Summary
ويمكن استخدام متعدد المناعية مضان المناعية لتقييم عدد والتوزيع النسبي، وتوطين السكان الخلايا المناعية في المكروية الورم. تصف هذه المخطوطة استخدام هذه التقنية لتحليل المجموعات الفرعية من الخلايا التائية في سرطان البلعوم.
Abstract
تقنية مضان أربعة ألوان مضان (إهك) هي طريقة لقياس السكان الخلية من الفائدة مع الأخذ بعين الاعتبار توزيعها النسبي وتوطينها في الأنسجة. وقد تم تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة التسلل المناعي في مختلف أنواع الورم. يتم تسلل المكروية الورم بواسطة الخلايا المناعية التي تنجذب إلى موقع الورم. وقد تم العثور على مختلف السكان الخلايا المناعية للعب أدوارا مختلفة في المكروية الورم ويكون لها تأثير مختلف على نتائج المرض. تصف هذه المخطوطة استخدام مضان متعدد الأوجه إهك على سرطان الخلايا الحرشفية البلعوم (أوبسك) كمثال على ذلك. ويمكن تمديد هذه التقنية إلى عينات الأنسجة الأخرى وأنواع الخلايا من الفائدة. في الدراسة المقدمة، قمنا بتحليل المقصورة داخل الظهارية و اللحمية من مجموعة أبسك كبيرة (ن = 162). ركزنا على مجموع الخلايا الليمفاوية T (CD3 + )، منظم مناعةأوري T الخلايا (Tregs، أي FoxP3 +)، والخلايا التائية المساعدة 17 (Th17) (أي، IL-17 + CD3 +) باستخدام مباين النووية للتمييز ظهارة الورم من سدى. تم العثور على عدد كبير من الخلايا التائية لتكون مرتبطة مع تحسن البقاء على قيد الحياة خالية من الأمراض في المرضى الذين يعانون من عدد قليل من الخلايا إنتيرومورال إيل-17 + غير T. هذا يشير إلى أن إيل-17 + الخلايا غير T قد تكون مرتبطة مع استجابة مناعية ضعيفة في أوبسك، والذي يتفق مع الارتباط الموصوف بين إيل-17 وضعف البقاء على قيد الحياة في مرضى السرطان. حاليا، ويجري تطوير تقنيات متعددة إهك مضان متعدد المسارات إهك باستخدام ما يصل إلى 7 فلوروكروميس مختلفة وسوف تمكن توصيف أكثر دقة وتوطين الخلايا المناعية في المكروية الورم.
Introduction
سرطان الخلايا الحرشفية البلعومية (أوبسكس) هي مجموعة غير متجانسة من سرطانات الخلايا الحرشفية التي تنشأ في البلعوم. عوامل الخطر ل أوبسك تشمل فيروس الورم الحليمي البشري (فيروس الورم الحليمي البشري) والكحول والتبغ استخدام 1 ، 2 . دور الاستجابة المناعية وكيفية استخدام هذا في الإعداد السريري هو مجرد بداية لاستكشافها. يتم تسلل المكروية الورم من قبل الخلايا المناعية التي تنجذب إلى موقع السرطان. على الرغم من أن ارتفاع CD8 + السامة للخلايا T- تردد الخلية قد ارتبط مع تحسين البقاء على قيد الحياة في المرضى أوبسك 3 ، ودور مجموعات فرعية أخرى الخلايا التائية، بما في ذلك خلايا تريجس و TH17، لا يزال غير واضح 4 . في حين أن من المفترض أن TH1 و Th17 الخلايا للمساعدة في الاستجابة المناعية التي تستهدف الخلايا السرطانية، تريجس معروفة جيدا لقدراتهم لقمع نشاط الخلايا التائية الأخرى 5 . ومع ذلك، فإن وجود Tتم العثور على السجلات التي ترتبط مع كل من ردود مواتية وغير مواتية في أنواع ورم مختلفة 6 . وبما أن جميع الخلايا المناعية الموجودة في الدم لا تسلل الورم إلى نفس الدرجة، فإن دراسة المكروية المحلية للورم توفر المقياس الأكثر موثوقية للاستجابة المناعية الموجهة ضد الورم. والهدف من هذه الدراسة هو تحديد العلاقة بين أعداد وأنواع الخلايا المناعية والنتيجة السريرية. استخدمنا أربعة ألوان التصوير إهك مضان لتحليل عدد وتوطين مختلف المجموعات السكانية T- الخلية في أوبسك الإنسان.
