Name: Évaluation rapide et spécifique de lhalogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Apprenez une méthode rapide d'enrichissement des leucocytes à partir de petits échantillons sanguins humains et non humains. Cette technique économique et fiable permet d'évaluer l'activité peroxydase halogénante pour l'étude des marqueurs inflammatoires.

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Ce travail a été rendu possible grâce au financement du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (BMBF, 1315883) ainsi qu’au projet Sächsische Aufbaubank (SAB) 100116526 grâce à un financement du Fonds européen de développement régional (FEDER).

Tous les échantillons de sang humain ont été obtenus chez des volontaires sains, et le protocole d&#39;enrichissement leucocytaire appliqué suit les lignes directrices de l&#39;éthique commission de la Faculté de médecine de l&#39;Université de Leipzig. Les expériences avec le sang de rat ont été approuvés par le comité d&#39;éthique local responsable (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), selon les directives allemandes sur le soin des animaux et l&#39;utilisation. 1. Configuration expérimentale NOTE: Comme la procédure de lyse hypotonique de l&#39;épuisement des érythrocytes à partir des échantillons de sang est une procédure de temps critique, préparer tout le matériel nécessaire (par exemple, des tampons) pour cette partie du protocole à l&#39; avance. <ol><li> Repérer un 15 ml tube de centrifugeuse pour la lyse hypotonique et un tube de 1,5 ml échantillon pour aminophényl ultérieure fluorescéine (APF) coloration par échantillon de sang. <ol><li> Si l&#39;enrichissement leucocytaire sera effectuée dans des conditions stériles, effectuer ce marquage sous un fluxboîte. </li></ol></li><li> Préparer environ 12 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 10 mM) par échantillon. Selon que les leucocytes sont isolés, sous des conditions stériles ou non, de préparer du PBS, soit en utilisant une solution stérile prête à un fournisseur ou par dissolution de comprimés de PBS dans de l&#39;eau distillée. Vérifier la valeur du pH et, si nécessaire, ajuster le pH à 7,4 en utilisant de petites quantités de HCl 0,1 M et des solutions de NaOH. <ol><li> Dissoudre des comprimés de PBS (voir tableau des matériaux) dans 200 ml d&#39;eau distillée pour obtenir une solution tampon non stérile suffisante pour environ 16 échantillons. Si l&#39;on désire stériliser cette solution par filtration stérile. </li></ol></li><li> Préparer environ 1 ml de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) additionnée de Ca 2+ par échantillon. <ol><li> Dissoudre 970 mg de sel HBSS dans 100 ml (volume final) de l&#39;eau bidistillée. Avant de remplir le volume final, vérifier la valeur du pH et l&#39;ajuster à pH 7,4. En raison de son faible pouvoir tampon, préparer ce tampon fraîchement chaque jour und effectuer l&#39;ajustement du pH avec un soin particulier à l&#39;aide de petites quantités de 0,1 solutions de HCl M et NaOH. NOTE: Solution stérile peut être utilisée, en fonction de l&#39;expérience. La solution peut être stérilisée par filtration stérile. </li></ol></li><li> Outre les deux mémoires tampon, l&#39; étiquette et la préparation d&#39; un tube (par exemple 50 ml tube de centrifugation) ou le flacon (par exemple, 250 ml d&#39;une tasse à mesurer) avec de l&#39; eau bidistillée pour la procédure de lyse hypotonique à l&#39; avance. Préparer environ 10 ml d&#39;eau par échantillon. </li><li> Préparer un récipient avec de la glace pilée pour la coloration APF (section 3), qui est effectuée sur la glace. </li><li> Préparer des aliquotes de l&#39;APF à l&#39;avance pour permettre la préparation rapide des solutions de travail utilisées au cours de la coloration (étape 3.2) et d&#39;éviter à plusieurs reprises congélation et la décongélation de la solution CSA. NOTE: APF est généralement obtenu sous forme d&#39;un 5 mg / ml (mM 11,81) de solution mère dans de l&#39;acétate de méthyle. <ol><li> Congeler aliquotes de 10-100 ul dans 0,5 ml tubes. Pour l&#39;APF coloration finaleconcentration de colorant de 10 uM est utilisée (étape 3.8). </li></ol></li></ol> 2. hypotonique lyse des érythrocytes REMARQUE: Effectuez les étapes de lyse hypotonique (sauf les étapes de centrifugation) sous un banc de flux laminaire pour éviter toute contamination. Effectuez toute la procédure à la température ambiante. Comme la lyse hypotonique est un processus critique de temps, ajuster les pipettes pour l&#39;eau (2 ml) et PBS (5 ml) plus à l&#39;avance et ouvrir l&#39;eau et des flacons de PBS avant de commencer la procédure. Conserver la solution