Évaluation rapide et spécifique de l'halogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes

L’objectif global de cette méthode de déplétion des érythrocytes est d’obtenir un enrichissement rapide et simple en leucocye à partir d’un petit échantillon de sang. De nombreux avantages de cette technique sont qu’elle est bon marché, fiable et rapide. De plus, il peut être appliqué à des échantillons de sang humain et non humain.

Avant de commencer la procédure de lyse, ajustez la pipette pour l’administration de l’eau à deux millilitres et la pipette pour le PBS à cinq millilitres. Placez ensuite des flacons ouverts d’eau et de PBS sous une hotte à flux laminaire à température ambiante. Comme la lyse hypotonique est un processus critique en termes de temps, tout doit être préparé à l’avance.

De plus, le processus de lyse doit toujours être effectué de la même manière, pour avoir des résultats compatibles. Ensuite, transférez 100 microlitres de chaque échantillon de sang dans un tube conique de 15 millilitres. Et ajoutez deux millilitres d’eau distillée à chaque échantillon avec vortex à réglage moyen.

Laissez reposer les cellules pendant 60 secondes, puis ajoutez cinq millilitres de PBS. Et mélangez les échantillons par vortexing. Maintenant, collectez les cellules par centrifugation et décantez les surnageants.

Retournez les tubes et tapotez les ouvertures sur une serviette en papier pour enlever le plus de liquide possible. Répétez ensuite la procédure de lyse hypotonique comme nous venons de le démontrer. Après avoir obtenu une deuxième fois une pastille sèche, remettre chaque échantillon en suspension dans 500 microlitres de HBSS, jusqu’à l’obtention d’une solution homogène.

Et transférez les cellules dans des micro-tubes à centrifuger de 1,5 millilitre sur de la glace. Pour vérifier la spécificité de la peroxydase des échantillons après coloration à l’aminophénolfluorescéine ou APF, ajoutez d’abord cinq microlitres de l’inhibiteur de la peroxydase de l’hème, le 4-ABAH, aux échantillons appropriés pour une incubation de 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de solution de travail APF dans chaque tube et vortex doucement les cellules sur le réglage moyen.

Incuber tous les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite cinq microlitres de solution de travail de peroxyde d’hydrogène à chaque échantillon et vortex doucement les tubes. Après 60 minutes à 37 degrés Celsius, centrifugez les cellules et retirez soigneusement le surnageant sans déranger les granulés.

Enfin, remettez les cellules en suspension dans 250 microlitres de HBSS, et stockez les échantillons dans l’obscurité jusqu’à leur analyse, afin d’éviter le photoblanchiment. Ici, un exemple représentatif des populations de leucocytes après lyse hypotonique et coloration APF comme cela vient d’être démontré est présenté. En comparant la taille des cellules en fonction de la granularité, on peut observer la forte déplétion des érythrocytes, la population de globules rouges et de débris ne représentant que 22 % des événements.

De plus, la distribution de l’intensité de la fluorescence dérivée de l’APF facilite une discrimination claire des érythrocites et des lymphocytes négatifs à la peroxydase, avec une oxydation modérée de l’APF observée, pour les monocytes et les éosinophiles positifs à la peroxydase, et une oxydation robuste de la peroxydase présentée par les neutrophiles. Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée à un maximum de 50 échantillons de sang en parallèle si elle est correctement réalisée. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la coloration des anticorps peuvent être effectuées pour identifier les sous-ensembles cellulaires d’intérêt.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des études sur les petits animaux pour explorer le rôle de l’activité halogénante du MPO et de l’EPO dans des modèles animaux de maladies inflammatoires chroniques.