Abstract
이 논문에서는 작은 전체 혈액 샘플에서 백혈구의 신속하고 표준화 된 농축을위한 프로토콜을 설명한다. 이 절차는 적혈구의 저 삼투압의 용해를 기반으로 비 - 인간 기원의 혈액뿐만 아니라 인간의 샘플에 적용될 수있다. 약 50 ~ 100 μL의 작은 초기 샘플 볼륨이 작은 실험 동물에서 반복 채혈에이 방법을 적용 할 수 있습니다. 또한, 백혈구 농축 여러 실험실 환경에서이 방법을 적용하고, 분 이내에 화학 물질 및 계측에 대한 낮은 재료 노력으로 얻을 수있다.
백혈구의 표준화 정제는 매우 선택적 헴 퍼 옥시다아제의 할로겐화 퍼 옥시 다제 활성을 평가하기 염색법, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO)와 호산구 퍼 옥시 다제 (EPO), 즉, 차아 및 하이포 아 브롬 산 (의 HOCl 및 HOBr)의 형성과 결합된다. MPO 강하게 neut 표현되지만rophils 인간 혈액과 단핵 세포에 가장 풍부한 면역 세포 유형은 관련 효소 EPO 독점적 호산구 표현된다. 이러한 효소의 활성은 할로겐화 거의 HOCl- 및 HOBr 특정 염료 아미노 페닐 플루 오레 (APF) 및 차 퍼 옥시 다제 기질, 과산화수소를 사용하여 해결된다. 이후의 유세포 분석되면 모든 퍼 옥시 다제 양성 세포 (호중구, 단핵구, 호산구)를 구별하고 그들의 할로겐화 퍼 옥시다아제 활성을 정량화 할 수있다. APF 염색은 세포 표면 마커의 적용과 결합 될 수 있기 때문에,이 프로토콜은 특히 백혈구 하위 분획을 해결하기 위해 확장 될 수있다. 상기 방법은 인간 및 쥐 백혈구에 양의 HOCl 및 HOBr 생산 검출에 적용 할 수있다.
만성 염증성 질환에서 이러한 효소 제품의 광범위하고 다양하게 설명 면역 역할을 감안할 때, 이러한 프로토콜의 이해에 기여백혈구 파생 된 헴의 퍼 옥시다아제의 면역 학적 관련성.
Introduction
다형 핵 백혈구 (백혈구라고도 과립구) 및 단핵구는 혈액 -1,2-의 선천 면역 세포의 중요한 구성 요소를 나타낸다. 이들은 병원균뿐만 아니라, 획득 면역 시스템의 활성화 및 전신성 염증 반응 2-4 개시까지 기본 방위에 기여한다. 그러나, 특히 호중구 과립구의 가장 풍부한 형태 및 단핵구는 크게 급성 염증성 사건 (5)의 규제와 종단에 기여한다. 따라서,이 세포는 류마티스 관절염 -6,7- 같은 만성 염증성 질환에서 중요한 역할을 할 수있다. 사실, 천식, 만성 염증성기도 질환, 호산구의 세포 사멸을 손상 혈액 여덟 번째 대부분 과립구 형 특징이다. 그러나 과립구의 세포 사멸 및 대 식세포에 의해 자신의 빠른 제거는 휴대 종료하는 동안 두 가지 중요한 단계는염증 9-11의.
명명 된 면역 세포 두 밀접하게 관련 효소, 즉 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO, 호중구와 단핵구)와 호산구 퍼 옥시 다제 (EPO, 호산구)에서 12, 13에서 찾을 수 있습니다. 이 헴 퍼 옥시다아제는 고전 그들이 두 전자적으로 해당 저자 (의사) 내지 (의사 -) 할로겐 자신의 살균 특성 14-16 알려져있다 halous 산을 산화로 체액 성 면역 반응 관련이 있습니다. 생리 학적 조건 MPO 주로 양식 차아 염소산 (의 HOCl)과 hypothiocyanite (- OSCN) 후자와 하이포 아 브롬 산 (HOBr)이 EPO 17-19로 형성되어있다. 새로운 결과는이 (의사 -) 할로겐 효소 활성은 또한 염증 반응의 조절과 면역 반응 (20, 21)의 종료에 기여할 수 있음을 시사한다. 사실, MPO 및 가공 제품의 HOCl 의해 생산 T 세포 기반 적응 면역 반응을 억제 22-2 나타났다4.