PBS et l&#39;eau distillée à la température ambiante avant utilisation. <ol><li> De chaque transfert d&#39;échantillons de sang de 100 pi au tube de 15 ml de centrifugation approprié. REMARQUE: Dans nos expériences, des échantillons de sang contiennent habituellement de 10 U / ml d&#39;héparine pour éviter la coagulation. Pourtant, du fait de différentes sources du matériau d&#39;échantillon, la nature et la concentration de l&#39;anti-coagulant peuvent être différentes. Son influence sur la coloration du CSA doit être testé par comparment les résultats aux résultats obtenus à partir d&#39;échantillons de sang supplémentées avec d&#39;autres types ou concentrations d&#39;anti-coagulant. </li><li> Ajouter 2 ml d&#39;eau distillée et mélanger les échantillons en utilisant un mélangeur à vortex réglé à un niveau moyen. Incuber les échantillons pendant 60 secondes, puis ajouter 5 ml de PBS par échantillon et mélanger à l&#39;aide du mélangeur vortex. REMARQUE: jusqu&#39;à environ 5 échantillons peut être préparé en parallèle. Gardez l&#39;ordre de même pour l&#39;addition d&#39;eau et PBS pour obtenir des temps d&#39;incubation comparables échantillon. </li><li> Après régénération des conditions isotoniques par addition de PBS (étape 2.2) sédimenter les cellules intactes restantes dans tous les échantillons par centrifugation pendant 6 minutes à la température ambiante et 450 x g. </li><li> Retirer le surnageant en le versant dans une poubelle de table. Retirez autant de liquide que possible en inversant le tube de centrifugation et en tapant l&#39;ouverture sur une serviette en papier. Assurez-vous que le culot cellulaire est aussi sec que possible. </li><li> Répétez la procédure de lyse hypotonique comme décrit précédemment (étape 2.2). NOTE: En principe, cette procédure de lyse hypotonique (étapes 02/03 à 02/05) peut être répété plusieurs fois, en fonction de la pureté de la fraction leucocytaire mixte à obtenir. Après deux étapes de lyse de la part des globules rouges restant dans la fraction cellulaire obtenue est mélangée à environ 25%. </li><li> Sédimenter les cellules intactes restantes par centrifugation pendant 6 minutes à la température ambiante et 450 x g. Retirer le surnageant (voir étape 2.4). Ajouter 500 ul de HBSS à la pastille et dissoudre doucement jusqu&#39;à l&#39;obtention d&#39;une solution homogène. Transférer chaque échantillon à 1,5 ml tube d&#39;échantillon étiquetés en conséquence. </li><li> Selon l&#39;expérience d&#39; analyser directement les échantillons obtenus (par exemple, par l&#39; intermédiaire de cytométrie de flux) 25, tache avec des anticorps marqués par fluorescence (pour l&#39; identification des types de cellules isolées) 32, incuber avec des stimuli cellulaires (pour les expériences d&#39;activation des cellules) 33 ou stocké sur de la glace et l&#39; utilisation plus tard. Selon le but de l&#39;étude, effectuer immédiatement des expériences ultérieures surla fraction leucocytaire mixte depuis granulocytes ont une demi-vie relativement courte d&#39;environ 20 heures. NOTE: Cela vaut également pour la coloration de l&#39;activité peroxydase décrite ci-dessous. </li></ol> 3. Activité Peroxydase halogénation Staining NOTE: HOCl- et HOBr-production par les hème peroxydases dérivés du sang MPO et de l&#39;OEB est quantifiée à l&#39;aide de l&#39;APF, qui est oxydé en fluorescéine par les acides hypohalogéneux nommés. Par conséquent, si le marquage cellulaire avec des anticorps marqués par fluorescence est réalisée en combinaison avec une coloration APF, d&#39;éviter des fluorophores qui interfèrent avec le signal d&#39;émission de la fluorescéine. <ol><li> Effectuer APF coloration à 4 ° C sur la glace. </li><li> Pour la préparation d&#39; une solution de travail de l&#39; APF décongeler une aliquote appropriée du colorant (par exemple, 10 ul, 11,81 mM) et de le diluer avec du HBSS à 1 mM (par exemple, ajouter 108,1 ul de tampon au 10 ul) exactement. <ol><li> Pour chaque échantillon (500 ul de solution de cellules) préparer 5 μl de la solution de travail du CSA décrit. Par conséquent, utiliser une 10 aliquote pi de l&#39;APF (11,81 mM), ce qui donne 118,1 solution de travail APF pi (1 mM) pour préparer environ 20 échantillons. En raison de la perte pendant le pipetage préparer environ 10% de plus que la solution de travail APF calculée. </li></ol></li><li> Afin de vérifier la spécificité de la peroxydase de la coloration APF, préparer des échantillons de contrôle avec l&#39;inhibiteur de la peroxydase hème hydrazide de l&#39; acide 4-aminobenzoïque (4-ABAH) 35. <ol><li> Préparer une solution mère de 4-ABAH (151.17 g / mol) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) 