löst 970 mg HBSS Salz in 100 ml (Endvolumen) doppelt destilliertem Wasser. Vor dem Befüllen auf das Endvolumen, überprüfen Sie den pH-Wert und stellen Sie es auf pH 7,4. Aufgrund seiner geringen Pufferkapazität, bereiten diese Puffer täglich frisch eind Legen Sie den pH-Einstellung mit besonderer Sorgfalt durch den Einsatz geringer Mengen von 0,1 M HCl und NaOH-Lösungen durchführen.
      HINWEIS: Die sterile Lösung kann verwendet werden, je nach dem Experiment. Die Lösung kann durch Sterilfiltration sterilisiert werden.
  4. Neben den beiden Puffer, Etikett und bereiten ein Rohr (zB 50 ml Zentrifugenröhrchen) oder Kolben (zB 250 ml Messbecher) mit doppelt destilliertem Wasser für die hypotone Lyse Verfahren im Voraus. Bereiten Sie ca. 10 ml Wasser pro Probe.
  5. Bereiten Sie einen Behälter mit zerstoßenem Eis für die APF-Färbung (Abschnitt 3), die auf Eis durchgeführt wird.
  6. Bereiten Sie Teilmengen von APF, im Voraus die schnelle Zubereitung von Arbeitslösungen während der Färbung (Schritt 3.2) und zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen der APF-Lösung verwendet werden kann.
    HINWEIS: APF wird üblicherweise als 5 mg / ml (11,81 mM) Stammlösung in Methylacetat erhalten.
    1. Gefrierteilmengen von 10 bis 100 & mgr; l in 0,5-ml-Röhrchen. Zur Färbung der APF eine endgültigeFarbstoffkonzentration von 10 uM verwendet wird (Schritt 3.8).

2. hypotonische Lyse der Erythrocyten

HINWEIS: Führen Sie die hypotone Lyse Schritte (mit Ausnahme der Zentrifugationsschritte) unter einer Laminar-Flow-Bank Kontamination zu vermeiden. Führen Sie das gesamte Verfahren bei Raumtemperatur. Da die hypotone Lyse ein zeitkritischen Prozess ist, stellen Sie die Pipetten für Wasser (2 ml) und PBS (5 ml) zusätzlich im Voraus und öffnen Sie das Wasser und PBS-Kolben vor Beginn des Verfahrens. Bewahren Sie die PBS-Lösung und das destillierte Wasser bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch.

  1. Von jeder Blutprobe Transfer 100 ul in die entsprechende 15 ml Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: In unseren Experimenten Blutproben enthalten in der Regel 10 U / ml Heparin, um Koagulation zu vermeiden. Doch aufgrund der unterschiedlichen Quellen des Probenmaterials der Art und Konzentration des Antikoagulans kann unterschiedlich sein. Deren Einfluss auf die APF-Färbung sollte getestet werden comparing die Ergebnisse zu den Ergebnissen aus Blutproben mit anderen Arten oder Konzentrationen von Antikoagulans ergänzt erhalten.
  2. 2 ml destilliertem Wasser und die Proben mischen mit einem Vortexer auf einen mittleren Wert eingestellt. Inkubieren Sie die Proben für 60 Sekunden, dann fügen Sie 5 ml PBS pro Probe und mischen Sie den Vortexer.
    HINWEIS: bis zu etwa 5 Proben können parallel hergestellt werden. Halten Sie die Probe, um das gleiche für die Zugabe von Wasser und PBS vergleichbar Inkubationszeiten zu erreichen.
  3. Nach der Regeneration von isotonischen Bedingungen durch Zugabe PBS (Schritt 2.2) die verbleibenden intakten Zellen in allen Proben durch Zentrifugation für 6 Minuten bei Raumtemperatur und 450 x g pelletieren.
  4. Entfernen Sie den Überstand, indem sie in einer Tabelle Abfallbehälter zu gießen. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich durch die Zentrifugationsröhrchens Umkehren und die Öffnung auf einem Papiertuch klopfen. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet so trocken wie möglich ist.
  5. Wiederholen Sie die hypotonischen Lyseverfahren, wie zuvor beschrieben (Schritt 2.2).
    NOTE: Im Prinzip dieser hypotonischen Lyseverfahren (Schritte 2,3 bis 2,5) mehr als einmal wiederholt werden kann, von der Reinheit des gemischten Leukozytenfraktion in Abhängigkeit zu erhalten. Nach zwei Lyse der Anteil der verbleibenden Erythrozyten in der erhaltenen gemischten Zellfraktion Schritte ist etwa 25%.
  6. Pellet die verbleibenden intakten Zellen durch Zentrifugation für 6 Minuten bei Raumtemperatur und 450 x g. Entfernen Sie den Überstand (siehe Schritt 2.4). In 500 ul HBSS zu dem Pellet und vorsichtig lösen, bis eine homogene Lösung erhalten wird. Bringen Sie jede Probe auf den entsprechend markierten 1,5 ml Probenröhrchen.
  7. Je nach Experiment analysieren direkt erhaltenen Proben (beispielsweise über Durchflusszytometrie) 25, Fleck mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern (zur Identifizierung von einzelnen Zelltypen) 32, inkubieren mit Zellreize (für die Zellaktivierungsversuche) 33 oder auf Eis gelagert und Verwendung später. Je nach dem Ziel der Studie, führen unmittelbar nachfolgenden Experimente andie gemischte Leukozytenfraktion da Granulozyten haben eine relativ kurze Halbwertszeit von etwa 20 h.
    ANMERKUNG: Dies gilt auch für die Peroxidase-Aktivität-Färbung unten beschrieben.