이 생리적 기능 MPO와 EPO의 기여를 만성 염증성 질환의 선천 면역에서 백혈구의 면역 학적 역할에 대한 추가 통찰력을 얻을 수를 결정하기 위해 우리는 빨리 후속 특정 소형 혈액으로부터 백혈구를 농축하는 방법을 개발 이들 세포의 할로겐화 퍼 옥시 다제 활성의 결정. 적혈구 고갈 위해 우리는 낮은 재료 비용으로 빠른 백혈구 농축에 이르게 증류수, 두-이후 저장성 용해 단계를 포함하는 표준화 된 방법을 선택했습니다. 후속 할로겐 MPO의 결정 및 EPO의 활동에 대한 HOCl- 및 HOBr 특정 염료 아미노 페닐 플루 오레 (APF)는 25 ~ 27을 사용 하였다. 퍼 옥시다아제 비특이적 염색 방법 28,29 적용 달리,이 방법은 종종 심각한 손상 infl에 할로겐 옥시다아제 활성의 선택적 검출을 허용ammation 30, 31.
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Protocol
모든 인간의 혈액 샘플을 건강한 지원자로부터 획득하고,인가 된 백혈구 농축 프로토콜은 라이프 치히 대학의 의학 교수의 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 쥐의 혈액과 실험 동물 관리 및 사용에 독일의 지침에 따라, 책임 지역 윤리위원회 (Landesdirektion 작센, Referat 24)에 의해 승인되었다.
1. 실험 설정
주 : 혈액 샘플에서 적혈구의 고갈에 대한 저장성 용해 절차는 시간이 중요한 과정이기 때문에, 사전에 프로토콜의이 부분에 필요한 모든 장치 (예를 들면, 완충액)을 제조 하였다.
- 저장성 용해 하나 15 ml의 원심 분리기 튜브와 혈액 샘플 당 후속 아미노 페닐 플루 오레 (APF) 염색 한 1.5 ml의 샘플 튜브 라벨.
- 백혈구 보충은 멸균 조건 하에서 수행 할 경우, 흐름 하에서 라벨링을 수행상자.
- 샘플 당 약 12 ml의 인산염 완충 식염수 (PBS, 10 mm)를 준비합니다. 백혈구는 멸균 조건 하에서 격리 여부되어야하는지 여부에 따라 공급의 준비 멸균 용액을 사용하거나 증류수 PBS 정제를 용해하거나 PBS를 준비한다. pH 값을 확인하고, 필요한 경우, 0.1 M 염산 및 수산화 나트륨 용액의 소량을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.
- 약 16 샘플에 대한 충분한 비 멸균 완충 용액을 얻었다 증류수 200 ㎖ 중의 (자재 표 참조) PBS 정제 녹인다. 원하는 경우, 멸균 여과하여 용액을 소독.
- 칼슘 보충 약 1 ml의 행크스 균형 염 용액 (HBSS) 2 + 샘플 당을 준비합니다.
- 100 ㎖의 HBSS 소금 (최종 부피)를 두 번 증류수 970 mg을 녹이고. 최종 부피까지 충전하기 전에, pH 값을 확인하여 pH 7.4로 조정한다. 낮은 버퍼 용량으로 인해, 매일 갓이 버퍼를 준비0.1 M 염산 및 수산화 나트륨 용액을 소량 사용하여 특별한주의와 pH 조정을 수행 할 거라고.
참고 멸균 용액은 실험에 따라 사용될 수있다. 용액을 멸균 여과에 의해 멸균 될 수있다.
