Interrenal Steroidogenic ऊतक और zebrafish में इसका संवहनी Microenvironment Visualizing

Summary

zebrafish में interrenal ग्रंथि स्तनधारी अधिवृक्क ग्रंथि के teleostean समकक्ष है। Enzymatic गतिविधि परख है, जो विकासशील zebrafish में विभेदित steroidogenic कोशिकाओं का पता लगाता है, इस प्रोटोकॉल कैसे 3-β-hydroxysteroid डिहाइड्रोजनेज (3β-एचएसडी Δ ^5-4 आइसोमेरेस) प्रदर्शन करने के लिए परिचय।

Introduction

अधिवृक्क ग्रंथि, hypothalamo-पिट्यूटरी-अधिवृक्क अक्ष का एक महत्वपूर्ण घटक है, स्टेरॉयड का स्राव होता है और स्टेरॉयड homeostasis और तनाव को शारीरिक प्रतिक्रिया समन्वय करता है। अधिवृक्क ग्रंथि बाहरी कोर्टेक्स है, जो एक क्षेत्र विशेष तरीके में स्टेरॉयड स्रावित करता है, और भीतरी मज्जा, जो catecholamines synthesizes शामिल हैं। Teleosts में interrenal ग्रंथि स्तनधारियों में अधिवृक्क ग्रंथि के समकक्ष है और steroidogenic interrenal और क्रोमाफिन कोशिकाओं है, जो अधिवृक्क प्रांतस्था और मज्जा में क्रमश: ^1-3 के कार्यात्मक समकक्ष हैं से बना है। Zebrafish मॉडल का उपयोग किए गए अध्ययनों से सूचित किया है कि दोनों steroidogenic और क्रोमाफिन सेल प्रजातियों आणविक और सेलुलर तंत्र अत्यधिक स्तनधारियों ^1,2 में उन जैसी से बनते हैं। इसलिए, zebrafish आनुवंशिक विकारों, neuroendocrine नियंत्रण, और hypothalamo पीयूषिका आधिवृक्क (interrenal) अक्ष के सिस्टम जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक संभावित शक्तिशाली मॉडल है।

4,5 से 17α-hydroxypregnelolone से pregnenolone, 17α-hydroxyprogesterone से प्रोजेस्टेरोन का रूपांतरण है, और androstenedione उत्प्रेरित। 3β-एचएसडी हार्मोनल स्टेरॉयड, अर्थात् प्रोजेस्टेरोन, glucocorticoids, mineralocorticoids, एण्ड्रोजन और एस्ट्रोजेन के सभी वर्गों biosynthesizing के लिए आवश्यक है। दो मानव 3β-एचएसडी HSD3B1 isozymes और HSD3B2 विभिन्न ⁶ व्यक्त कर रहे हैं। HSD3B1, नाल और परिधि के ऊतकों में व्यक्त किया जबकि HSD3B2 अधिवृक्क प्रांतस्था और gonads में व्यक्त किया जाता है। मानव HSD3B1 और HSD3B2 zebrafish hsd3b1, जो interrenal ऊतक और वयस्क gonads में व्यक्त किया जाता है के सह orthologs कर रहे हैं; zebrafish hsd3b2 एक माता के रूप में व्यक्त जीन जिसका टेप जीवोत्पत्ति ⁷ से पहले गायब हो जाते है। zebrafish के लिए पूरे माउंट 3β-एचएसडी enzymatic गतिविधि परख के प्रोटोकॉल, लेवी की विधि को संशोधित करके विकसित किया गया था एकमिलानो एट अल द्वारा वर्णित रहा है। आठ teleost प्रजातियों ⁸ के जमे हुए वर्गों पर। ऊतक पारगम्यता और विकासशील zebrafish की ऑप्टिकल पारदर्शिता की वजह से पूरे माउंट 3β-एचएसडी ऊतकरसायनविज्ञान सफलतापूर्वक निश्चित zebrafish भ्रूण और लार्वा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और विशेष रूप से विभेदित interrenal ऊतकों को चित्रित।