3. Halogenierungs Peroxidaseaktivität Anfärben

HINWEIS: HOCl- und HOBr-Produktion durch die Blut abgeleiteten Häm Peroxidasen MPO und EPO wird durch Verwendung APF quantifiziert, die von den genannten unterhalogenige Säuren Fluorescein oxidiert wird. Deshalb, wenn Zellmarkierung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern in Kombination mit APF-Färbung durchgeführt wird, zu vermeiden Fluorophore, die mit dem Emissionssignal von Fluorescein stören.

  1. Führen Sie APF-Färbung bei 4 ° C auf Eis.
  2. Für eine Arbeitslösung von APF Herstellung auftauen eines geeigneten Aliquots des Farbstoffs (beispielsweise 10 & mgr; l, 11,81 mM) und verdünnt sie mit HBSS auf genau 1 mM (zB 108,1 & mgr; l Puffer in die 10 & mgr; l hinzufügen).
    1. Für jede Probe (500 & mgr; l Zelllösung) vorbereiten 5 μl der beschriebenen APF-Arbeitslösung. Dementsprechend verwenden ein 10-ul-Aliquot von APF (11,81 mM), die 118,1 ul APF-Arbeitslösung (1 mM) ergibt etwa 20 Proben vorzubereiten. Durch Verlust beim Pipettieren etwa 10% mehr APF Arbeitslösung als berechnet vorzubereiten.
  3. Um die Peroxidase Spezifität der APF - Färbung zu prüfen, Kontrollproben mit dem Häm Peroxidasehemmstoff 4-Aminobenzoesäurehydrazid (4-ABAH) 35 vorzubereiten.
    1. Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung von 4-ABAH (151,17 g / mol) in Dimethylsulfoxid (DMSO) durch Verdünnen von 75,6 mg 4-ABAH in 500 & mgr; l Lösungsmittel. Weitere 4-ABAH 1/10 in HBSS verdünnen.
  4. Zur Herstellung einer Lösung , H 2 O 2 Arbeits Etikett zwei 1,5 ml Zentrifugationsröhrchen mit "70 mM H 2 O 2" und "7 mM H 2 O 2" bezeichnet.
    1. In dem Rohr mit "70 mM H 2 O 2", verdünne 10 ul frischeiner 30% Stammlösung (8,8 mM) H 2 O 2 unter Verwendung von 990 & mgr; l destilliertem Wasser mit einer Konzentration von etwa 88 mM zu erhalten. Lagern auf Eis und innerhalb von 4 Stunden.
      HINWEIS: H 2 O 2 wird in der Regel als 30% ige Stammlösung von den Lieferanten geliefert. Wenn sie bei 4 ° C gelagert, ist es seit etwa 3 Jahren stabil. Führen Verdünnungen von H 2 O 2 in destilliertem Wasser Zersetzung zu vermeiden. H 2 O 2 Verdünnungen könnte auch in 0,1 M NaOH - Lösung hergestellt werden.
    2. Zur Bestimmung der genauen H 2 O 2 -Konzentration eine weitere 1 bis 10 Verdünnung von dem ersten H 2 O 2 - Stammlösung (etwa 88 mM) durch Zusatz von 100 & mgr; l dieser Lösung zu 900 ul destilliertes Wasser in 1,5 - ml - Röhrchen vorbereitet markiertem "7 mM H 2 O 2".
    3. Nehmen Sie ein Spektrum im nahen UV - Bereich (zB 200-300 nm) durch eine UV-Vis - Photospektrometer und verwenden die Absorption bei 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) anhand der H 2 O 2 -Konzentration in der zweiten H 2 O 2 Stammlösung 34 zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die Referenz Küvette nur destilliertes Wasser enthält. Für die Messung Verwendung Quartzküvetten als ein Spektrum im UV-Bereich aufgezeichnet.
    4. Aus diesem Ergebnis errechnen die genauen Konzentrationen beider H 2 O 2 Stammlösungen. Passen Sie die Konzentration der ersten Stammlösung in dem "70 mM H 2 O 2" Probenröhrchen genau 70 mM durch eine entsprechende Menge an destilliertem Wasser zugegeben wird . Speichern Sie die erhaltene Arbeitslösung auf Eis und innerhalb von einer Stunde.