ركزنا على مجموع الخلايا الليمفاوية التائية (CD3 + )، والخلايا TH17، ومناعة الثعلب FoxP3 + تريجس، الذي يرتبط مسار التمايز ارتباطا وثيقا بخلايا TH17. وتتميز خلايا TH17 من خلال الجمع بين CD3 و إيل-17. ويمكن أيضا أن تنتج السيتوكين إيل-17 من قبل الخلايا غير T- 7 . قررنا توزيع داخل الحلقةوالخلايا التائية الحلزونية والانسجة، تريجس، Th17، و إيل-17 + الخلايا غير التائية في سلسلة كبيرة من الحالات أوبسك وتحليل الارتباطات مع بقاء المريض. تم استخدام مضان متعدد الألوان إهك لتحديد التعبير عن CD3، Foxp3، و إيل-17، في تركيبة مع دابير كونترستين. يسمح هذا الفحص لتحديد سهل وواضح من كل من الخلايا السرطانية (باستخدام دابي تلطيخ النووية) وتسلل السكان الخلايا التائية (باستخدام مزيج من علامات مختلفة). بعد إعداد العينة وتلطيخ، تم استخدام المجهر الفلورسنت وبرامج التصوير لفصل الألوان الفلورية المختلفة المستخدمة وتحديد عدد ونوع الخلايا الموجودة في كل من ظهارة الورم والورم المرتبطة سدى.
فحص بديل لتحديد والنمط الظاهري السكان الخلايا المناعية هو تحليل التدفق الخلوي، أو الخلوي من وقت تحليل الرحلة (سيتوف)، من الورم أو العينات الطرفية ( أي الدم أو استسقاء). باستخدام هذاتقنية، يتم فقدان جميع المعلومات حول التعريب والتوزيع النسبي لأنواع الخلايا المختلفة. استخدام وتحليل العينات الطرفية أيضا لا توفر معلومات حول الخلايا التي هي قادرة على التسلل المكروية الورم. وقد أظهرت التحاليل الدم والاستسقاء المناعة المناعية لا تعكس النمط الظاهري وتواتر تسلل الخلايا المناعية للأنسجة الورم 8 ، 9 .
بديل آخر هو استخدام المجهر مشرق الميدان. ميزة هذه التقنية على التصوير مضان هو عدم وجود تألق الأنسجة. على الرغم من أن بعض العينات تحتوي على مزيد من التألق الذاتي، وخاصة الكريات الحمراء، ولكن أيضا أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك المحببة العدلات، ويمكن بسهولة إزالة هذه المناطق في تحليل جميع العينات تقريبا. يوفر المناعي ميزة تحليل علامات متعددة في عينة واحدة باستخدام لوحة من الفلور المستهدفةنت الطول الموجي. هذا مستحيل في الوقت الراهن إلى نفس المدى للمجهر الميدان مشرق نظرا لعدم وجود عدد كاف من التسميات والأنماط النمط المضاد المتاحة تجاريا لمستضد معين.
وقد استخدمت تقنية إهك مضان متعدد الألوان وصفها هنا في العديد من أنواع السرطان المختلفة ومجموعات الأجسام المضادة لدراسة مختلف السكان الخلايا المناعية، فضلا عن الجزيئات السرطانية أعرب عن الورم، مثل مستضدات الكريات البيض البشرية (هلا) و بد-L1 10 ، 11 ، 12 - وقد تم إنشاء بروتوكول والتحقق من صحتها باستخدام العديد من أنواع مختلفة من العينات والأجسام المضادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم التعامل مع عينات المرضى وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية الطبية الموصوفة في مدونة قواعد السلوك للاستخدام الثانوي المناسب للنسيج البشري للاتحاد الهولندي للجمعيات العلمية الطبية الحيوية (www.federa.org).