- 100 ㎖의 HBSS 소금 (최종 부피)를 두 번 증류수 970 mg을 녹이고. 최종 부피까지 충전하기 전에, pH 값을 확인하여 pH 7.4로 조정한다. 낮은 버퍼 용량으로 인해, 매일 갓이 버퍼를 준비0.1 M 염산 및 수산화 나트륨 용액을 소량 사용하여 특별한주의와 pH 조정을 수행 할 거라고.
- 두 버퍼 라벨 게다가와 튜브를 준비 (예를 들어, 50 ㎖ 원심 분리 관) 또는 플라스크 (예를 들어, 측정 컵 250 ㎖)에 미리 용해 저장성 절차 이중 증류수. 샘플 당 약 10 ㎖의 물을 준비합니다.
- 얼음에 수행되는 APF 염색 (섹션 3), 분쇄 얼음 용기를 준비합니다.
- 염색시 사용 작업 솔루션을 신속하게 준비 할 수 있도록 사전에 APF의 분취 량을 준비 (3.2 단계) 및 냉동와 APF 솔루션의 해동을 반복하지 않도록.
주 : APF는 일반적으로 5 ㎎ / ㎖의 메틸 아세테이트 (11.81 mM)을 원액으로 얻어진다.- 0.5 ml의 튜브에 10 ~ 100 μL의 분취 량을 동결. APF는 최종 염색을 위해10 μM의 염료 농도 (단계 3.8)를 사용한다.
적혈구 2. 저압 성 용해
주 : 오염을 피하기 위해 층류 벤치에서 (원심 단계 제외) 저장성 용해 공정을 수행한다. 실온에서 전체 절차를 수행한다. 근력 저하 용해 시간이 중요한 공정이기 때문에, 사전에 물 (2 mL) 및 PBS (5 ㎖)에 첨가 피펫을 조정 절차를 시작하기 전에 물과 PBS 플라스크 연다. 사용하기 전에 실온에서 PBS 용액과 증류수 저장한다.
- 각각의 혈액 샘플 전송에서 해당 15 ML의 원심 분리 관에 100 μL.
참고 : 본 실험에서 혈액 시료는 일반적으로 응집을 방지하기 위하여 헤파린 10 U / ㎖를 함유한다. 그러나 의한 샘플 물질의 다른 소스에 항응고제의 특성 및 농도는 다를 수있다. APF 염색에 미치는 영향은 비교 예에 의해 테스트해야다른 유형 또는 항 응집제의 농도로 보충 된 혈액 샘플로부터 얻은 결과와 그 결과를 보내고. - 2 ml의 증류수를 추가하고, 중간 레벨로 설정 볼텍스 혼합기를 사용하여 샘플을 혼합한다. 다음 샘플 당 5 ml의 PBS를 추가하고 와류 믹서를 사용하여 혼합, 60 초 동안 샘플을 품어.
주의 : 샘플을 약 5까지 병렬로 제조 될 수있다. 샘플 순서 비교 배양 시간을 달성하기 위해 물 및 PBS를 첨가 동일하게 유지. - PBS를 첨가한다 (단계 2.2)을 실온에서 6 분, 450 × g으로 원심 분리하여 모든 샘플에서 남은 그대로 펠렛 세포에 의한 등장 성 상태의 재생 후.
- 테이블 폐기물 빈으로 쏟아져하여 상층 액을 제거합니다. 원심 분리 튜브를 반전하고 종이 타월 위에 개방을 눌러 많은 액체를 가능한 한 제거합니다. 세포 펠렛은 가능한 한 건조되었는지 확인합니다.
- (단계 2.2) 이전에 설명 된대로 저장성 용해 절차를 반복합니다.
엔OTE는 원칙적으로 본 저장성 용해 절차 얻어지는 혼합 백혈구 분획의 순도에 따라 두 번 이상 반복 될 수있다 (2.5-2.3이 단계). 두 용해가 혼합 얻어진 세포 분획에서 적혈구 잔존 주 단계 후에 약 25 %이다. - 실온에서 6 분, 450 × g으로 원심 분리에 의해 나머지 본래 세포 펠렛. 뜨는 (단계 2.4 참조)를 제거합니다. 펠릿에 500 ㎕의 HBSS를 추가하고 균일 한 용액이 얻어 질 때까지 부드럽게 녹인다. 따라 표시 1.5 ml의 샘플 튜브에 각 샘플을 전송합니다.