  5. Werden 5 & mgr; l der 4-ABAH-Arbeitslösung (100 mM) auf die entsprechenden Proben auf eine Endkonzentration von 1 mM. Inkubiere die Proben für 15 min bei 37 ° C im Inkubator vor APF hinaus.
  6. Werden 5 ul APF-Arbeitslösung (1 mM) zu jedem500 & mgr; l Probe, die eine endgültige Farbstoffkonzentration von 10 uM zu erhalten. Mischen Sie die Proben vorsichtig (zB durch Verwendung des Wirbelmischer auf mittlerer Stufe) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
  7. Werden 5 & mgr; l H 2 O 2 Arbeitslösung (70 mM) zu jeder 500 ul Probe für eine Endkonzentration von 700 uM. Vorsichtig mischen die Proben und Inkubation sie für 60 min bei 37 ° C. Führen Sie geeignete Kontrollmessungen parallel.
    HINWEIS: Kontrollmessungen zeigten , dass 700 & mgr; M H 2 O 2 für die Zellen nicht toxisch sind. Es wurden auch keine signifikanten zellulären Reaktionen beobachtet.
    HINWEIS: Die APF - Färbung auch durch Weglassen der Zugabe von H 2 O 2 in Abhängigkeit von der wissenschaftlichen Fragestellung durchgeführt werden kann. In Abwesenheit von Wasserstoffperoxid nur der basalen Chlorierungsmittel MPO und EPO - Aktivität bestimmt wird , während die Zugabe von H 2 O 2 die Erfassung des maximalen HOCl und HOBr - Produktion durch die Zellen ermöglicht. Ter Letzteres bedeutet eine deutlich höhere Fluoreszenzsignal.
  8. Für die Zellen pelletiert, Zentrifugieren Sie die Proben für 10 Minuten bei Raumtemperatur und 400 x g. Gründlich entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu zerstören und 250 ul HBSS fügen Sie die Zellen erneut zu suspendieren.
    HINWEIS: Die Proben sind nun bereit für die Analyse über Durchflusszytometrie 25.
  9. Lagern Sie die Proben im Dunkeln bis zur Analyse Bleichen zu vermeiden. Nach Anregung bei 480-490 nm bei etwa 525 nm 37 die Emission von Fluorescein erkennen.

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Representative Results

Wie zuvor berichtet , oben gedreht beschriebene Verfahren geführt anwendbar sowohl für die menschliche zu sein und nicht menschlichen Material 32. Außerdem, wie für die Mäuse, die mit asthmatischen Symptomen der Färbung APF gezeigt ist, kann ein geeignetes Werkzeug sein, um Unterschiede in der systemische proinflammatorische Zustand erkennen. Deshalb wird in einer anschließenden Studie , die wir dieses Protokoll zur Bewertung wiederholt die Halogenierung Aktivität von MPO (und EPO) in der weiblichen dunklen Agouti Ratten mit Pristan-induzierte Arthritis (PIA). Ein repräsentatives Beispiel für Leukozyten - Anreicherung und Färbung während dieses Experiments durchgeführt wird in Abbildung 1 dargestellt. Etwa 200 & mgr; l Vollblut wurde aus dem retrobulbären Venenplexus des Tieres unter Narkose und heparinisiert erhalten. Die Erythrozytenabbau und eine nachfolgende APF-Färbung wurden unter Verwendung von 100 & mgr; l Probenvolumen durchgeführt. Danach wurde die Probe mittels Durchflusscytometrie analysiert.