1 M en diluant 75,6 mg de 4-ABAH en solvant 500 pi. diluer 4-ABAH 1/10 dans du HBSS. </li></ol></li><li> Pour la préparation d&#39;une étiquette d&#39; une solution de H 2 O 2 de travail de 1,5 ml deux tubes de centrifugation avec &quot;70 mM de H 2 O 2&quot; et &quot;7 mM de H 2 O 2», ​​respectivement. <ol><li> Dans le tube marqué &quot;70 mM de H 2 O 2&quot;, fraîchement dilué 10 uld&#39;une solution stock de 30% (8,8 mM) de H 2 O 2 en utilisant 990 ul d&#39; eau distillée pour obtenir une concentration d&#39;environ 88 mM. Stocker sur la glace et utiliser dans les 4 heures. NOTE: H 2 O 2 est généralement livré sous forme de solution stock de 30% par les fournisseurs. Lorsqu&#39;ils sont stockés à 4 ° C, elle est stable pendant environ 3 ans. Effectuer des dilutions de H 2 O 2 dans de l&#39; eau distillée pour éviter la décomposition. H 2 O 2 dilutions peuvent également être préparées dans une solution 0,1 M de NaOH. </li><li> Pour la détermination de la H exacte concentration 2 O 2 Préparer une dilution supplémentaire de 1 à 10 à partir de la première H 2 O 2 de solution mère (environ 88 mM) , par addition de 100 ul de cette solution à 900 ul d&#39; eau distillée dans le tube 1,5 ml étiqueté &quot;7 mM de H 2 O 2&quot;. </li><li> Enregistrer un spectre dans le proche UV (par exemple, 200-300 nm) en utilisant un photospectromètre UV-Vis et utiliser l&#39;absorbance à 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) pour déterminer la concentration réelle H 2 O 2 dans la seconde H 2 O 2 de solution mère 34. Assurez-vous que la cuvette de référence contient de l&#39;eau distillée. Pour la mesure de l&#39;utilisation des cuvettes de quartz comme un spectre dans la gamme UV est enregistrée. </li><li> De ce résultat, calculer les concentrations exactes des deux H 2 O 2 solutions mères. Ajuster la concentration de la première solution mère dans le &quot;2 O 2 70 mM H&quot; tube échantillon exactement 70 mM en ajoutant une quantité appropriée d&#39;eau distillée. Conservez la solution de travail obtenu sur la glace et utiliser moins d&#39;une heure. </li></ol></li><li> Ajouter 5 ul de la solution de travail 4 ABAH (100 mM) aux échantillons appropriés pour une concentration finale de 1 mM. Incuber les échantillons pendant 15 min à 37 ° C dans l&#39;incubateur avant l&#39;addition du CSA. </li><li> Ajouter 5 ul de solution de travail du CSA (1 mM) à chaque500 ul de l&#39;échantillon pour obtenir une concentration finale de colorant de 10 uM. Mélanger les échantillons doucement (par exemple, en utilisant le mélangeur vortex sur un réglage moyen) et incuber pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 5 ul de solution de H 2 O 2 de travail (70 mM) à chaque échantillon de 500 pi pour obtenir une concentration finale de 700 uM. Mélanger délicatement les échantillons et les incuber pendant 60 min à 37 ° C. Effectuer des mesures de contrôle appropriées en parallèle. REMARQUE: Les mesures de contrôle ont montré que 700 uM de H 2 O 2 ne sont pas toxiques pour les cellules. les réponses cellulaires significatives ont été observées ne. NOTE: La coloration APF peut également être effectuée en omettant l&#39;addition de H 2 O 2, en fonction de la question scientifique. En l&#39;absence de peroxyde d&#39;hydrogène que l&#39;FTU chlorant de base et l&#39; activité EPO est déterminée tandis que l&#39;addition de H 2 O 2 permet la détection du maximum de HOCl et HOBr la production par les cellules. Til signifie ce dernier un signal fluorescent significativement plus élevé. </li><li> Pour la granulation des cellules, centrifuger les échantillons pendant 10 minutes à la température ambiante et 400 x g. Retirer soigneusement le surnageant sans détruire le culot et ajouter 250 ul HBSS pour remettre en suspension les cellules. NOTE: Les échantillons sont maintenant prêts pour l&#39; analyse par cytométrie en flux 25. </li><li> Stocker les échantillons dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce que l&#39;analyse afin d&#39;éviter le blanchiment. Après excitation à 480-490 nm détecter l&#39;émission de fluorescéine à environ 525 nm 37. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Que les neutrophiles sont les plus abondants dans les leucocytes du sang humain l&#39;isolement de cellules peroxydase positives concentre souvent uniquement sur ​​ces cellules et comprend une séparation des neutrophiles à partir d&#39; autres leucocytes par centrifugation sur gradient de densité 38. Pourtant , comme les neutrophiles sont beaucoup moins abondantes dans les échantillons sanguins murins 39 pour les méthodes plus complexes ces dernières doivent être utilisées 40. Par ailleu...