यह संवेदनशील और तेजी से परख विभिन्न म्यूटेंट और morphants interrenal dysmorphogenesis के विभिन्न प्रकार का प्रदर्शन करने के लिए लागू किया गया है। Interrenal 3β-एचएसडी गतिविधि भ्रूण जहां interrenal ऊतक के विनिर्देश Ff1b प्रतिलेखन कारक की एक विशिष्ट पछाड़ना के माध्यम से बाधित है और के रूप में interrenal भेदभाव Ff1b coregulator Prox1 ^9,10 के एक पछाड़ना से प्रभावित है कमी आई है में अनुपस्थित है। विशेष रूप से, 3β-एचएसडी गतिविधि, गंभीर प्रारंभिक चरण दोष के साथ म्यूटेंट में पता लगाया जा सकता है एक आंखों सिरा जैसे और भेंगापन, जहां 3β-एचएसडी ऊतकरसायनविज्ञान रूपरेखा बनाती कैसे interrenal सेल प्रवास ¹¹ प्रभावित है। interrenal ऊतक के भेदभाव को भी रक्त वाहिका और के पूर्ण अभाव में समझौता नहीं किया है। इसलिए, कैसे endothelium व्युत्पन्न संकेतों को आकार विकासशील interrenal अंग ^12,13 निर्धारित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस histochemical परख सफलतापूर्वक zebrafish मॉडल में विनिर्देश, भेदभाव, और steroidogenic कोशिकाओं के प्रवास के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसलिए, यह एक कुशल और अधिवृक्क और interrenal अंग विकारों को लक्षित किसी भी आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीन के लिए एक विश्वसनीय उपकरण होना चाहिए।

Protocol

आचार कथन: zebrafish पर सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं Tunghai विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (आईआरबी अनुमोदन नहीं 101-12।) और अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है।

1. 3β-एचएसडी enzymatic गतिविधि धुंधला के लिए स्टॉक समाधान

1. ट्रांस-dehydroandrosterone [डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 10 मिलीग्राम / एमएल] तैयार करें।
2. β-निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड हाइड्रेट (0.1 एम फॉस्फेट बफर में 1.2 मिलीग्राम / एमएल, पीएच 7.2) तैयार करें।
3. (/ मिलीलीटर में एच ₂ ओ विटामिन बी 3, 50 मिलीग्राम) निकोटिनामाइड तैयार करें।
4. 4-नाइट्रो नीले tetrazolium (70% dimethylformamide में 50 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें।
5. अशेष सभी -20 डिग्री सेल्सियस पर microfuge ट्यूब और दुकान में इन घटकों।
   नोट: हमारे अनुभव, दोहराया ठंड और सभी aforementioned समाधान की aliquots का विगलन में 3β-एचएसडी गतिविधि धुंधला की तीव्रता को प्रभावित नहीं करते।

2. डब्ल्यूछेद माउंट 3β-एचएसडी गतिविधि धुंधला

नोट: 3β-एचएसडी enzymatic गतिविधि के रूप में जल्दी के रूप में 28 घंटे के बाद निषेचन (HPF) जब सुसंस्कृत 28.5 डिग्री सेल्सियस, जो hsd3b1 ^2,7 के mRNA अभिव्यक्ति की शुरुआत के साथ संगत है पर zebrafish भ्रूण में detectable है। पूरे माउंट 3β-एचएसडी इस अध्ययन में गतिविधि धुंधला प्रोटोकॉल एक पहले से वर्णित विधि ⁸ पर आधारित है और 7 दिनों के बाद निषेचन ^{से 9} विकासशील zebrafish में सफल होने के लिए निर्धारित किया गया था। Interrenal steroidogenic ऊतक के संवहनी microenvironment का विश्लेषण करने के लिए, पूरे माउंट 3β-एचएसडी गतिविधि धुंधला ऐसे टीजी के रूप में endothelium विशेष प्रतिदीप्ति, व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइनों (kdrl: EGFP) को लागू किया जाना चाहिए ^{s843 14} और टीजी (kdrl: mCherry) ^{ci5 15} । interrenal steroidogenic ऊतक zebrafish गुर्दे विकास पर विचार का विश्लेषण करने के लिए, 3β-एचएसडी गतिविधि धुंधला appli हो सकता हैएड टीजी (wt1b: GFP) को ^Li1 मछली ^16, जहां glomerulus और pronephric नलिकाओं के गठन चित्रित किया जाता है।

