Summary
ゼブラフィッシュにおける間腎腺は、哺乳動物の副腎の硬骨魚類の対応です。酵素活性アッセイ、開発ゼブラフィッシュでは、分化ステロイド産生細胞を検出し、このプロトコルは、3-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（3β-HSDΔ5-4イソメラーゼ）を実行する方法を紹介します。
Introduction
副腎、視床下部 - 下垂体 - 副腎軸の重要な要素は、ステロイドを分泌し、ステロイドの恒常性とストレスに対する身体の応答を調整します。副腎は、カテコールアミンを合成するゾーン特異的にステロイドを分泌する外皮質、および内側髄質を含みます。硬骨魚で間腎腺はそれぞれ1-3、哺乳動物における副腎のカウンターパートであり、副腎皮質と髄質の機能的等価物であるステロイド産生腎間の及びクロム親和性細胞から構成されています。ゼブラフィッシュモデルを使用して行われた研究では、両方のステロイド産生およびクロム親和細胞系統が高哺乳類1,2のものと似た分子・細胞メカニズムによって形成されていることを報告しています。したがって、ゼブラフィッシュは、遺伝性疾患、神経内分泌制御、および視床下部 - 下垂体 - 副腎（腎間の）軸のシステム生物学を研究するための潜在的に強力なモデルです。
4,5からのアンドロステンジオンからのプロゲステロンの変換を触媒します。 3β-HSDは、ホルモン、ステロイド、すなわちプロゲステロン、グルココルチコイド、ミネ、アンドロゲン、およびエストロゲンのすべてのクラスを生合成するために不可欠です。 2つのヒト3β-HSDはHSD3B1とHSD3B2を差動6を発現しているアイソザイム。 HSD3B2の副腎皮質および生殖腺で発現されるのに対し、HSD3B1は、胎盤および末梢組織で発現されます。人間HSD3B1とHSD3B2は間腎組織および成体の生殖腺で発現されるゼブラフィッシュhsd3b1の共同オルソログです。ゼブラフィッシュhsd3b2は、その転写産物器官7の前に姿を消す母性発現する遺伝子です。ゼブラフィッシュのための全マウント3β-HSD酵素活性アッセイのプロトコルは、レヴィの方法を変更することによって開発されましたミラノらによって記載さsの。 、8硬骨魚種8の凍結切片上。そのため組織透過性と開発ゼブラフィッシュの光透過性の、ホールマウント3β-HSDの組織化学が正常に固定ゼブラフィッシュの胚および幼生のために使用され、特に区別腎間の組織を描写することができます。
この高感度かつ迅速なアッセイは、腎間の異常形態の異なる種類を実証する種々の変異体とモルファントに適用されています。腎間の3β-HSD活性は間腎組織の仕様はFf1b転写因子の特異的ノックダウンを介して破壊されると腎間の分化がFf1bの補調節因子PROX1 9,10のノックダウンによって影響されるように減少した胚には存在しません。特に、3β-HSD活性は、以下のような片目のピンヘッド 、重度の早期欠陥を有する変異体で検出することができ、どこ3β-H、 目を細めSD組織化学は、腎間の細胞遊走が11をどのように影響されるかを描きます。間腎組織の分化があっても、血液や血管系の完全な不存在下で損なわれることはありません。したがって、内皮由来の信号が整形方法を開発腎間の臓器は12,13を決定することができます。全体として、この組織化学的アッセイは、正常仕様、分化、およびゼブラフィッシュモデルにおけるステロイド産生細胞の遊走を研究するために使用されています。したがって、効率的かつ副腎および腎間の臓器障害をターゲットに任意の遺伝的または化学スクリーンのための信頼性の高いツールであるべきです。
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Protocol
倫理文：ゼブラフィッシュのすべての実験手順は、（。101-12 IRB承認NO）東海大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、承認されたガイドラインに従って実施しました。
3β-HSD酵素活性染色1.株価ソリューション
- トランスデヒドロ[ジメチルスルホキシド（DMSO）中に10mg / mlの]準備します。
- β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（0.1 Mリン酸緩衝液中で1.2 mg / mlで、pHは7.2）を準備します。
- ニコチンアミド調製（ビタミンB3を、50 mg / mlとでH 2 O）。