Les leucocytes polynucléaires (PMN, également appelés granulocytes et monocytes) représentent les composants cellulaires importants du système immunitaire inné du 1,2 sanguin. Elles contribuent à la première ligne de défense contre les agents pathogènes ainsi qu&#39;à l&#39;activation du système immunitaire acquis , et l&#39;initiation d&#39;une réponse inflammatoire systémique 2-4. Pourtant , en particulier des neutrophiles, le type de granulocytes le plus abondant, et monocytes contribuent également de manière significative à la réglementation et à la fin des événements inflammatoires aigus 5. Par conséquent , ces cellules peuvent également jouer un rôle important dans les maladies inflammatoires chroniques comme la polyarthrite rhumatoïde 6,7. En effet, l&#39; asthme, une maladie pulmonaire inflammatoire chronique, est caractérisée par une déficience de l&#39; apoptose des eosinophiles, le deuxième type de granulocytes dans le sang 8. Pourtant, l&#39;apoptose des granulocytes et de leur élimination rapide par les macrophages sont deux étapes essentielles pendant la terminaison cellulairede l&#39; inflammation 11/09. Dans les cellules immunitaires nommées deux enzymes étroitement liées, à savoir la myéloperoxydase (MPO, neutrophiles et monocytes) et peroxydase éosinophile (EPO, éosinophiles) peut être trouvé 12,13. Ces peroxydases hème sont classiquement liées à la réponse immunitaire humorale comme ils oxydent deux électroniquement (pseudo-) halogénures à l&#39;hypo (pseudo) correspondant acides halous qui sont connus pour leurs propriétés bactéricides 14-16. Dans des conditions physiologiques FTU principalement forme de l&#39; acide hypochloreux (HOCl) et hypothiocyanite (- RCSO) , tandis que l&#39;acide hypobromeux celui- ci et (HOBr) sont formées par l&#39; OEB 17-19. De nouveaux résultats suggèrent que cette (pseudo-) activité halogénation enzymatique peut également contribuer à la régulation des réponses inflammatoires et à la fin des réactions immunitaires 20,21. En effet, la production de HOCl par la MPO et de produits dérivés ont été présentés pour supprimer T à base de cellules réponses immunitaires adaptatives 22-24. Afin d&#39;obtenir plus d&#39;idées sur le rôle immunologique des leucocytes du système immunitaire inné à des maladies inflammatoires chroniques et de déterminer la contribution du MPO et de l&#39;OEB à cette fonction physiologique, nous avons développé une méthode pour enrichir rapidement les leucocytes à partir de petits échantillons de sang pour une spécifique ultérieure détermination de l&#39;activité de peroxydase halogénation dans ces cellules. Pour érythrocytaire épuisement, nous avons choisi une méthode normalisée, y compris deux étapes ultérieures de lyse hypotonique avec de l&#39;eau distillée, ce qui conduit à un enrichissement leucocytaire rapide à des coûts de matériaux faibles. Pour la détermination subséquente de la FTU halogénant et l&#39; activité EPO et la HOCl- HOBr spécifique colorant aminophényl fluorescéine (CSA) a été utilisée 25-27. Contrairement à l&#39;application de la peroxydase non spécifique des méthodes de coloration 28,29, cette approche permet la détection sélective de l&#39;activité de peroxydase halogénation, ce qui est souvent altérée à infl sévèreammation 30,31.