1. إعداد الشرائح
- الحصول على المواد الأنسجة المقطوعة (أي نوع من الأنسجة) من قسم علم الأمراض بعد الحصول على إذن لجنة أخلاقية الطبية لاستخدام المواد المقطوعة.
ملاحظة: للحصول على التجربة الحالية، تم الحصول على عينات الورم المعالجة من أورام البلعوم الأولية التي تم تشخيصها في المركز الطبي لجامعة ليدن، ليدن، هولندا بين 1970 و 2011، تم اختيارها كما هو موضح سابقا (ن = 162) 13 . كان حجم الأنسجة محدودة فقط من قبل شرط لكمية كافية من أنسجة الورم لالتقاط موثوق 4 الصور المجهرية داخل الورم. - إصلاح الأنسجة في 4٪ الفورمالين مخزنة لمدة لا تقل عن 12 ساعة. يذوى الأنسجة في أغسلسلة راد من الإيثانول. غسله في الزيلين وتضمينها في شمع البارافين باستخدام معالج الأنسجة الآلي.
- قطع 4 ميكرون سميكة الفورمالين ثابتة، والأقسام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين (فب) على الشرائح الزجاجية باستخدام مشراح. وضع كتلة الأنسجة في حامل الأنسجة ميكروتون باستخدام الإجراءات القياسية.
- قطع شرائط من الأنسجة ووضعها على سطح حمام مائي يحتوي على الماء منزوع الأيونات في 45 درجة مئوية. استخدام شريحة مناسبة ل تلطيخ المناعية للأسماك خارج القسم عن طريق وضع الشريحة في الماء مباشرة تحت القسم. حرك بعناية الشريحة لأعلى في زاوية، أخذ القسم من الماء والتمسك بها على الشريحة.
- السماح للشرائح الجافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- ديبارافينيز الشرائح فب عن طريق غمر لهم تماما في الزيلين الطازجة 100٪، ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. ترطيب الشرائح عن طريق غمرها مرتين في الايثانول 100٪ جديدة، و 70٪ من الإيثانول، و 50٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق كل.
2. إجراء استرجاع أنتيجن
- غسل الشرائح في الماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
- سخن حمض تريس إثيلينديامينيتتراراسيتيك (إدتا) العازلة (10 ملي تريس زائد 1 ملي إدتا، ودرجة الحموضة 9.0) لغليان درجة الحرارة باستخدام الميكروويف. إجراء استرجاع مستضد عن طريق غمر الشرائح في المخزن المؤقت إدتا مسخن والحفاظ على المخزن المؤقت في هذه درجة الحرارة لمدة 10 دقيقة في الميكروويف.
مالحظة: يمكن استخدام أي ميكرويف بقوة 900 واط. - السماح للشرائح يبرد في المخزن المؤقت لمدة 2 ساعة.
3. وصمة عار الأنسجة الشرائح
- غسل الشرائح مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- رسم دائرة حول الأنسجة مع القلم مسعور لمنع الأجسام المضادة المخففة من الانسكاب قبالة الشريحة. يغسل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني. هذا هو اختياري.
- احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية (مكافحة CD3 1:50، ومكافحة فوكس 3: 200، ومكافحة إيل-17 1:50) المخفف في 1٪ ث / V مصل الأبقارلبومين (بسا) في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: حجم لكل شريحة يعتمد على حجم الأنسجة، ولكن هو عادة 50-150 ميكرولتر. استبدال الأجسام المضادة الأولية مع الأجسام المضادة من نفس الفئة إيسوتيب مع خصوصية غير معروفة لشرائح التحكم السلبية في التخفيف نفسه كما CD3، CD8، و FoxP3 الأجسام المضادة ( أي الأجسام المضادة السيطرة إيزوتيب الأرنب، الماوس IgG1 إيزوتيب الأجسام المضادة السيطرة، والماعز [إيغوتيب] [إيسوتيب] [أنتيبودي]). - غسل الشرائح ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- احتضان الأنسجة مع مزيج من فلورزنتلي المسمى الأجسام المضادة الثانوية التي تستهدف الأنواع الأجسام المضادة الأولية و / أو النمط المعياري ( أي 1: 200 حمار المضادة للماعز مفتش اليكسا 488، حمار المضادة للأرنب مفتش A546، والحمار المضادة للماوس A647) المخفف في 1٪ بسا في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: حجم لكل شريحة يعتمد على حجم الأنسجة ولكن عادة 50-150 ميكرولتر.- بعدمضيفا الأجسام المضادة الثانوية، والحفاظ على الشرائح المحمية من الضوء قدر الإمكان من خلال تخزينها في مربع مظلم أو عن طريق التفاف مربع في رقائق الألومنيوم.
