Visualisation et quantification de la couche acellulaire en artérioles du muscle Cremaster Rat

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les variations spatio-temporelles de la largeur de la couche acellulaire in vivo. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hémodynamique microscopique, afin de mieux comprendre le rôle de la cellulo-philia dans la microcirculation. Le principal avantage de cette méthode réside dans le fait que la largeur de la cellulo-philia in vivo peut être quantifiée de manière plus reproductible et plus pratique que les techniques de mesure manuelle précédentes, qui étaient très longues.

Avant de commencer la mesure de la largeur de la couche acellulaire, exécutez le script préalable à MatLab pour la couche acellulaire. Ensuite, cliquez sur « ouvrir le fichier » pour sélectionner le fichier vidéo à analyser, puis ajustez le curseur de rotation afin d'aligner verticalement les parois du vaisseau unique, en utilisant le curseur de zoom pour régler le niveau de zoom si nécessaire. Lorsque le vaisseau est correctement positionné, cliquez sur « confirmer la modification », puis sur « définir la zone d’intérêt (ROI) » pour recadrer et définir la région d’intérêt.

L'image alignée s'affichera dans une fenêtre contextuelle. Ajustez le rectangle objectif sur l'image selon les besoins et double-cliquez sur l'objectif pour confirmer la région d'intérêt. Cliquez ensuite sur Extraire les images pour extraire toutes les images vidéo modifiées sous forme d'images bitmap consécutives, qui se trouveront dans le dossier portant le même nom que le fichier vidéo sélectionné.

Pour mesurer la largeur de la couche acellulaire, cliquez sur Sélectionner un dossier puis sur le dossier contenant les images. La première image apparaîtra dans le panneau d'image en niveaux de gris, accompagnée de l'histogramme d'intensité gris correspondant dans le panneau d'histogramme d'image. Sélectionnez l'image souhaitée dans la zone de liste pour effectuer l'analyse, puis cliquez sur Trouver les parois du vaisseau afin d'identifier la paroi interne du vaisseau sur l'image, déterminée comme étant l'endroit où le pic du profil d'intensité lumineuse passe du foncé au clair sur deux pixels.

Cochez Filtre médian pour appliquer un filtre médian à l'image afin de réduire le bruit dit « sel et poivre ». Cochez Contraste automatique pour un ajustement numérique des intensités de l'image afin d'en améliorer le contraste. Ensuite, sélectionnez un algorithme de seuillage dans la zone de liste afin de déterminer automatiquement la valeur de seuil qui divise les niveaux de gris en deux classes : les pixels blancs dont les niveaux de gris sont supérieurs à la valeur de seuil, et les pixels noirs dont les niveaux de gris sont inférieurs à cette valeur.

Pour mesurer la variation spatiale des largeurs de la couche sans cellules, saisissez la résolution en pixels dans la zone de résolution en pixels. Cliquez ensuite sur Calculer pour obtenir la variation spatiale des largeurs de la couche sans cellules, puis sur Exporter .csv pour exporter les données de largeur de la couche sans cellules dans un format tabulaire.

Pour mesurer la variation temporelle des largeurs de la couche acellulaire sur une ligne d'analyse spécifique le long du vaisseau, cliquez sur Variation temporelle et saisissez les informations concernant la fréquence d'images. Indiquez les première et dernière images des images à analyser respectivement dans les champs « frame de départ » et « frame finale ». Ajustez la barre de défilement de la ligne d'analyse afin de sélectionner la position de la ligne d'analyse le long du vaisseau, puis confirmez cette position telle qu'illustrée sur les images en niveaux de gris et les images binaires.

Ensuite, cliquez sur Calculer pour obtenir la variation temporelle des largeurs de la couche exempte de cellules, puis sur Exporter. csv pour exporter les données de largeur de la couche exempte de cellules dans un format tabulé. Voici un exemple typique d'écoulement d'érythrocytes dans une artère non ramifiée du muscle crémastère de rat, où la couche exempte de cellules est visible entre le noyau d'hématies et la paroi interne du vaisseau.

Un bon contraste entre ces composants est essentiel pour garantir la précision des mesures de la largeur de la couche sans cellules. La phase initiale de l'analyse d'image consistait à détecter la paroi interne du vaisseau. En enregistrant le profil d'intensité lumineuse le long de la ligne d'analyse perpendiculaire au vaisseau, l'emplacement est approximé au niveau du pic passant du foncé au clair sur deux pixels.

Par la suite, les limites du noyau des globules rouges sont détectées à l’aide de l’algorithme de seuil d’image et les largeurs de la couche exempte de cellules peuvent alors être calculées. Étant donné que les globules rouges présents dans la couche exempte de cellules possèdent des taux de transmission lumineuse différents, la différence des niveaux de gris peut être divisée en deux classes. Toutefois, l’identification d’une valeur de seuil précise entre les deux pics de l’histogramme de l’image peut être limitée par une faible qualité d’image et un contraste insuffisant.

Pour améliorer le contraste entre les globules rouges et la couche acellulaire, un filtre bleu peut être utilisé. Ce phénomène est encore plus marqué sur ces images, où les limites des cœurs de globules rouges ont été identifiées plus précisément à l’aide d’un filtre bleu. L’algorithme de seuil peut également influencer la mesure de l’épaisseur de la couche acellulaire, comme le montrent ces images, dans lesquelles différents algorithmes de seuil ont conduit à l’identification de frontières différentes pour les cœurs de globules rouges, et par conséquent à des épaisseurs de couche acellulaire différentes.

La mesure de la largeur de la couche acellulaire in vivo est très sensible à la qualité des images. Par conséquent, veillez à réaliser la chirurgie avec soin et à utiliser un assistant optique approprié afin d'obtenir une image de bonne qualité. De plus, il est essentiel de choisir l'algorithme de seuillage d'image approprié pour garantir une mesure précise et reproductible de la largeur de la couche acellulaire.