- 4-ニトロブルーテトラゾリウム（70％ジメチルホルムアミド中に50mg / ml）を準備します。
- -20℃でマイクロチューブとストアに小分けし、これらすべてのコンポーネント。
注：我々の経験では、上記の全てのソリューションのアリコートの凍結融解の繰り返しは、3β-HSD活性染色の強度に影響を与えません。
2. Wホールマウント3β-HSD活性染色
注：3β-HSD酵素活性が早ければ28時間後に受精（HPF）として培養される場合hsd3b1 2,7のmRNA発現の発症と一致している28.5°C、でのゼブラフィッシュの胚で検出可能です。本研究では、全マウント3β-HSD活性染色プロトコルは、前述の方法8に基づいており、最大7日後に受精9に開発ゼブラフィッシュで成功するために決定されました。 ci5 15：14であり、Tg（mCherryをkdrl）を S843：腎間のステロイド産生組織の血管の微小環境を分析するため、ホールマウント3β-HSD活性染色は、Tgが（EGFP kdrlが）などの内皮特異蛍光を発現するトランスジェニック系統、に適用されなければなりません。ゼブラフィッシュ腎臓の開発を検討腎間のステロイド産生組織を分析するために、3β-HSD活性染色はアプリすることができますLI1魚 16、糸球体と前腎細管の形成が描写されている：Tgは（GFP wt1b）にエド。
- 色素形成を阻害するために、12および24 HPFの間に段階から、卵の水中の0.03％のフェニルチオ尿素（脱イオン水中の0.06 mg / Lのリーフ塩）でそれらをインキュベートすることにより、開発ゼブラフィッシュを扱います。
- で一晩、室温（RT）又は（B）の2％PFATで1時間、0.1％のTween 20（PFAT）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で（A）、4％パラホルムアルデヒド（PFA）でdechorionated胚または幼虫を修正4℃または室温で4時間、続いて4℃で2時間、のために。
注意：PFAは、吸入、皮膚接触によって有毒です。それは、皮膚、粘膜、目、および上気道に破壊的です。 - PBSで10分間胚を4倍を洗って、室温で0.1％のTween 20（PBST）を補いました。
注：これは、洗浄溶液を変えながらサンプルを乾燥させないことが重要です。 - たて駅を準備反応の前にining溶液（ 表1）。別々のチューブに、準備渦、および遠心分離器の部品AとB。
注：ストレート1単一のチューブにすべてのコンポーネントを追加すると、重度の沈殿を引き起こすことになります。 - 、パートBのソリューション全体に部品Aのソリューション全体を追加染色液を調製し、よく混ぜ、すぐに固定し、洗浄した胚を含む各マイクロチューブに1ミリリットルを配布します。
- 回転子または室温で穏やかに振盪ためのロッキングプラットフォームのいずれかに光と場所からそれらを保護するためにアルミホイルでマイクロチューブを包みます。
- 経験的には顕微鏡を通して発色性の信号を監視することにより、反応時間を決定します。若干の沈殿は時間をかけて開発します。しかしながら、それらは、反応過程を妨害しません。
注：胚が4時間25℃で28 HPF、染色に固定するために間腎組織でクリア信号を生成します。 - PBSTで10分間の4倍を洗浄することによって反応を停止させます。私Fはさらなる免疫組織化学（IHC）分析が必要とされない、後の修正RTで60分間、4％PFATで染色された胚を。それ以外の場合は、さらに使用するまで4℃で洗浄した胚を保存します。
- 全体のマウント顕微鏡検査のために、染色後固定し、そしてPBS中50％グリセロールで胚を洗浄しクリアし、背側がスライド上に向けて、それらを向けると、明視野照明下で直立顕微鏡を用いて観察します。
注：推奨される腎間の組織形態の高解像度画像は、3β-HSD活性染色とdeyolked胚の分析をフラットマウントにするには。腎間のステロイド産生組織が右卵黄嚢の上方に位置するように、間腎組織の腹側フラットマウント分析は、腎間の形態17の直接的かつ明確に観察できます。
3β-HSD活性染色胚の3 IHC分析
注：steroiの血管の微小環境を分析するためにdogenic組織は、トランスジェニック内皮特異的蛍光レポーターとの3β-HSD活性染色胚をビブラトーム切片化し、その後のIHC分析12,18を横断するために供されます。
- ポスト固定
- 3β-HSD活性染色の後の修正及びPFAは、4℃で1時間、1％トリトンX-100を補った、1％トリトンX-100（PBSTx）を含むPBS中で10分間、4倍の洗浄2％で胚を洗浄RTで。
- 埋め込み