- 실험에 따라서 직접 (유동 세포 계측법을 통해 예) 얻어진 샘플 25 (32) (단일 세포 유형의 식별을위한) 형광 표지 된 항체로 염색 분석 (세포 활성화 실험) 세포 자극으로 33 부화 또는 얼음 사용에 저장된 후에. 연구의 목적에 따라 즉시 후속 실험을 수행과립구 보낸 혼합 백혈구 분획은 약 20 시간의 매우 짧은 반감기를 갖는다.
참고 :이 또한 아래에 설명 된 퍼 옥시 다제 활성 염색을 위해 보유하고있다.
3. 할로겐 퍼 옥시 다제 활동 염색
참고 : 혈액 유래 헴 퍼 옥시다아제 MPO 및 EPO에 의해 HOCl- 및 HOBr 생산 명명 된 hypohalous 산에 의해 형광에 산화 APF를 사용하여 정량한다. 형광 표지 된 항체와 세포 라벨링 APF 염색과 조합하여 수행되는 경우에 따라서, 형광의 발광 신호에 간섭을 피하기 형광체.
- 얼음에 4 ° C에서 APF 염색을 수행합니다.
- APF의 작동 용액을 제조하는 염료의 적절한 분액을 해동 (예, 10 μL, 11.81 mM)을하고 정확하게 일 밀리미터 (예를 들면, 10 μL에 108.1 μl의 완충액을 추가)하는 HBSS로 희석.
- 각 샘플 (500 ㎕의 세포 용액) 5 μ 준비설명 APF 작업 용액의 리터. 따라서, 118.1 μL APF 작업 용액 (1 ㎜)이 약 20 샘플을 준비하는 산출 APF (11.81 mM)을 하나 10 μL 나누어지는을 사용합니다. 때문에 피펫 동안 손실을 계산보다 약 10 % 더 APF 작업 솔루션을 준비합니다.
- 상기 APF 염색의 과산화 효소 특이성을 확인 헴 퍼 옥시 다제 억제제 4- 아미노 벤조산 히드라 지드 (4- ABAH) 35 제어 샘플을 준비하기 위해.
- 용매 500 μL에 756 mg의 4- ABAH 희석하여 디메틸 술폭 시드 4- ABAH (151.17 g / 몰) (DMSO)에 1 M 스톡 용액을 제조 하였다. 또한 HBSS에서 4 ABAH 1/10 희석.
- 각각 "70 mM의 H 2 O (2)"과 "7 mM의 H 2 O (2)"을 가진 H 2 O이 작동 용액 라벨 개의 1.5 mL의 원심 분리 튜브의 제조.
- "70 mM의 H 2 O 2"로 표시된 튜브에서 갓 10 μl를 희석약 88 mM의 농도를 얻기 위해 증류수 990 μL를 사용하여 H 2 O (2)의 30 % 스톡 용액 (8.8 mM)을 중. 얼음에 보관하고 4 시간 이내에 사용한다.
참고 : H 2 O 2는 일반적으로 공급 업체에 의해 30 % 원액으로 전달된다. 4 ℃에서 저장 될 때, 그것은 약 3 년 동안 안정하다. 분해를 방지하기 위해 증류수에 H 2 O 2의 희석을 수행합니다. (2) H 2 O 희석은 0.1 M NaOH 용액에서 제조 될 수있다. - 정확한 H를 결정하기위한 2 O 2 농도로 레이블 된 1.5 ㎖의 튜브에 증류수 900 ㎕를이 용액 100 μl를 첨가함으로써 처음으로 H 2 O 2 스톡 용액 (약 88 mm)를 추가로 1 ~ 10의 희석을 준비 "7mm의 H 2 O 2".