1. विकासशील zebrafish अंडे पानी में 0.03% phenylthiourea में उन्हें incubating (विआयनीकृत पानी में 0.06 मिलीग्राम / एल चट्टान नमक) द्वारा समझो, 12 और 24 HPF के बीच एक स्तर से शुरू, वर्णक गठन को बाधित करने के लिए।
2. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में रात भर कमरे के तापमान (आरटी) या (बी) 2% PFAT पर 1 घंटे के लिए 0.1% के बीच 20 (PFAT) के साथ पूरक में dechorionated भ्रूण या (ए) 4% paraformaldehyde (पीएफए) में लार्वा को ठीक करें 4 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा, आरटी पर 4 घंटा के द्वारा पीछा के लिए।
   सावधानी: पीएफए ​​साँस लेना द्वारा और त्वचा के संपर्क से विषैला होता है। यह त्वचा, श्लेष्मा झिल्ली, आंखें, और ऊपरी श्वास पथ के लिए विनाशकारी है।
3. 10 मिनट के लिए भ्रूण 4x धो पीबीएस के साथ आरटी पर 0.1% बीच 20 (PBST) के साथ पूरक।
   नोट: यह महत्वपूर्ण है, जबकि कपड़े धोने के समाधान को बदलने के लिए नमूने नहीं सूखी है।
4. हौसले स्टेशन तैयारप्रतिक्रियाओं से पहले ining समाधान (1 टेबल)। , तैयार भंवर, और सेंट्रीफ्यूज भागों ए और अलग नलियों में बी।
   नोट: सीधे एक एकल ट्यूब में सभी घटकों को जोड़ने गंभीर वर्षा का कारण होगा।
5. भाग एक की संपूर्ण समाधान हिस्सा बी की पूरी समाधान के लिए जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से धुंधला समाधान तैयार करने के लिए, और तुरंत तय की और धोया भ्रूण युक्त प्रत्येक microfuge ट्यूब में 1 मिलीलीटर वितरित।
6. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें microfuge ट्यूबों या तो एक रोटेटर या मिलाते हुए कोमल आरटी पर एक कमाल मंच पर प्रकाश और जगह से उन्हें बचाने के लिए।
7. अनुभव से माइक्रोस्कोपी के माध्यम से chromogenic संकेतों की निगरानी के द्वारा प्रतिक्रिया समय का निर्धारण। मामूली बारिश के समय के साथ विकसित करना होगा; हालांकि, वे प्रतिक्रिया प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा।
   नोट: भ्रूण 4 घंटे के लिए 28 HPF, धुंधला पर तय करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर interrenal ऊतक में एक स्पष्ट संकेत उत्पन्न करता है।
8. PBST में 10 मिनट के लिए 4x धोने से प्रतिक्रिया बंद करो। मैंएफ आगे कोई प्रतिरक्षाऊतकरसायन (आईएचसी) विश्लेषण की आवश्यकता है, बाद ठीक आरटी पर 60 मिनट के लिए 4% PFAT के साथ दाग भ्रूण। अन्यथा, आगे उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर धोया भ्रूण की दुकान।
9. पूरे माउंट माइक्रोस्कोपी के लिए, पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल के साथ, दाग के बाद तय है, और धोया भ्रूण स्पष्ट उन्हें एक स्लाइड पर सामना करना पड़ रहा पृष्ठीय पक्ष के साथ ओरिएंट, और उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निरीक्षण करते हैं।
   नोट: interrenal ऊतक आकृति विज्ञान के एक उच्च संकल्प छवि, फ्लैट माउंट 3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ और deyolked भ्रूण का विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है। जैसा कि interrenal steroidogenic ऊतक सही जर्दी थैली ऊपर तैनात है, interrenal ऊतक के एक उदर फ्लैट माउंट विश्लेषण interrenal आकृति विज्ञान ¹⁷ का एक सीधा और स्पष्ट अवलोकन अनुमति देता है।

3. 3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ भ्रूण की आईएचसी विश्लेषण

ध्यान दें: steroi की नाड़ी microenvironment का विश्लेषण करने के लिएdogenic ऊतक, एक ट्रांसजेनिक endothelium विशिष्ट फ्लोरोसेंट पत्रकार के साथ 3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ भ्रूण vibratome सेक्शनिंग और बाद में आईएचसी विश्लेषण ^12,18 अनुप्रस्थ के अधीन हैं।