(1A), eine starke Verarmung von Erythrozyten aus der Probe erzielt wurde. Weiterhin verschiedenen Leukozytentypen deutlich erkennbar waren, die durch Aufbringen von fluoreszenzmarkierten Zelloberflächenmarker (nicht gezeigt) identifiziert. Kurz die Erythrozyten (CD235a-positiv) / Zelle nur Trümmer Region für 22% der Ereignisse berücksichtigt, während etwa 48% der Ereignisse als CD16-positive Neutrophile identifiziert wurden. Des Weiteren 3% der Veranstaltungen wurden jeweils als CCR3-positive Eosinophilen und CD14-positiven Monozyten und etwa 19% der Ereignisse identifiziert entfielen CD5 / CD19-positive B und T-Lymphozyten sind. Die Intensitätsverteilung des APF-abgeleitete Fluoreszenz (1B) deutlich die Unterscheidung von peroxydasenegativ Erythrozyten und Lymphozyten erlaubt , während Monozyten und Eosinophile zu einer moderaten APF Oxidation geführt und Neutrophile wurden stark positive Peroxidase unter dem chOsen experimentellen Bedingungen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der hohen Fülle von MPO in den letzteren Zellen im Vergleich zu der Enzymkonzentration in Monozyten 20. Die relativ schwache Reaktion der Eosinophilen kann durch die Tatsache erklärt werden, dass kein Bromid gegeben, die das EPA abgeleiteten Bildung von HOBr aufgefordert haben. Vorläufige Studien an isolierten Eosinophilen hat überraschenderweise keinen großen Einfluss von außen hinzugefügt Bromid auf der APF Oxidation durch diese Zellen zeigen. Dennoch Oxidation von APF von den Eosinophilen wurde beobachtet , die durch die Einführung von geringen Mengen an Br erklärt werden kann - über den Pufferlösungen (PBS und HBSS). Alternativ erzeugen EPO kann auch kleine Mengen von HOCl, zumindest unter sauren Bedingungen (beispielsweise in Phagolysosomen).

Abbildung 1
Abbildung 1: Leukocyte Anreicherung und APF-derived Fluoreszenz in einem Blutmikroprobe von einer Ratte. Eine Menge von etwa 200 & mgr; l Vollblut wurde aus dem retrobulbären Venenplexus eines weiblichen Dunkle Agouti Ratten erhalten. Nach Anwendung des beschriebenen Hämolyse Verfahren zu 100 ul Blut und einem nachfolgenden APF die gemischte Zellfraktion Färbung wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie durch den FSC gezeigt / SSC Plot (A) wurden die Erythrozyten von der Probe und die verschiedenen Leukozyten - Typen unterschieden werden könnte leicht stark abgereichert. Die Verteilung des APF-derived Fluoreszenzintensität (B) zeigten deutlich , Häm - Peroxidase-negativen Zellen (Erythrozyten und Lymphozyten) sowie Leukozyten mit moderater (Eosinophilen und Monozyten) oder stark (Neutrophile) Halogenierung Peroxidase - Aktivität. Bitte klicken Sie hier anzuschauen größere Version der Figur.

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Discussion

Als Neutrophile die häufigsten Leukozyten im menschlichen Blut die Isolierung von Peroxidase-positive Zellen sind oft konzentriert sich nur auf diesen Zellen und enthält eine Trennung von Neutrophilen von anderen Leukozyten durch Dichtegradientenzentrifugation 38. Doch wie Neutrophile viel weniger reichlich in murine Blutproben sind 39 für die letztere komplizierteren Methoden müssen 40 verwendet werden. Darüber hinaus auch beide Methoden zur Entfernung von Peroxidase-positive führen Monozyten aus den Proben und aufgrund der Notwendigkeit größerer Blutmengen (zB 400 & mgr; l 41), sind nicht für Mikroproben während wiederholten Blutentnahme aus kleinen Labortieren erhalten 38,40. Die Reinigung von Maus - Neutrophilen aus peritonealen Exsudaten müssen auch die Opfer der Tiere und überdies nicht aus Blut gewonnenen Granulozyten 38,40 ergeben. Kürzlich Methoden entwickelt hochgereinigten Granulozyten-Fraktionen aus murinen bl zu erhaltenOOD (beispielsweise die Anwendung von Antikörpern) sind oft teuer, kompliziert und zeitraubend und 40,42,43 wieder nur konzentrieren sich auf die Reinigung einer Peroxidase-positiven Leukozyten - Typs.

