Évaluation rapide et spécifique de l'halogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes
28 juillet 2016
Ce protocole décrit l’enrichissement rapide des leucocytes à partir de petits échantillons de sang pour une détermination spécifique ultérieure de l’activité halogénante de la peroxydase dans les cellules. La méthode peut être appliquée à du matériel humain et non humain et peut contribuer à l’évaluation de nouveaux marqueurs inflammatoires.
Le but général de cette méthode de déplétion des érythrocytes est d'obtenir un enrichissement rapide et simple en leucocytes à partir d'un petit échantillon sanguin. De nombreux avantages de cette technique sont qu'elle est peu coûteuse, fiable et rapide. De plus, elle peut être appliquée à des échantillons sanguins humains et non humains.
Avant de commencer la procédure de lyse, régler la pipette destinée à l'administration d'eau à deux millilitres et la pipette destinée au PBS à cinq millilitres. Ensuite, placer des flacons ouverts d'eau et de PBS sous une hotte à flux laminaire à température ambiante. Étant donné que la lyse hypotonique est un processus critique en termes de temps, tout doit être préparé au préalable.
En outre, la procédure de lyse doit toujours être effectuée de la même manière afin d'obtenir des résultats comparables. Ensuite, transférez 100 microlitres de chaque échantillon sanguin dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez ensuite deux millilitres d'eau distillée à chaque échantillon en vortexant à réglage moyen.
Reposez les cellules pendant 60 secondes, puis ajoutez cinq millilitres de PBS. Mélangez les échantillons par vortexage. Ensuite, récupérez les cellules par centrifugation et décantez les surnageants.
Retournez les tubes et tapez doucement les ouvertures sur une serviette en papier pour éliminer autant de liquide que possible. Répétez ensuite la procédure de lyse hypotonique comme vient de l'être démontré. Après avoir obtenu un culot sec pour la deuxième fois, resuspendez chaque échantillon dans 500 microlitres de HBSS, jusqu'à l'obtention d'une solution homogène.
Et transférez les cellules dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre sur de la glace. Pour vérifier la spécificité de la peroxydase des échantillons après la coloration par le phénol amino fluorescéine, ou APF, ajoutez d'abord cinq microlitres de l'inhibiteur de la peroxydase hémique, 4-ABAH, aux échantillons appropriés pour une incubation de 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de la solution travail d'APF à chaque tube, puis vortexez doucement les cellules à réglage modéré.
Incubez tous les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite cinq microlitres de solution working d'hydrogène peroxyde à chaque échantillon, et vortexez doucement les tubes. Après 60 minutes à 37 degrés Celsius, centrifugez les cellules et retirez soigneusement le surnageant sans perturber les pastilles.
Enfin, re-suspendre les cellules dans 250 microlitres de HBSS et conserver les échantillons à l’abri de la lumière jusqu’à leur analyse, afin d’éviter la décoloration photo-induite. Voici un exemple représentatif des populations de leucocytes après lyse hypotonique et coloration par APF, comme vient d’être illustré. En portant la taille des cellules en fonction de leur granularité, on observe une élimination efficace des érythrocytes, la population de globules rouges et de débris ne représentant que 22 % des évènements.
En outre, la distribution d'intensité de la fluorescence dérivée de l'APF permet une discrimination claire des érythrocytes et des lymphocytes négatifs pour la peroxydase, avec une oxydation modérée de l'APF observée pour les monocytes et les éosinophiles positifs pour la peroxydase, et une oxydation peroxydasique marquée présentée par les neutrophiles. Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée à jusqu'à 50 échantillons de sang en parallèle si elle est correctement réalisée. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la coloration par anticorps peuvent être effectuées afin d'identifier les sous-populations cellulaires d'intérêt.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des études sur les petits animaux pour explorer le rôle de l'activité halogénante de la MPO et de l'EPO dans des modèles animaux de maladies inflammatoires chroniques.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode rapide et simple pour enrichir les leucocytes à partir d'échantillons sanguins de petite taille, applicable à des échantillons humains comme non humains. La technique est économique et fiable, facilitant l'évaluation de nouveaux marqueurs inflammatoires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- La mise en évidence des leucocytes est essentielle pour l'étude des réponses immunitaires.
- Les méthodes traditionnelles peuvent être longues et complexes.
- Cette méthode vise à simplifier le processus.
- Elle peut être utilisée pour des échantillons sanguins humains et non humains.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole rapide d'enrichissement des leucocytes.
- Évaluer l'activité de la peroxydase halogénante dans les leucocytes.
- Contribuer à l'identification de marqueurs inflammatoires.