4. جبل و كونتيرستين الشرائح الأنسجة
- غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- جبل الشرائح باستخدام مائي المضادة للتلاشى المتوسطة تصاعد تحتوي على كونترستين النووي (على سبيل المثال، دابي). تحليل الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت في أقرب وقت ممكن (في غضون أسبوعين). تخزين الشرائح في الظلام في 4 درجات مئوية حتى التحليل.
5. تحليل الملون الشرائح الأنسجة
- الحصول على أربع صور من كل شريحة باستخدام المجهر مضان مجهزة 20 - 25X الهدف. التقاط الصور في مواقع عشوائية في جميع أنحاء منطقة الورم الكلي المدرجة في الشريحة لالتقاط جزء ممثل من الورم.
ملاحظة: ينبغي استخدام التكبير القياسي 250X. أي الفلورسنت سr المجهر الضوئي ليزر يمكن استخدامها، شريطة أن يكون المرشحات والليزر اللازمة لتصور فلوروكروميس المستخدمة.- لتصور اليكسا 488، استخدم الحد الأقصى الإثارة من 490 والحد الأقصى للانبعاثات من 525؛ لتصور اليكسا 546، واستخدام الحد الأقصى الإثارة من 556 والحد الأقصى للانبعاثات من 573؛ لتصور اليكسا 647، استخدام أقصى الإثارة 650 و الحد الأقصى للانبعاثات من 665؛ والتصور من دابي، واستخدام أقصى الإثارة من 358 والحد الأقصى للانبعاثات من 461.
- حفظ الصور كملفات الصور ( أي جبيغ و تيف) في البرنامج المتاح للمستخدم.
- التمييز بين ظهارة الورم والمناطق سدى الورم على أساس الأشكال النووية والخلوية من الخلايا الظهارية الورم مقابل انسجة بعد استشارة الطبيب الشرعي.
- لتحديد مجموع مساحة سطح اللحمية، رسم خط حول جميع المناطق (ق) المحتلة من قبل الخلايا اللحمية (بدلا من الخلايا السرطانية) و ريكورد مساحة السطح باستخدام برنامج تحليل الصور المقدمة من قبل الشركة المصنعة المجهر.
- انقر على علامة التبويب "تراكب" أسفل الصورة؛ اختر شكل "مغلق بولي الخط" وانقر على ذلك. ترسيم الحدود بين الحقول الظهارية الورم والانسجة عن طريق النقر حول المنطقة حتى الوصول إلى النقطة الأولى مرة أخرى ؛؛ وهذا يوفر مقياسا لتلك المنطقة.
ملاحظة: بمجرد إغلاق الشكل، سيظهر رقم بجانب الشكل الذي يطوق مساحة السطح للصورة المحددة (A = x ميكرون 2 ).
- انقر على علامة التبويب "تراكب" أسفل الصورة؛ اختر شكل "مغلق بولي الخط" وانقر على ذلك. ترسيم الحدود بين الحقول الظهارية الورم والانسجة عن طريق النقر حول المنطقة حتى الوصول إلى النقطة الأولى مرة أخرى ؛؛ وهذا يوفر مقياسا لتلك المنطقة.
- اطرح مساحة السطح هذه من المساحة الكلية للصورة (المتوفرة في خصائص الصورة) لحساب مساحة السطح الظهارية. استبعاد الأوعية الدموية، نخرية، والمناطق أوتوفلورسنت عن طريق رسم خط حولهم، وتسجيل حجم المنطقة المقدمة وطرح ذلك من منطقة السطح الظهارية.