<table><tbody><tr><td>Matériaux/Équipements</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes de centrifugation de 15 ml</td><td>VWR/Corning</td><td>734-0451-Tubes</td><td></td></tr> <tr><td>d’échantillons de 1,5 ml</td><td>VWR/Eppendorf</td><td>211-2130DE</td><td></td></tr> <tr><td>Pipettes pour des volumes allant jusqu’à 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>par ex. , 3120000070</td><td>Nous utilisons des pipettes Eppendorf Resarch plus avec des volumes réglables dans la plage 1-10 & micro ; l, 10-100 et micro ; l, 100-1 000 et micro ; l an 500-5 000 & micro ; l</td></tr><tr><td>banc à flux laminaire</td><td>Thermo Electron Corperation</td><td>HeraSafe-Vortex</td><td></td></tr> <tr><td>mélangeur</td><td>Cintreuse & Hobein AG</td><td>Vortex Genie</td> <td>2-Centrifugeuse</td></tr> de <tr><td>table</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>Laborfuge 400R</td><td>La centrifugeuse doit pouvoir être utilisée à 450 x g</td></tr><tr><td>Petite centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>La centrifugeuse doit pouvoir être utilisée à 400 x g</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Heraeus</td><td>cytoperm 2</td><td>Réglages : 37 &deg ; C, 95 % d’humidité, 5 % de teneur en CO2</td></tr><tr><td>spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Varian</td><td>Cary 50 bio</td><td>Un spectre compris entre 200 et 300 nm doit être enregistré. Ainsi, des cuvettes en quartz doivent être appliquées Cytomètre</td></tr> en <tr><td>flux</td><td>Becton, Dickinson</td><td>BD Facs Calibur</td><td>On peut utiliser n’importe quel cytomètre en flux équipé d’un laser adapté à l’excitation de la fluorescéine (par exemple , laser argon 488 nm)</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td>solution stérile <td>amresco</td><td>K812</td><td>, prête à l’emploi</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>comprimés à résoudre dans 200 ml d’eau milliporeuse</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée Hanks (HBSS) avec Ca2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td>970 mg/100 ml, vérifier soigneusement et ajuster la valeur du pH à 7,4</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09057.1000</td><td>1 M solution</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Riedel-deHa&euml ; n</td><td>30620</td><td>Granulés solides. Pour une solution à 1 M, résoudre 4 g/100 ml d’eau Millipore</td></tr><tr><td>Aminophénylfluorescéine</td><td>Cayman</td><td>10157</td><td>solution à 5 mg/ml (11,81 mM) dans de l’acétate de méthyle, des aliquotes (par exemple 100 & micro ; l) doit être préparé et stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Cette solution mère à 30 % correspond à une concentration d’environ 8,8 M. D’autres dilutions doivent être fraîchement préparées dans de l’eau distillée immédiatement avant l’utilisation et quantifiées par des mesures d’absorbance</td></tr><tr><td>Hydrazide d’acide 4-aminobenzoïque (4-ABAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A41909</td><td>Une première solution mère de 1 M doit être préparée dans du DMSO, une seconde de 100 mM par dilution 1:10 dans des produits chimiques HBSS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>23500.26</td><td>-</td></tr></tbody></table>