Méthodes utilisées
- Préparation des pipettes pour l'administration d'eau et de PBS.
- Utilisation d'une hotte à flux laminaire pour le traitement des échantillons.
- Lyse hypotonique en vue de l'élimination des érythrocytes.
- Exécution de la procédure de lyse dans des délais critiques.
Résultats principaux
- Enrichissement réussi des leucocytes à partir de petits échantillons sanguins.
- Évaluation fiable de l'activité peroxydase.
- Faisabilité pour les échantillons humains et non humains.
- Potentiel d'évaluation de nouveaux marqueurs inflammatoires.
Conclusions
- La méthode est efficace et rentable.
- Elle améliore l'étude des réponses immunitaires.
- Des recherches supplémentaires peuvent s'appuyer sur ce protocole.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Ce protocole permet une purification rapide et normalisée des leucocytes à partir de petits échantillons sanguins, soutenant ainsi les efforts de découverte précoce dans la recherche sur les maladies inflammatoires. En quantifiant l'activité peroxydasique halogénante de la MPO et de l'EPO, il fournit une lecture mécanistique pour la validation des cibles et la réduction des risques liés aux voies biologiques. La compatibilité de cette méthode avec la cytométrie en flux et la coloration par anticorps facilite son intégration dans les protocoles de criblage et les approches translationnelles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier l'activité de la peroxydase spécifique aux leucocytes afin de valider la MPO et l'EPO comme cibles thérapeutiques dans l'inflammation chronique.
- Valeur opérationnelle : Nécessite un volume d'échantillon minimal (50–100 µL), permettant des prélèvements répétés chez des modèles animaux de petite taille pour des études longitudinales d'engagement de la cible.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Associe la coloration par APF à la cytométrie en flux pour obtenir des mesures quantitatives, basées sur la fluorescence, de la production d'HOCl/HOBr, permettant ainsi la standardisation des tests.
- Valeur opérationnelle : Permet le traitement à haut débit de jusqu'à 50 échantillons en parallèle, facilitant des campagnes de criblage évolutives.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre l'activité de la peroxydase des leucocytes et les processus inflammatoires pertinents pour la maladie, soutenant l'alignement des biomarqueurs dans les modèles précliniques.
- Valeur opérationnelle : Fonctionne avec le sang humain et celui de rongeurs, permettant une continuité translationnelle interspécifique dans la validation des cibles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la vérification précoce de l'hypothèse sur la cible à la validation préclinique, en particulier dans les programmes d'immunologie et de maladies inflammatoires.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses en quantifiant l'activité peroxydasique spécifique des enzymes dans des populations purifiées de leucocytes.
- Écrantage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs par détection de la fluorescence APF et cytométrie en flux, permettant d'évaluer l'effet de composés sur l'activité peroxydasique.
- Analytique : Génère des données quantitatives d'intensité de fluorescence permettant de comparer les sous-populations de cellules positives pour la peroxydase (neutrophiles, monocytes, éosinophiles) dans des conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre l'activité peroxydasique et les mécanismes des maladies inflammatoires, assurant une continuité préclinique lorsqu'elle est combinée à la coloration des marqueurs de surface cellulaire.
- Réutilisation en entreprise : L'enrichissement standardisé des leucocytes et la détection fondée sur l'APF constituent une plateforme réutilisable pour plusieurs programmes ciblant l'inflammation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans la validation des cibles en isolant l'activité peroxydasique à des lignées spécifiques de leucocytes.
- Valeur opérationnelle : Propose un protocole peu coûteux et rapide, nécessitant un équipement minimal (centrifugeuse, vortexeur, cytomètre en flux).
- Valeur stratégique : Réduit les délais de dé-risquage biologique en permettant une évaluation rapide et itérative de la modulation des cibles dans des échantillons de leucocytes.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des inhibiteurs de MPO/EPO en fournissant des données précoces sur l'activité fonctionnelle provenant de cellules physiologiquement pertinentes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des leucocytes, la cytométrie en flux et la chimie des sondes fluorescentes.
- Dépend de l'accès à des centrifugeuses, des vortexeurs, des hottes à flux laminaire et des cytomètres en flux dotés de canaux de fluorescence appropriés.
- Exige une standardisation des solutions travail d'APF et de peroxyde d'hydrogène entre les laboratoires pour des résultats reproductibles.
- L'adaptation à des espèces non humaines nécessite une validation de l'expression de la peroxydase et de l'efficacité de la coloration par l'APF dans les sous-populations cibles de leucocytes.
- Limitée à la détection de l'activité peroxydasique halogénante ; ne mesure pas les autres fonctions des leucocytes, sauf si combinée à d'autres tests.