- (AN-UV 비스 photospectrometer를 사용하여 근거리 UV 범위 (예를 들면, 200 ~ 300 ㎚)에서의 스펙트럼을 기록하고 240 nm에서 흡광도를 사용49 240 = 34 M -1 cm-1)가 제 2 H 2 O 2 원액 (34)에 실제 H 2 O 2 농도를 결정한다. 기준 큐벳은 증류수가 들어 있는지 확인합니다. 측정에 사용하는 석영 큐벳을 위해 UV 영역에서 스펙트럼을 기록되어있다.
- 이 결과로부터 모두 H 2 O 2 스톡 용액의 정확한 농도를 계산한다. 증류수 적당량 첨가함으로써 "70mm의 H 2 O 2"샘플 튜브 정확히 70mm의 상기 제 원액의 농도를 조정한다. 얼음에 얻어진 작업 솔루션을 저장하고 1 시간 이내에 사용한다.
- "70 mM의 H 2 O 2"로 표시된 튜브에서 갓 10 μl를 희석약 88 mM의 농도를 얻기 위해 증류수 990 μL를 사용하여 H 2 O (2)의 30 % 스톡 용액 (8.8 mM)을 중. 얼음에 보관하고 4 시간 이내에 사용한다.
- 1 mm의 최종 농도에 해당하는 샘플 4 ABAH 작업 용액 (100 mM)을 5 μl를 추가합니다. APF 추가하기 전에 배양기에서 37 ° C에서 15 분 동안 샘플을 품어.
- 각 5 μL APF 작업 용액 (1 ㎜)를 추가500 ㎕의 샘플을 10 μM의 최종 염료 농도가 얻었다. (중간 설정에서 볼텍스 믹서를 사용하여, 예) 샘플을 부드럽게 혼합하고 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
- 700 μM의 최종 농도 각 500 μL 시료에 5 μL의 H 2 O 2 작동 용액 (70 mm)를 추가합니다. 부드럽게 샘플을 혼합하고 37 ℃에서 60 분 동안 그들을 품어. 병렬로 적절한 제어 측정을 수행한다.
주 : 제어 측정은 700 μM H 2 O (2) 세포에 대한 독성이없는 것으로 나타났다. 도 현저한 세포 반응이 관찰되었다.
주 : APF 염색 또한, H 2 O 2의 첨가를 생략 과학적 문제에 의존하여 수행 될 수있다. H (2) O (2)의 첨가는 세포에 의한 최대의 HOCl 및 HOBr 생산의 검출을 허용하면서 과산화수소가없는 경우에만 기저 염소 EPO 및 MPO 활성이 결정된다. 티그는 후자 상당히 높은 형광 신호를 의미한다. - 세포 펠렛 들어 10 실온에서 분, 400 X g 위해 원심 분리. 철저하게 펠렛을 파괴하지 않고 뜨는을 제거하고 세포를 재현 탁 250 ㎕를 HBSS를 추가합니다.
참고 : 샘플은 현재 25 유동 세포 계측법을 통해 분석을위한 준비가되어 있습니다. - 표백을 피하기 위해 분석 될 때까지 어둠 속에서 샘플을 저장합니다. 480-490 nm에서 여기 후 약 525 nm의 37에서 형광의 방출을 감지합니다.
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Representative Results
이전에보고 된 바와 같이, 상술 한 방법은 인간 및 인간 이외의 물질 (32)에 모두 적용 가능한 것으로 밝혀졌다. 천식 증상이있는 쥐에 대해 표시 또한 같이 APF 염색은 전신 염증성 상태의 차이를 감지 할 수있는 적절한 도구가 될 수 있습니다. 따라서 우리는이 프로토콜을 사용하는 후속 연구에서 반복적으로 프리 스탄 유도 관절염 (PIA) 여성 다크 아구 티 쥐에서 MPO (및 EPO)의 할로겐 활동을 평가한다. 백혈구 보충 및 실험 동안 수행 염색의 대표적인 예는도 1에 도시되어있다. 약 200 μL 전혈 마취하에 동물의 구후 정맥총으로부터 얻은 헤파린 화 하였다. 적혈구 고갈 이후 APF 염색 100 μL 샘플 량을 사용하여 수행 하였다. 이후 시료를 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다.