1. पोस्ट-निर्धारण
   1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2% पीएफए ​​के साथ 3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ है और धोया भ्रूण 1 घंटे के लिए 1% ट्राइटन X-100 के साथ पूरक पोस्ट को ठीक करने और पीबीएस में 10 मिनट के लिए 1% ट्राइटन X-100 युक्त लिए 4x धोने (PBSTx) आरटी पर।
2. एम्बेड
   1. 4% 95 डिग्री सेल्सियस, 4-8 डिग्री सेल्सियस पर microfuge ट्यूबों में विभाज्य, और दुकान पर पीबीएस में agarose भंग द्वारा agarose कम पिघलने को तैयार है।
   2. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 4% कम पिघलने agarose की एक विभाज्य पिघला, और फिर 47 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य रखने के लिए। में प्रत्येक भ्रूण एम्बेड पिघला हुआ 4% एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब जो एक मोल्ड के रूप में कार्य करता है के लिए एक अलग टोपी में agarose कम पिघलने, और ठोस जब तक शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
3. vibratome सेक्शनिंग
   1. सूखी पी करने के लिए कागज टेप का एक टुकड़ा चिपकाvibratome की latform।
   2. एक रेजर ब्लेड से मोल्ड से कठोर agarose ब्लॉक निकालें। मंच पर कागज टेप करने के लिए superglue लागू करें, और नमूना का सामना करना पड़ के पूर्वकाल पक्ष के साथ, कागज टेप पर agarose ब्लॉक तय कर लो। एक trapezoidal चश्मे आकार के लिए agarose ब्लॉक ट्रिम, लगभग 4 मिमी और ऊपरी और निचले पहलुओं के प्रत्येक पक्ष पर 8 मिमी, क्रमशः के साथ।
   3. एक dropper का उपयोग करके 0.5% ट्राइटन X-100 (0.5% PBSTx) के साथ पूरक ठंड पीबीएस के साथ नमूना युक्त agarose ब्लॉक कुल्ला।
   4. vibratome के अनुदेश पुस्तिका के अनुसार 100 माइक्रोन वर्गों में agarose ब्लॉक स्लाइस। लगातार सूखने को रोकने के लिए agarose ब्लॉक कुल्ला। के रूप में प्रत्येक टुकड़ा काट रहा है, एक 26 जी सिरिंज सुई का उपयोग vibratome से इसे हटाने, और ठंड 0.5% PBSTx (500 μl / अच्छी तरह से) युक्त एक जगह प्लेट के लिए स्थानांतरण।
   5. एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे की जाँच करके 3β-एचएसडी गतिविधि पॉजिटिव ऊतक वर्गों लीजिए, और एक अनुकरणीय द्वारा वर्गों का स्थानांतरणएक 96 अच्छी तरह से थाली ठंड 0.5% PBSTx (150 μl / अच्छी तरह से) युक्त में अपने अंत कट-ऑफ (लगभग 1 मिमी उद्घाटन के अवसर पर भीतरी व्यास) के साथ Pette टिप। ऊतक के नमूने आम तौर पर इस कदम के बाद agarose ब्लॉक से अलग कर देना।
4. Permeabilization और धुलाई
   1. धो स्लाइस आरटी पर 0.5% PBSTx में 15 मिनट, पीबीएस में 10 मिनट, और 4x के लिए 6x के लिए पीबीएस में 10 मिनट के लिए 1% गोजातीय सीरम albumin / 1% DMSO / 0.1% ट्राइटन X-100 (PBDTx) के साथ पूरक।
5. अवरूध्द
   1. आरटी पर 1 2 में मानव संसाधन% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) PBDTx में स्लाइस सेते हैं।
6. प्राथमिक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया
   1. PBDTx में 1.5 दिनों एक प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त लिए स्लाइस सेते हैं (जैसे, खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी मानव fibronectin और माउस विरोधी मानव फोकल आसंजन काइनेज) 4 डिग्री सेल्सियस पर।
7. धुलाई
   1. धो स्लाइस आरटी पर PBDTx में 10 मिनट के लिए 6x।
8. अवरूध्द
   1. पंजाब में 2% एफसीएस में 1 घंटे के लिए स्लाइस सेतेआरटी पर DTX।
9. माध्यमिक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया
   1. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक माध्यमिक एंटीबॉडी (fluorophore संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश या विरोधी माउस आईजीजी) युक्त PBDTx में 1.5 दिनों के लिए स्लाइस सेते हैं।
10. धुलाई
    1. धो स्लाइस आरटी पर PBST में 10 मिनट के लिए आरटी पर PBDTx में 10 मिनट और 4x के लिए 6x।
       ध्यान दें: confocal सूक्ष्म विश्लेषण के लिए, पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल के साथ नमूने साफ़ करें।