Somit ist die hier vorgestellte Verfahren hat einige Vorteile gegenüber anderen zur Reinigung von Peroxidase-positiven Leukozyten aufgetragen Methoden. Wie es die Situation, in der Zirkulation beruht repräsentieren auf kleinen Blutproben die erhaltenen Zellen. Aufgrund der geringen Ausgangsprobenvolumens für das Protokoll benötigt wird, ist das Verfahren sowohl anwendbar menschlichen und nicht-menschlichen Blut, trotz der speziesspezifische Unterschiede in der Abundanz von Neutrophilen. Tatsächlich Blutvolumina so klein wie 50 & mgr; l an initial das beschriebene Verfahren anzuwenden wir auch in der Lage waren (Daten nicht gezeigt). Die kleine Blutprobe für das Verfahren erforderlich macht es auch für eine wiederholte Blutentnahme geeignete von kleinen Labortieren oder für spezielle medizinische Anwendungen (zB newborn Diagnose). Da ter Leukozyten-Anreicherung an der Abreicherung von Erythrozyten basiert alle Peroxidase-positive Zellen (Neutrophile, Eosinophile, Monozyten) in der erhaltenen gemischten Leukozytenfraktion enthalten und separat analysiert werden kann durch Durchflusszytometrie unter Verwendung. Das Verfahren ist schnell, zuverlässig und hat eine geringe Anforderungen an Chemikalien und Instrumentierung, das Protokoll geeignet für mehrere wissenschaftliche Umgebungen.

Als Neutrophilen leicht ein kritischer Schritt bei der beschriebenen Methode die genaue Einstellung des pH-Wertes der Pufferlösungen verwendet wird, aktiviert werden (PBS und HBSS, siehe Schritte 1.2 und 1.3 des Protokolls Abschnitt). Weiterhin die Inkubationszeit der Blutzellen mit destilliertem Wasser sollte als 60 sec nicht mehr vor normosmotic Bedingungen der Wiederherstellung (Schritt 2.2 des Protokolls Abschnitt. Der (fast) vollständig Entfernung des Lösungsmittels aus dem Zellpellet (Schritt 2.4) vor der Zugabe Wasser für die zweite hypotonische Lyse ist ein weiterer wichtiger Schritt als Buffer Rückstände wird die Effizienz des hypotonischen Lyseverfahren vermindern. Ein weiterer kritischer Schritt bezieht sich auf die Anwendung von H 2 O 2 während der APF Färbung. Obwohl die aufgebrachte Menge nicht zytotoxischen sein sollte, sollten die Vitalität der Zellen geprüft werden. Während unserer Untersuchungen wenden wir typischerweise den Farbstoff 5,5 ', 6,6'-Tetrachlor-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine Iodid (JC-1) für den Nachweis von frühen apoptotischen Ereignisse.

Darüber hinaus gibt es eine Reihe von Einschränkungen in der vereinfachten Leukozyten Anreicherungsverfahren beschrieben. Während die Technik kann von mehreren Arten (Mensch, Ratte und Maus versucht worden sind), um Blutproben angewendet werden, hängt im Blut auf ihren Anfangsfluss der Leukozyten Menge nach Lyse von Erythrozyten erhalten. Letztere variiert sicher zwischen den Arten 39 und ist auch abhängig von der Entzündungszustand des sondierten Individuums. Während darüber hinaus kann das Lyseverfahren mit bis zu einem geschehenhundert Proben parallel die Zwischen Zentrifugationsschritte stellen eine Begrenzung in Abhängigkeit von der Zentrifuge verwendet wird, nur bis zu 30 Proben parallel bearbeitet werden können. Während ferner APF leicht HOCl und HOBr in Gegenwart von SCN detektiert - die Halogenierung Aktivität von MPO und EPO wirkt sich auch auf die letzteren pseudo-Halogenid ist . Dadurch hypothiocyanite (- OSCN) gebildet wird, die nicht in der Lage ist APF zu oxidieren. Eine weitere Einschränkung kommt von den Eigenschaften des Farbstoffes APF für die Bestimmung von HOCl- verwendet und HOBr-Produktion durch MPO und EPO. Da der Farbstoff Fluorescein oxidiert wird, kann die Färbung nicht mit fluoreszierendem Antikörper mit einem Emissionsspektrum in dem gleichen Bereich kombiniert werden. Natürlich die jegliche Interferenzen zwischen APF-derived Fluoreszenz und dem Signal zusätzliche Fluoreszenzsignale zu Zytometer für in der Strömung kontrolliert und ausgeglichen werden.