(도 1a)에 비해 셀 크기, 샘플에서 달성 된 적혈구의 강한 고갈을 플로팅으로되어있다. 또 다른 유형의 백혈구 형광 표지 된 세포 표면 마커를 적용함으로써 식별 된 명확하게 식별 할 수 있었다 (도시되지 않음). 사건의 약 48 %가 CD16 양성 호중구 식별 동안 간단히 적혈구 (CD235a 양성) / 세포 파편 영역에만 이벤트의 22 %를 차지했다. 또한, 이벤트마다 3 % CCR3 양성 호산구 및 CD14 양성 단구로 식별하고, 사건의 약 19 %는 각각, CD5 / CD19 양성 B 및 T 림프구를 차지했다. 단핵 세포 및 호산구가 적당한 APF 산화에지도와 호중구가 채널에서 강하게 퍼 옥시 다제 양성했다 동안 APF 유래 형광의 강도 분포 (그림 1B)를 명확하게 퍼 옥시 다제 음성 적혈구와 림프구의 차별을 허용OSEN 실험 조건. 단구 (20)에서의 효소의 농도에 비해 이러한 결과는 후자 세포 MPO 높은 풍부와 일치한다. 호산구의 비교적 약한 반응이 더 브롬화 HOBr의 EPO 유래 형성 자극되었을 수도있는, 첨가하지 않은 것이 사실로 설명 될 수있다. 격리 된 호산구에 대한 예비 연구는 놀랍게도이 세포에 의해 APF 산화에 외부에서 추가 브로마이드 큰 영향을 보이지 않았다. 아직도, 브롬 소량의 도입에 의해 설명 될 수있다 관찰 된 호산구에 의해 APF의 산화 - (PBS와 HBSS) 사용되는 버퍼 솔루션을 통해. 대안 EPO는 (phagolysosomes에서 예) 이상, 산성 조건에서의 HOCl 소량을 생성 할 수있다.
그림 1 : 백혈구 농축 및 APF-파생쥐로부터 혈액 마이크로 샘플 D 형광. 200 ㎕의 전체 혈액의 양 여성 어두운 아구 티 쥐의 구후 정맥총으로부터 얻었다. 혼합 된 세포 분획을 100 ㎕의 혈액 오염에 기재된 용혈 과정을인가하고, 후속 APF 후에 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. FSC- / SSC- 플롯 (A)로 도시 된 바와 같이 적혈구 강하게 시료로부터 고갈시키고 다른 백혈구 유형은 쉽게 구별 될 수있다. APF 파생 형광 강도 (B)의 분포는 명확하게 보여 주었다 헴 퍼 옥시 다제 음성 중간 (호산구와 단핵구) 강한 (호중구) 할로겐 과산화 효소 활성을 갖는 세포 (적혈구와 림프구)뿐만 아니라 백혈구. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
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Discussion
호중구를 인간 혈액에서 가장 풍부한 백혈구과 마찬가지로 퍼 옥시 다제 양성 세포의 분리는 종종 이러한 셀에 초점을 밀도 구배 원심 분리 (38)에 의해 다른 백혈구에서 호중구의 분리를 포함한다. 호중구는 훨씬 덜 풍부 뮤린 혈액 샘플에 대해서는 아직 후자보다 복잡한 방법 39 40을 사용한다. 또한 두 방법 모두는 또한 더 큰 혈액 볼륨의 필요성, 샘플에서 퍼 옥시 다제 양성 단핵 세포의 제거로 이어질하고 (예를 들어, 400 μL 41), 작은 실험 동물에서 재발 혈액 샘플링 동안 획득 마이크로 샘플에 적용되지 않습니다 (38, 40). 복막 삼출물에서 쥐의 호중구의 정제는 또한, 혈액 유래 과립구 (38, 40)을 생성하지 않고, 동물의 희생이 필요합니다. 최근 뮤린 BL로부터 고순도 과립구 획분을 얻기 위해 방법을 개발OOD (예를 들어, 항체의 응용)이다 종종 고가의 복잡하고 시간을 소모 40,42,43 다시 하나의 퍼 옥시 다제 양성 백혈구 형의 정화에 초점을 맞춘다.