4. Confocal विश्लेषण

1. पूरे माउंट भ्रूण और एक confocal 10X / 0.5 और 20X / 0.75 उद्देश्य लेंस के साथ सुसज्जित खुर्दबीन अनुभाग द्वारा निरीक्षण करें।
2. प्रतिदीप्ति और 3β-एचएसडी धुंधला के एक साथ पता लगाने के लिए, ठीक खेल विधा के रूप में स्थापित: 488 एनएम आर्गन लेजर और GFP का पता लगाने के लिए 505-530 एनएम bandpass फिल्टर; 543 एनएम हीलियम नीयन लेजर और mCherry का पता लगाने के लिए 560-615 एनएम bandpass फिल्टर; और 3β-एचएसडी धुंधला का पता लगाने के लिए प्रकाश चैनल प्रेषित।पिनहोल आकार 1 Airey इकाई है, और संकल्प 1024 x 1024 पिक्सल है।
3. एक 3 डी प्रोजेक्शन के रूप में इकट्ठा (6 माइक्रोन अंतराल के साथ) जेड के ढेर, और प्रक्षेपण और उज्ज्वल क्षेत्र विलय, का उपयोग करके निर्मित में confocal सॉफ्टवेयर।

Representative Results

कैसे निर्धारित करने के pronephric गुर्दे glomerulus और उसके नवजात वाहिका साथ steroidogenic interrenal ऊतक codevelops, 3β-एचएसडी enzymatic गतिविधि परख डबल ट्रांसजेनिक टीजी (wt1b: GFP) पर प्रदर्शन किया गया था ^Li1, टीजी (kdrl: mCherry) ^ci5 भ्रूण 34 HPF पर (चित्रा 1)। इस स्तर पर, 3β-एचएसडी गतिविधि पॉजिटिव steroidogenic ऊतक midline के लिए सही स्थित है और तुरंत pronephric गुर्दे glomerulus के लिए दुम जबकि कुछ steroidogenic कोशिकाओं midline भर में पलायन शुरू और पृष्ठीय देखने से फैलने वाला बढ़त के रूप में। steroidogenic ऊतक बारीकी पृष्ठीय महाधमनी (डीए) और पीछे कार्डिनल नस (PCV) के साथ जुड़ा हुआ है।

3β-एचएसडी टीजी (kdrl: GFP) पर enzymatic गतिविधि परख ^s843 भ्रूण पेरी interrenal जहाजों का एक स्पष्ट चित्रण की अनुमति दी, डीए, PCV सहितऔर interrenal पोत (IRV, चित्रा 2)। 3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ भ्रूण के vibratome वर्गों बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन fibronectin और इसके नीचे की ओर प्रेरक phosphorylated फोकल आसंजन Kinase का पता लगाने के लिए आईएचसी विश्लेषण के अधीन थे। Fibronectin के पेरी-डीए बयान IRV वृद्धि ¹⁸ का समर्थन करने के लिए आवश्यक है।