- 4％が95℃、4〜8℃でのマイクロチューブにアリコートし、店舗でPBSでアガロースを溶解させることによって低融点アガロース準備します。
- 70℃で10分間、アガロース4％低融点のアリコートを融解し、その後47℃で一定分量を保ちます。各胚を埋め込む溶融4％鋳型として働く1.5mlマイクロチューブの取り外したキャップ内に低融点アガロース、および固体になるまで冷却します。
- ビブラトームセクショニング
- 乾燥Pに紙テープの一部をスティックビブラトームのlatform。
- カミソリの刃によって金型から硬化アガロースブロックを削除してください。プラットフォーム上の紙テープに瞬間接着剤を適用し、上向きにサンプルの前方側に、紙テープにアガロースブロックを修正。それぞれ約4ミリメートルと上下ファセットの各側に8ミリメートルで、台形プリズム形状にアガロースブロックをトリム。
- スポイトを使用して、0.5％トリトンX-100（0.5％PBSTx）を補充し、冷PBSでサンプルを含むアガロースブロックをすすぎます。
- ビブラトームの取扱説明書に従って、100μmの切片にアガロースブロックをスライス。常に乾燥を防ぐために、アガロースブロックをすすぎます。各スライスが切断されると、26 G注射針を使用して、ビブラトームからそれを削除し、冷たい0.5％PBSTx（500μL/ウェル）を含むスポットプレートに移します。
- 解剖顕微鏡下で確認することにより、3β-HSD活性の陽性組織切片を収集し、πによってセクションを転送冷たい0.5％PBSTx（150μL/ウェル）を含む96ウェルプレートにその端のカットオフ（開口部で約1ミリメートル、内径）とのpetteチップ。組織試料は、通常、このステップの後、アガロースブロックから解離します。
- 透過処理と洗浄
- 6X RTで0.5％PBSTxで15分間、PBS中で10分間、そしてPBS中で10分間、4倍のスライスを洗浄し、1％ウシ血清アルブミン/ 1％DMSO / 0.1％トリトンX-100（PBDTx）を補充しました。
- ブロッキング
- RTでPBDTx 2％ウシ胎児血清（FCS）中で1時間切片をインキュベートします。
- 一次抗体反応
- 4℃で一次抗体（ 例えば 、ウサギポリクローナル抗ヒトフィブロネクチンおよびマウス抗ヒト焦点接着キナーゼ）を含むPBDTxで1.5日間のスライスをインキュベートします。
- 洗浄
- スライスはRTでPBDTxで10分間、6倍速洗います。
- ブロッキング
- PBで2％FCSで1時間のスライスをインキュベートRTでDTX。
- 二次抗体反応
- 4℃での二次抗体（フルオロフォア結合ヤギ抗ウサギまたは抗マウスIgG）を含むPBDTxで1.5日間切片をインキュベートします。
- 洗浄
- 切片を室温でPBST中で10分間、RTおよび4倍でPBDTxで10分間、6倍洗います。
注：共焦点顕微鏡分析のために、PBS中50％グリセロールでサンプルをオフにします。
- 切片を室温でPBST中で10分間、RTおよび4倍でPBDTxで10分間、6倍洗います。
4.共焦点分析
- 全体のマウント胚および10X / 0.5および20X / 0.75の対物レンズを搭載した共焦点顕微鏡により断面を観察します。
- 次のように蛍光および3β-HSD染色の同時検出のために、マルチトラックモードを設定：488 nmのアルゴンレーザーとGFPの検出のための505から530 nmのバンドパスフィルタと、 543 nmのヘリウム - ネオンレーザーおよびmCherryを検出するための560から615 nmのバンドパスフィルター。そして、3β-HSD染色の検出のための光チャネルを送信しました。ピンホールのサイズは、1 Airey単位であり、解像度は1,024×1024画素です。
- 3D投影として（6μmの間隔で）のzスタックを組み立て、そして内蔵の共焦点ソフトウェアを使用することにより、突起と明視野をマージします。
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Representative Results
34 HPFでci5胚 ：Tgは（mCherryをkdrl）; LI1：前腎腎臓糸球体とその新生血管系とステロイド合成間腎組織のcodevelopsは、3β-HSD酵素活性アッセイは、二重トランスジェニックTgは（GFP wt1b）で行った方法を決定するために、 （ 図1）。いくつかのステロイド産生細胞が正中線を横切って移行を開始し、背側のビューから突出したエッジを形成するのに対し、この段階では、3β-HSD活性陽性のステロイド産生組織は右正中線に位置しており、前腎腎臓の糸球体のすぐ尾。ステロイド産生組織は密接に背側大動脈（DA）と後部主静脈（PCV）と関連しています。