그러므로 여기에 제시된 방법은 퍼 옥시다아제 - 양성 백혈구의 정제에 적용될 다른 방법에 비해 몇 가지 장점을 갖는다. 이 작은 혈액 샘플 기반으로 수득 한 세포 순환의 상황을 나타낸다. 프로토콜에 필요한 작은 초기 샘플 량에 의한 방법은 호중구의 풍부 종 특이 적 차이에도 불구하고, 인간 및 비 - 인간 혈액 모두에 적용 가능하다. 사실, 심지어 50 μl를 작게 혈액량 최초 설명한 방법을 적용 할 수 있었다 (결과 미도시). 방법에 필요한 작은 혈액 샘플은 작은 실험 동물에서 특수 의료 응용 프로그램 (예를 들어, 신생아 진단)에 대한 반복 혈액 철수에 적합합니다. t으로그 백혈구 농축 모든 퍼 옥시 다제 양성 세포 (호중구, 호산구, 단핵구)를 수득 혼합 백혈구 분획에 포함되어 별도로 유세포 분석기를 사용하여 분석 될 수있다 적혈구의 고갈에 기초한다. 상기 방법은 빠르고 안정적이며 여러 과학 환경 프로토콜 적합 화학 물질 및 장비에 관한 낮은 요구 사항을 갖는다.
호중구를 쉽게 사용하는 완충액의 pH 값의 정확한 조정 기재된 방법 중 하나의 중요한 단계이다 활성화되면 (PBS 및 HBSS이 단계 1.2 프로토콜 부 1.3 참조). 또한 증류수로 혈액 세포의 배양 시간은 normosmotic 조건 (프로토콜 섹션의 단계 2.2 참조 복원하기 전에 60 초보다 더 이상 없을 것이다. 첨가 전 세포 펠렛 (단계 2.4)에서 용매의 (거의) 완전히 제거 두 번째 저장성 용해 물의 버프 등의 다른 중요한 단계입니다ER 잔기는 저장성 용해 절차의 효율성을 감소시킬 것이다. 다른 중요한 단계는 APF 염색 중에 H 2 O 2의인가를 말한다. 적용 금액은 세포 독성 안하지만, 세포 활력 확인해야합니다. 우리의 연구 동안, 우리는 일반적으로 염료를 적용 5,5 ', 6,6'- 테트라 클로로 - 1,1', 3,3'- tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine오다 이드 (JC-1) 초기 사멸 이벤트의 검출.
또한, 설명 단순화 된 백혈구 농축 방법의 제한의 몇 가지가있다. 이 기술은 여러 종 (사람, 래트, 마우스 시도되었다)으로부터 혈액 시료에 적용 할 수 있지만, 적혈구 용해 후의 백혈구 양은 혈액 초기 풍부에 의존한다. 후자는 확실히 종 (39) 사이에서 변화 또한 프로빙 된 개인의 염증 상태에 따라 달라집니다. 또한, 용해 과정은 최대 하나와 함께 할 수있는 반면백 샘플 병렬 중간 원심 단계는 30 샘플을 병렬로 처리 할 수 있고, 사용에 따라 원심 분리 등의 제한을 야기. APF 용이 SCN의 존재의 HOCl 및 HOBr를 검출한다 또한, - EPO 및 MPO의 활성 할로겐은 후자 의사 할라이드에 영향을 미친다. (- OSCN) 이에 hypothiocyanite는 APF를 산화 할 수없는 어떤 형성된다. 또 다른 제한은 MPO 및 EPO에 의해 HOCl-의 결정 및 HOBr 생산에 사용되는 APF 염료의 특성에서 비롯됩니다. 형광 염료가 산화되기 때문에, 염색은 동일한 영역에 발광 스펙트럼을 형광 항체와 결합 될 수 없다. 물론 APF 유래 형광 추가 형광 신호의 신호 사이의 간섭 체크 및 흐름 cytometer에 보상해야합니다.