चित्रा 1: पूरे माउंट 3β-एचएसडी गतिविधि zebrafish फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त पर प्रदर्शन धुंधला हो जाना। पृष्ठीय (बाएं पैनल) और dorsolateral (सही पैनल) एक 3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ टीजी (wt1b: GFP) के विचारों ^Li1, टीजी (kdrl: mCherry) 34 HPF पर ^ci5 भ्रूण है, जो interrenal के रिश्तेदार स्थानिक वितरण visualizing की अनुमति देता है ऊतक (आईआर), pronephric glomerulus (पीजी), pronephric नलिकाओं (पीटी), पृष्ठीय महाधमनी (डीए), पार्श्व पृष्ठीयमहाधमनी (झील प्राधिकरण), और पीछे कार्डिनल नस (PCV)। इस स्तर पर interrenal ऊतक के स्थान के कारण, dorsolateral विचारों भ्रूण के दाईं ओर से कर रहे हैं। डी, पृष्ठीय; वी, उदर; एक, पूर्वकाल; पी, पीछे; आर, सही; एल, छोड़ दिया है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2: Vibratome सेक्शनिंग और 3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ टीजी (kdrl: GFP) के आईएचसी विश्लेषण ^s843 भ्रूण। 34-HPF भ्रूण एक 3β-एचएसडी enzymatic गतिविधि परख और फिर vibratome सेक्शनिंग के अधीन था। 3β-एचएसडी गतिविधि पॉजिटिव अनुभाग एफ खरगोश विरोधी मानव fibronectin के साथ डबल आईएचसी से सना हुआ था (n; 1/200) और माउस विरोधी मानव फॉस्फोरिलेटेड फोकल आसंजन काइनेज (pFak; pY397, 1/100)। अनुप्रस्थ अनुभाग interrenal ऊतक (आईआर) और उसके पड़ोसी वाहिकाओं, पृष्ठीय महाधमनी (डीए), पीछे कार्डिनल नस (IRV), और पीछे कार्डिनल नस (PCV) सहित के रिश्तेदार वितरण से पता चलता। NT, न्यूरल ट्यूब; नेकां, पृष्ठदंड; एस, विखंड। स्केल बार 50 माइक्रोन =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

	शेयर एकाग्रता	1,000 μl में	अंतिम एकाग्रता
भाग ए
DMSO		40 μl
DHEA	10 मिलीग्राम / एमएल	10 μl	0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर
NAD	1.2 मिलीग्राम / एमएल	10 μl	12 माइक्रोग्राम / एमएल
भाग बी
PBST		936 μl
विटामिन बी 3	50 मिलीग्राम / मिलीलीटर	2 μl	0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर
एनबीटी	50 मिलीग्राम / मिलीलीटर	2 μl	0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर

तालिका 1: 3β-एचएसडी धुंधला प्रतिक्रिया के अवयव।

Discussion

3β-एचएसडी गतिविधि का संकेत ताकत प्रतिक्रिया के पाठ्यक्रम में वृद्धि हुई। 3β-एचएसडी गतिविधि के स्पष्ट संकेत 28 HPF से आगे के चरणों के लिए प्रतिक्रिया के 4 घंटे बाद पता चला रहे थे। हालांकि, प्रतिक्रिया अवधि परख के उद्देश्य पर निर्भर करता है, अनुभवजन्य दृढ़ संकल्प की आवश्यकता है। मामलों में जहां धुंधला रात भर प्रसंस्करण की आवश्यकता है, एक थोड़ा नीले रंग की पृष्ठभूमि के नमूने पर विकसित करने के लिए जाता है। यह समस्या 3β-एचएसडी गतिविधि धुंधला पहले निर्धारण अवधि (जैसे, आरटी पर 4% PFAT में 4 घंटा) को बढ़ाने के द्वारा दूर किया जा सकता है। ऐसे आरटी पर 4% PFAT के साथ रात भर के लिए फिक्सिंग के रूप में इसके विपरीत, overfixation करके, एक अत्यंत स्पष्ट पृष्ठभूमि की ओर जाता है। हालांकि, लंबे समय के संकेत के एक वांछनीय तीव्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक होगा। हमने देखा है कि नमूने फिक्सिंग के बजाय 2% 4% PFAT के साथ रात भर पहले 3β-एचएसडी गतिविधि धुंधला आमतौर पर बाद में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अवलोकन या मैं में अधिक वांछनीय परिणाम पैदावारकोर्ट विश्लेषण। हालांकि, 4% PFAT के साथ भ्रूण फिक्सिंग 3β-एचएसडी गतिविधि (1 दिन के भीतर पूरा) की एक तेजी से परख की अनुमति देता है और इस तरह interrenal steroidogenic ऊतकों को लक्षित आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीन लाभ होगा।