Évaluation rapide et spécifique de l&#39;halogénation peroxydase activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Dans cet article, un protocole pour l&#39;enrichissement rapide et homogène des leucocytes à partir de petits échantillons de sang entier est décrit. Cette procédure est basée sur la lyse hypotonique des érythrocytes et peut être appliqué à des échantillons humains, ainsi que le sang d&#39;origine non humaine. Le petit volume d&#39;échantillon initial d&#39;environ 50 à 100 ul rend cette méthode applicable au prélèvement de sang périodique de petits animaux de laboratoire. En outre, l&#39;enrichissement des leucocytes est réalisé en quelques minutes et avec des efforts matériels faibles en ce qui concerne les produits chimiques et de l&#39;instrumentation, ce qui rend cette méthode applicable dans les environnements de laboratoire multiples. La purification normalisée des leucocytes est combiné avec un procédé hautement sélectif de coloration pour évaluer l&#39; activité de la peroxydase halogénation des peroxydases de l&#39; hème, la myéloperoxydase (MPO) et éosinophile peroxydase (EPO), à savoir la formation d&#39;hypochloreux et de l&#39; acide hypobromeux (HOCl et HOBr). Alors que FTU est fortement exprimé dans neutrophils, immunitaire de type cellulaire le plus abondant dans le sang humain, ainsi que dans les monocytes, l&#39;enzyme lié à l&#39;EPO est exclusivement exprimé dans les éosinophiles. L&#39;activité d&#39;halogénation de ces enzymes est traitée en utilisant la fluorescéine presque HOCl- et HOBr colorant spécifique aminophényl (CSA) et le substrat de la peroxydase primaire du peroxyde d&#39;hydrogène. Lors de l&#39;analyse ultérieure de cytométrie de flux de toutes les cellules positives à la peroxydase (neutrophiles, les monocytes, les éosinophiles) sont distinguables et leur activité de peroxydase d&#39;halogénation peuvent être quantifiés. Etant donné que la coloration du CSA peut être combiné avec l&#39;application de marqueurs de surface cellulaire, ce protocole peut être étendu pour traiter spécifiquement les sous-fractions de leucocytes. Le procédé est applicable à la détection de HOCl et HOBr la production à la fois chez l&#39;homme et dans les leucocytes de rongeurs. Étant donné le rôle immunologique largement et diversement discuté de ces produits enzymatiques dans les maladies inflammatoires chroniques, ce protocole peut contribuer à une meilleure compréhension de lapertinence immunologique de peroxydases hème leucocytaires dérivés.