Tgは（kdrl：GFP）での3β-HSD酵素活性アッセイS843胚はDA、PCVを含め、周囲の腎間の血管の明確な描写を可能にしました、および腎間の容器（IRV; 図2）。 3β-HSD活性染色胚のビブラトーム切片は、焦点接着キナーゼリン酸化の細胞外マトリックスタンパク質、フィブロネクチンおよびその下流のエフェクターを検出するためのIHC分析に供しました。フィブロネクチンの周囲-DAの堆積は、IRVの成長18を支えるために不可欠です。
図1： 蛍光レポーターを発現するゼブラフィッシュで行わ3β-HSD活性染色を全マウント。腎間のの相対的な空間分布を可視化することができます34 HPF、でci5胚 ：Tgは（mCherryをkdrl）; LI1：3β-HSD活性染色のTg（GFP wt1b）の背側（左パネル）および背側（右パネル）のビュー組織（IR）、前腎糸球体（PG）、前腎細管（PT）、背側大動脈（DA）、横方向の背大動脈（LDA）、および後方主静脈（PCV）。これ段階で間腎組織の場所に、背外側ビューは、胚の右側からです。 D、背側; V、腹側; 、前方; P、後部; R、右; L、左。 =50μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： ビブラトームは切片と3β-HSD活性染色 のTg（kdrl：GFP） のIHC分析 S843 胚 。 34-HPFの胚は、3β-HSD酵素活性アッセイ、次にビブラトーム切片を行いました。 3β-HSD活性陽性のセクションは、F（ウサギ抗ヒトフィブロネクチンでダブルIHCによって染色しましたnは、 1/200）およびマウス抗ヒトリン酸化焦点接着キナーゼ（pFak; pY397、1/100）。横断面は、背側大動脈（DA）、後部主静脈（IRV）、および後方主静脈（PCV）を含む間腎組織（IR）およびその周辺の血管の相対的な分布を示しています。 NT、神経管; NC、脊索。 S、体節。 =50μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| ストック濃度 | 千μlの | 最終濃度 | |
| パートA. | |||
| DMSO | 40μlの | ||
| DHEA | 10 mg / mlで | 10μlの | 0.1mg / mlの |
| NAD | 1.2 mg / mlで | 10μlの | 12 / mlの |
| パートB. | |||
| PBST | 936μlの | ||
| ビタミンB3 | 50 mg / mlで | 2μlの | 0.1mg / mlの |
| NBT | 50 mg / mlで | 2μlの | 0.1mg / mlの |
表1：3β-HSD染色反応の成分。
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Discussion
3β-HSD活性の信号強度は、反応の過程にわたって増加しました。 3β-HSD活性のクリア信号が以降28 HPFからの段階のための反応の4時間後に検出されました。しかしながら、反応時間は、アッセイの目的に応じて、経験的な決意を必要とします。染色は一晩処理を必要とする場合には、わずかに青みがかった背景には、サンプル上で開発する傾向があります。この問題は、3β-HSDの活性染色の前に固定期間（ 例えば 、室温で4％のPFATで4時間）を増加させることによって克服することができます。これとは対照的に、このようなRTで4％PFATで一晩固定などoverfixationは、非常に明確な背景につながります。しかし、より長い時間は、信号の望ましい強さを得るために必要とされるであろう。私たちは、3β-HSD活性染色は、一般的に、その後の蛍光レポーター観察またはIでより望ましい結果をもたらす前に、2％ではなく4％PFATで一晩サンプルを固定していることに気づきましたHC分析。しかし、4％PFATで胚を固定する（1日以内に完了）3β-HSD活性の迅速なアッセイを可能にし、したがって、腎間のステロイド産生組織を標的に遺伝的または化学的な画面に利益をもたらします。
化学成分の微量でも広範に洗浄した後、染色したサンプルに固執する傾向があり、長い貯蔵期間の後に高いバックグラウンドをもたらすため、3β-HSD活性染色が不可欠である後の胚を定着後。しかし、場合3β-HSD活性染色胚を4℃での3β-HSD活性染色と洗浄胚は一晩背景の顕著な増強を生じない保存、IHC分析を促進するために供されるべきです。