3β-एचएसडी गतिविधि धुंधला के बाद भ्रूण पोस्ट फिक्सिंग आवश्यक है क्योंकि रासायनिक घटकों की मात्रा का पता लगाने व्यापक धोने के बाद भी दाग ​​नमूनों में जारी रहती जाते हैं और एक लंबे समय तक भंडारण अवधि के बाद उच्च पृष्ठभूमि में नतीजा होगा। हालांकि, आईएचसी विश्लेषण और आगे के लिए, भंडारण 3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ और 4 डिग्री सेल्सियस पर धोया भ्रूण रात भर पृष्ठभूमि का एक महत्त्वपूर्ण वृद्धि में परिणाम नहीं करता अधीन हो सकता है अगर 3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ भ्रूण रहे हैं।

3β-एचएसडी गतिविधि से सना हुआ भ्रूण के स्वस्थानी संकरण (ISH) विश्लेषण में संभव है। उदाहरण के लिए, prox1 टेप की अभिव्यक्ति steroidogen पर 3β-एचएसडी गतिविधि के साथ colocalized हैआईसी ऊतक ^10। Ish के अलावा 3β-एचएसडी गतिविधि धुंधला करने के लिए, भ्रूण दोनों से पहले और 3β-एचएसडी गतिविधि परख के बाद तो यह है कि सेलुलर शाही सेना टेप ISH विश्लेषण के लिए वांछनीय गुणवत्ता के साथ संरक्षित किया जा सकता 4 घंटे के लिए 4% PFAT में तय किया जाना चाहिए।

Ff1b, cyp11a1, hsdb1, और स्टार के riboprobes का उपयोग करके ISH विश्लेषण interrenal steroidogenic ऊतक ^1,2,11 के विकास के अध्ययन में लागू किया गया है। Ff1b की riboprobe, 22 HPF द्वारा मौलिक interrenal कोशिकाओं का पता लगाता है, जबकि cyp11a1 और स्टार के उन 24 HPF द्वारा interrenal फर्क कोशिकाओं का पता लगाने। 3β-एचएसडी histochemical धुंधला है जो केवल 28 HPF के बाद से विभेदित interrenal ऊतकों का पता लगाता है की तुलना में, ईश विश्लेषण दोनों मौलिक और विभेदित interrenal कोशिकाओं में interrenal-विशिष्ट जीन की एक स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, 3β-एचएसडी histochemical धुंधला हासरल, तेजी से, और विभेदित steroidogenic interrenal ऊतक के phenotype विश्लेषण करने के लिए विश्वसनीय होने का लाभ है, और इसलिए विस्तृत विकासात्मक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के साथ ही बड़े पैमाने पर आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीन है। प्रासंगिक साहित्य की हमारी समीक्षा के अनुसार, वहाँ कोई विशिष्ट एंटीबॉडी कि मज़बूती immunohistochemistry के माध्यम से steroidogenic interrenal ऊतक में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगा सकते मौजूद है। इसलिए, 3β-एचएसडी histochemical धुंधला विधि ऊतक और steroidogenic interrenal ऊतक के सेलुलर आकृति विज्ञान की रूपरेखा में विशेष रूप से उपयोगी है।

हालांकि 3β-एचएसडी histochemical धुंधला विभेदित steroidogenic interrenal ऊतक के दृश्य के लिए उपयोगी है, यह सीधे स्टेरॉयड संश्लेषण क्षमता या interrenal कोशिकाओं की कार्यक्षमता की रिपोर्ट नहीं है। म्यूटेशन या रसायन नदी के ऊपर या 3β-एचएसडी के बहाव steroidogenic संश्लेषण झरना में एंजाइमों को प्रभावित नहीं हो सकताजरूरी यह वर्णित विधि के साथ पता लगाया जा क्योंकि वे या तो आकार या interrenal ऊतक की आकृति विज्ञान उपद्रव नहीं हो सकता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ताओं के ध्यान में रखना चाहिए कि समारोह को प्रभावित कुछ एंजाइमी दोष लेकिन interrenal ऊतक के नहीं आकृति विज्ञान आसानी से इस विधि द्वारा नहीं पता लगाया जा सकता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM510
DMSO	Sigma	D8418
Glycerol	USB	US16374
Hyclone Fetal Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073
Nicotinamide	Sigma	N0636
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma	N1636
4-Nitro blue tetrazolium	Promega	S380C
Nusieve GTG	Lonza	50081
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phenylthiourea	Sigma	P7629
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-100Tab
PYREX Spot Plate	Corning	7220-85
Reef Salt	AZOO	AZ28001
trans-Dehydroandrosterone	Sigma	D4000
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vibratome	Leica	VT1000M