Comme indiqué précédemment le procédé décrit ci - dessus avéré être applicable aussi bien aux humains et aux matières non humain 32. En outre, comme indiqué pour les souris présentant des symptômes asthmatiques la coloration APF peut être un outil approprié pour détecter des différences dans l&#39;état pro-inflammatoire systémique. Par conséquent , dans une étude ultérieure , nous avons utilisé ce protocole pour évaluer de façon répétée l&#39;activité d&#39;halogénation du MPO...

Ce protocole décrit l’enrichissement rapide des leucocytes à partir de petits échantillons de sang pour une détermination spécifique ultérieure de l’activité halogénante de la peroxydase dans les cellules. La méthode peut être appliquée à du matériel humain et non humain et peut contribuer à l’évaluation de nouveaux marqueurs inflammatoires.

Évaluation rapide et spécifique de l&#39;halogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Le but général de cette méthode de déplétion des érythrocytes est d'obtenir un enrichissement rapide et simple en leucocytes à partir d'un petit échantillon sanguin. De nombreux avantages de cette technique sont qu'elle est peu coûteuse, fiable et rapide. De plus, elle peut être appliquée à des échantillons sanguins humains et non humains.Avant de commencer la procédure de lyse, régler la pipette destinée à l'administration d'eau à deux millilitres et la pipette destinée au PBS à cinq millilitres. Ensuite, placer des flacons ouverts d'eau et de PBS sous une hotte à flux laminaire à température ambiante. Étant donné que la lyse hypotonique est un processus critique en termes de temps, tout doit être préparé au préalable.En outre, la procédure de lyse doit toujours être effectuée de la même manière afin d'obtenir des résultats comparables. Ensuite, transférez 100 microlitres de chaque échantillon sanguin dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez ensuite deux millilitres d'eau distillée à chaque échantillon en vortexant à réglage moyen.Reposez les cellules pendant 60 secondes, puis ajoutez cinq millilitres de PBS. Mélangez les échantillons par vortexage. Ensuite, récupérez les cellules par centrifugation et décantez les surnageants.Retournez les tubes et tapez doucement les ouvertures sur une serviette en papier pour éliminer autant de liquide que possible. Répétez ensuite la procédure de lyse hypotonique comme vient de l'être démontré. Après avoir obtenu un culot sec pour la deuxième fois, resuspendez chaque échantillon dans 500 microlitres de HBSS, jusqu'à l'obtention d'une solution homogène.Et transférez les cellules dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre sur de la glace. Pour vérifier la spécificité de la peroxydase des échantillons après la coloration par le phénol amino fluorescéine, ou APF, ajoutez d'abord cinq microlitres de l'inhibiteur de la peroxydase hémique, 4-ABAH, aux échantillons appropriés pour une incubation de 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de la solution travail d'APF à chaque tube, puis vortexez doucement les cellules à réglage modéré.Incubez tous les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite cinq microlitres de solution working d'hydrogène peroxyde à chaque échantillon, et vortexez doucement les tubes. Après 60 minutes à 37 degrés Celsius, centrifugez les cellules et retirez soigneusement le surnageant sans perturber les pastilles.Enfin, re-suspendre les cellules dans 250 microlitres de HBSS et conserver les échantillons à l’abri de la lumière jusqu’à leur analyse, afin d’éviter la décoloration photo-induite. Voici un exemple représentatif des populations de leucocytes après lyse hypotonique et coloration par APF, comme vient d’être illustré. En portant la taille des cellules en fonction de leur granularité, on observe une élimination efficace des érythrocytes, la population de globules rouges et de débris ne représentant que 22 % des évènements.En outre, la distribution d'intensité de la fluorescence dérivée de l'APF permet une discrimination claire des érythrocytes et des lymphocytes négatifs pour la peroxydase, avec une oxydation modérée de l'APF observée pour les monocytes et les éosinophiles positifs pour la peroxydase, et une oxydation peroxydasique marquée présentée par les neutrophiles. Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée à jusqu'à 50 échantillons de sang en parallèle si elle est correctement réalisée. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la coloration par anticorps peuvent être effectuées afin d'identifier les sous-populations cellulaires d'intérêt.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des études sur les petits animaux pour explorer le rôle de l'activité halogénante de la MPO et de l'EPO dans des modèles animaux de maladies inflammatoires chroniques.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une méthode est décrite pour mesurer les marqueurs biochimiques du hypoxie-ischémie néonatale. L'approche utilise la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse (GC / MS).

Mesure biochimique de l&#39;hypoxie néonatale

Cette vidéo montre un test de dégranulation de granules azurophiles dans des neutrophiles de souris, impliquant la stimulation des neutrophiles pour libérer des granules azurophiles contenant de la myéloperoxydase. La réaction enzymatique qui s’ensuit est utilisée pour quantifier les niveaux de myéloperoxydase, ce qui donne un aperçu de l’activation des neutrophiles.