그렇지 않으면, 할로겐화 퍼 옥시 다제 활성의 검출이 범위가 아닌 경우적혈구 결핍 방법의 적용 후에 다른 분석 방법 APF 대신 사용될 수있다 공부. 상술 저장성 용해 절차는 적혈구의 부분 고갈 모든 백혈구로서 리드 같이 여전히 단일 세포 분석을 적용 할 수있는 유일한 방법 얻어진 혼합 세포 분획에 존재한다. (예를 들어, 웨스턴 플롯 분석) 세포의 용해를 포함하는 방법은 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수 없습니다. 작은 초기 샘플 볼륨은 분석 방법의 또 다른 장애물이 될 수있다.
세포로 백혈구의 MPO (및 EPO)의 조사 활동 종종 일반 산화제 생산과 관련하여 대신 구체적으로 헴 퍼 옥시 다제 활성 44,45 평가의 해결됩니다. 또한 종종 더 시도는 할로겐 및 MPO와 EPO (46, 47)의 퍼 옥시 다제 활성을 구별하려고하지 않습니다. 특히 한때하여 염소 MPO 활동을 해결하는 방법,chlorotyrosine 등의 HOCl - 파생 된 제품을 antifying 것은 산화를 통해-및 / 또는 제품을 대사 감지하고, 따라서 종종 실제의 HOCl 생산 (48)의 과소 평가로 이어질하지 않습니다. 또한이 방법과의 HOCl 유래 -2- chloroethidium의 검출은 염소 MPO 활성의 특이 판정을위한 새로운 염료에 대한 많은보고가 있으며, 또한, 시간이 많이 소요되어 비용 분석 장비가 필요하고 세포 48-50 .There의 용해를 포함 중요한 세포 44,51,52 내. 그러나 지금까지 오직 APF 및 관련 화합물 하이드 록시 페닐 플루오 레세 인 (HPF)은 시판 따라서 정기적 25,33 연구에 사용된다.
사실, APF를 이용하여 우리는 염소 MPO 활성이 단지 절연 효소 (53)을 이용하여 살아있는 세포뿐만 아니라 26,33에 색소를 도포하여 정량화 될 수 없다는 것을 표시 할 수있다. 따라서 상술 한 바와 혈액 마이크로 샘플에서 빠른 백혈구 농축을 결합하여N APF 염색 우리는 특히 동시에 모든 퍼 옥시 다제 양성 백혈구, 즉 호중구, 호산구, 단핵구 및 32 MPO와 EPO의 할로겐화 활성을 해결하기에 적합한 프로토콜을 개발했다. 또한 상기 방법은 유동 세포 계측법, 형광 공 촛점 현미경 분석 방법을 포함하여, 광범위한 다양성을 허용 세포 용해를 필요로하지 않는다. 또한이 옥시다아제 활성 염색은 과학적 작업에 따라 백혈구 서브 분획의 구체적인 분석을 허용 세포 표면 마커의 적용과 결합 될 수있다. 그러나 그것은인가 형광 표지 된 항체는 HOCl- 및 HOBr 유래 APF 산화를 정량화하는데 사용되는 형광 계 형광 신호와 간섭하지 않도록 고려하여야한다.
요약하면이 방법은 면역 다시의 할로겐 퍼 옥시 다제 활동의 생리 학적 역할에 더 많은 통찰력을 얻을 수있는 새로운 도구를 제공 할 수있다이다 레반트 혈액 유래 퍼 옥시다아제 MPO 및 EPO는 여전히 잘 8,20,23을 이해하지. 또한 류마티스 관절염에 동물 연구에서 우리는 최근에이 프로토콜은 만성 염증성 질환 (게시되지 않은 데이터)에 새로운 임상 마커로 MPO 유래의 HOCl 생산 평가로 이어질 수 있음을 관찰 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials/Equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | - |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | - |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g., 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | - |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | - |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450 x g |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400 x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1 M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | - |
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