3β-HSD活性染色胚のインサイチュハイブリダイゼーション（ISH）分析では可能です。例えば、PROX1転写産物の発現はsteroidogenで3β-HSD活性と共局在されますIC組織10。細胞RNA転写物はISH解析のための望ましい品質で保存することができるように、ISHに加えて、3β-HSD活性染色を行うために、胚は、3β-HSD活性アッセイの前と後の両方で4時間、4％のPFATで修正される必要があります。
ff1b、cyp11a1、hsdb1、 星のリボプローブを使用してISH分析は、腎間のステロイド産生組織1,2,11の発達研究に適用されています。 cyp11a1とスターのものは24 HPFにより腎間の細胞を分化検出しながらff1bのリボプローブは、22 HPFによって始原腎間の細胞を検出します。わずか28 HPF以降から分化した腎間の組織を検出3β-HSD組織化学染色と比較して、ISH分析は、両方の原始と分化した腎間の細胞における腎間の特異的遺伝子のスペクトルを分析するために使用することができます。それにもかかわらず、3β-HSD組織化学染色ヘクタール分化したステロイド産生間腎組織の表現型を分析するための、簡単、迅速、かつ信頼性のあることの利点は、Sので、その詳細な発達の研究だけでなく、大規模な遺伝的または化学スクリーンのための強力なツールです。関連文献の我々のレビューごとに、確実に免疫組織化学を介してステロイド産間腎組織でのタンパク質の発現を検出することができない特異的な抗体が存在しません。したがって、3β-HSD組織化学染色法は、組織とステロイド産生間腎組織の細胞形態を描写する際に特に有用です。
3β-HSD組織化学染色は、分化ステロイド合成間腎組織の可視化のために有用であるが、それは直接ステロイド合成機能や腎間の細胞の機能性を報告しません。ステロイド産生合成カスケードの上流または下流の3β-HSDの酵素に影響を与える変異または化学物質がないかもしれません彼らは、サイズや間腎組織の形態のいずれかを混乱してもしなくてもよいので、必ずしも、この記載された方法を用いて検出すること。したがって、このプロトコルのユーザーが間腎組織の形態を機能に影響を与えることなく、特定の酵素の障害がこの方法によって容易に検出されない可能性があることを念頭に置く必要があります。
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Acknowledgments
LI1及びTg（kdrl：EGFP）S843：私たちは、Tgは（GFP wt1b）を贈与するための教授クリストフEnglert教授ディディエStainierに感謝します それぞれの株、及びTg（kdrl：mCherryを）提供するための台湾ゼブラフィッシュ基盤施設ci5を 。この研究は102-、科学技術（96から2628-B-029から002-MY3、101から2313-B-029から001まで、102から2628-B-029から002-MY3の台湾省からの助成金によってサポートされていました2321-B-400から018）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
- Liu, Y. W.
- Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
- Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
- Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
- Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
- Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
- Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
- Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
- Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
- Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
- Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).