Un test pour surveiller la dégranulation des granules azurophiles dans les neutrophiles après activation

Nous avons adapté un ensemble de protocoles pour la mesure d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui peuvent être appliqués dans différents modèles cellulaires amibes et de mammifères pour les études qualitatives et quantitatives.

Détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle Amoeba

leucocytes du sang et de plaquettes peuvent être utilisé comme un marqueur de la santé bioénergétique globale d'un individu et ainsi avoir la possibilité de surveiller les processus pathologiques et l'impact des traitements. Nous décrivons ici un procédé pour isoler et mesurer la fonction mitochondriale et de la poussée oxydative dans ces cellules.

Bioénergétique et les oxydatif: Protocoles pour l&#39;isolement et l&#39;évaluation des leucocytes humains et plaquettes

Nous décrivons ici un dosage fluorimétrique acellulaire biochimique pour dosage du HDL-la peroxydation lipidique. Ce test rapid et reproductible peut servir à déterminer la fonction de HDL dans les études à grande échelle et peut contribuer à notre compréhension de la fonction de HDL dans la maladie humaine.

Acellulaire biochimique dosage fluorimétrique pour haut débit mesure de peroxydation des lipides dans les lipoprotéines de haute densité

Ce manuscrit décrit l’utilisation de reporters fluorogène génétiquement encodé dans une application de l’imagerie de cellules vivantes pour l’examen du stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Cette approche expérimentale offre inégalée de résolution spatio-temporelle, sensibilité et spécificité tout en évitant beaucoup des défauts des méthodes conventionnelles utilisées pour la détection du stress oxydatif toxicologique.

Imagerie des approches pour les évaluations toxicologiques stress oxydatif, à l’aide de capteurs codés génétiquement fluorogène

Cet article présente un protocole économique et efficace pour l’examen des leucocytes peroxydases positifs dans le sperme. À l’aide d’un système d’analyse de sperme assisté par ordinateur (CASA), la concentration de leucocytes positifs à la peroxydase dans le sperme peut être obtenue en 60 minutes au total, ce qui améliore efficacement l’efficacité du laboratoire d’andrologie et des andrologues.

L’examen des leucocytes peroxydases positifs dans le sperme

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires en utilisant le dihydroéthidium (DHE) comme sonde de colorant de fluorescence en utilisant une approche de criblage à haut débit. Le protocole décrit les méthodes d’évaluation quantitative des espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires dans les trois lignées cellulaires différentes de carcinome hépatocellulaire.

Évaluation préalable à haut débit de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’aide d’un colorant de fluorescence à base de dihydroéthidium (DHE)

La quantification des formes oxydées et réduites du glutathion (GSSG et GSH, respectivement) a été réalisée grâce à l’utilisation d’ortho-phtalaldéhyde (OPA). L’OPA devient très fluorescent une fois conjugué au GSH, mais il est incapable de conjuguer le GSSG jusqu’à ce qu’il soit réduit. Ici, nous décrivons un test multiparamétrique pour quantifier les deux en utilisant la quantification des protéines pour la normalisation.

Quantification rapide des formes oxydées et réduites de glutathion à l’aide de l’ortho-phtalaldéhyde dans des cellules de mammifères en culture in vitro

La génération d’anions superoxydes est essentielle pour la stimulation des plaquettes et, si elle est dérégulée, critique pour les maladies thrombotiques. Nous présentons ici trois protocoles pour la détection sélective des anions superoxyde et l’étude de la régulation plaquettaire dépendante de l’oxydoréduction.

Méthodes alternatives pour la détection de la génération d’anions superoxyde dans les plaquettes 

Apprenez une méthode rapide d'enrichissement des leucocytes à partir de petits échantillons sanguins humains et non humains. Cette technique économique et fiable permet d'évaluer l'activité peroxydase halogénante pour l'étude des marqueurs inflammatoires.

Évaluation rapide et spécifique de l'halogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes

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