wenn die Erfassung der Peroxidaseaktivität Halogenierung Ansonsten ist nicht der Umfang derstudieren, nach der Anwendung der Erythrozyten-Depletion Methode anderen analytischen Verfahren verwendet werden können anstelle von APF. Da die beschriebene hypotonische Lyse Verfahren nur Verfahren nur zu einem teilweisen Abbau von Erythrozyten und Leukozyten, da alle Leitungen sind noch in der erhaltenen gemischten Zellfraktion, die eine Einzelzellanalyse ermöglichen angewandt werden. Verfahren , die die Lyse von Zellen (zB Western - Plot - Analyse) umfassen wird zuverlässige Ergebnisse nicht liefern. Die kleine anfängliche Probenvolumen kann ein weiteres Hindernis für eine solche Analyseverfahren sein.

Die Untersuchung von MPO In Bezug auf (und EPO) Aktivität in Leukozyten oft nur die allgemeine Oxidationsmittel - Produktion durch die Zellen anstelle von speziell Auswertung der Häm - Peroxidase - Aktivität 44,45 gerichtet. Darüber hinaus oft keine Versuche unternommen werden, zwischen der Halogenierung und der Peroxidase - Aktivität von MPO und EPO 46,47 zu unterscheiden. Methoden, die speziell auf die Chlorierung von MPO-Aktivität von qu Adresseantifying HOCl abgeleitete Produkte wie Chlortyrosin nicht erkennen überoxidiert und / oder metabolisiert Produkte und damit häufig zu einer Unterschätzung der realen HOCl-Produktion 48 führen. Außerdem dieses Verfahren sowie die Detektion von HOCl-derived 2-chloroethidium sind auch zeitaufwendig, benötigen teure Analysegeräte und umfassen die Lyse von Zellen 48-50 .Es gibt viele Berichte über neue Farbstoffe für die spezifische Bestimmung der MPO - Aktivität Chlorierungsmittel in vitalen Zellen 44,51,52. Doch bisher nur APF und seine verwandten Verbindung hydroxyphenyl Fluorescein (HPF) sind im Handel erhältlich und deshalb routinemäßig in der Forschung 25,33 verwendet.

In der Tat, durch APF verwenden konnten wir zeigen , dass die Chlorierung von MPO - Aktivität nicht nur durch Verwendung des isolierten Enzyms 53 quantifiziert werden kann , sondern auch durch den Farbstoff zu lebenden Zellen 26,33 Anwendung. Somit kann durch die schnelle Leukozyten-Anreicherung von Blut Mikroproben kombiniert mit einem oben genanntenn APF Färbung entwickelten wir ein Protokoll, das speziell geeignet ist , und gleichzeitig wird die Halogenierung Aktivität von MPO und EPO in allen Peroxidase positive Leukozyten adressieren, dh Neutrophile, Monozyten und Eosinophile 32. Darüber hinaus ist die Methode erfordert keine Zelllyse, welche eine Vielzahl von analytischen Methoden ermöglicht, einschließlich der Durchflusszytometrie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Außerdem kann diese Peroxidase Aktivitätsfärbung mit der Anwendung der Zelloberflächenmarker kombiniert werden, die die spezifische Analyse von Leukozyten-Unterfraktionen ermöglicht, auf die wissenschaftliche Aufgabe abhängig. Dennoch muss berücksichtigt werden, dass die aufgebrachte fluoreszenzmarkierte Antikörper interferieren nicht mit dem Fluorescein basierende Fluoreszenzsignal verwendet, um die HOCl- und HOBr-derived APF Oxidation zu quantifizieren.

Zusammenfassend kann dieses Verfahren ein neues Werkzeug zur Verfügung stellen, um weitere Einblicke in die physiologische Rolle der Halogenierung Peroxidase-Aktivität des immunologischen re erhaltenlevant Blut abgeleiteten Peroxidasen MPO und EPO, die noch nicht gut verstanden 8,20,23. Außerdem in einer Tierstudie an rheumatoider Arthritis konnten wir vor kurzem beobachten, dass dieses Protokoll zur Bewertung der MPO-derived HOCl-Produktion als neuer klinischer Marker bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen (nicht veröffentlichte Daten) führen kann.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

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Immunologie Heft 113 Blutpräparat Leukozyten-Anreicherung Myeloperoxidase eosinophile Peroxidase Chlorierungs- Aktivität aminophenyl Fluorescein
Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben
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Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

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