- حفظ جميع أرقام المساحة في ملف جدول بيانات لحساب متوسط المساحة السطحية وأرقام الخلايا لكل شريحة.
- باستخدام برنامج تحليل الصور، وتحديد ما إذا كانت الخلايا واحدة، مزدوجة، أو ثلاثية إيجابية عن طريق التحقق من مضان من جميع القنوات الأربع.
- عد الخلايا مفردة، مزدوجة، وثلاثي إيجابية في كل صورة باستخدام إيماجيج.
- تحميل إيماجيج. فتح صورة من خلال النقر على "ملف" و "فتح" واختيار الصورة التي سيتم تحليلها. انقر بزر الماوس الأيمن على "أداة نقطة" (مربع أحمر في منتصف أربعة أسطر) وحدد "أداة متعددة النقاط". انقر نقرا مزدوجا فوق "أداة متعددة النقاط" وقم بحساب عدد أنواع الخلايا المختلفة في الصورة عن طريق تحديد رقم عداد مختلف لكل نوع من الخلايا.
ملاحظة: عد جميع الخلايا من كل نوع خلية مختلفة، كما هو محدد من قبل وجود واحد أو اثنين أو كل ثلاثة ألوان الفلورسنت. استبعاد دابي، كما أن هذا كونترستين النووية موجودة في جميع الخلايا ويستخدم للتمييز الخلايا السرطانية من الخلايا المناعية. يتم حساب كل نوع من الخلاياباستخدام رقم عداد مختلف. عد أعداد الخلايا من كل نوع من الخلايا بشكل منفصل في المناطق الظهارية الورم والسدود عن طريق اختيار رقم عداد مختلفة في كل مرة. لا تحسب الخلايا داخل الأوعية الدموية والمناطق أوتوفلورزنت إلى حد كبير. - سجل عدد الخلايا التي تم تحليلها في كل صندوق عداد لكل صورة في ملف جدول بيانات.
- تقسيم العدد الإجمالي للخلايا لكل نوع من الخلايا على مساحة السطح الكلي للظهارة الورم ورم سدى تحليلها.
- تحميل إيماجيج. فتح صورة من خلال النقر على "ملف" و "فتح" واختيار الصورة التي سيتم تحليلها. انقر بزر الماوس الأيمن على "أداة نقطة" (مربع أحمر في منتصف أربعة أسطر) وحدد "أداة متعددة النقاط". انقر نقرا مزدوجا فوق "أداة متعددة النقاط" وقم بحساب عدد أنواع الخلايا المختلفة في الصورة عن طريق تحديد رقم عداد مختلف لكل نوع من الخلايا.
- عد الخلايا مفردة، مزدوجة، وثلاثي إيجابية في كل صورة باستخدام إيماجيج.
- لتحديد مجموع مساحة سطح اللحمية، رسم خط حول جميع المناطق (ق) المحتلة من قبل الخلايا اللحمية (بدلا من الخلايا السرطانية) و ريكورد مساحة السطح باستخدام برنامج تحليل الصور المقدمة من قبل الشركة المصنعة المجهر.
6 - التحليل الإحصائي
ملاحظة: ينبغي مناقشة جميع التحليلات الإحصائية مع إحصائي لضمان جودة البيانات. للإحصاءات العامة، استخدم أي دليل للإحصاءات الطبية 14 .
- اختبار الارتباطات بين ترددات الخلية باستخدام اختبار سبيرمان الرتب ارتباط رو.
- اختبار الاختلافات الإحصائية في أعداد سل إيجابيلس بين مجموعات المرضى باستخدام اختبار ويلكوكسون مان ويتني.
- اختبار الارتباطات بين أعداد الخلايا والبقاء على قيد الحياة خالية من المرض ( أي الوقت من التشخيص حتى تكرار المحلية أو البعيدة من الموت أو المرض) عن طريق تقسيم المرضى في مجموعات على أساس عدد قطع من الخلايا باستخدام جيل منحنى كابلان-مير وسجل تحليل الرتب 15 .
- إجراء تحليلات متعددة المتغيرات باستخدام كوكس تحليل الانحدار الخطر النسبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تلطيخ سلسلة من عينات الورم العلاجية فب التي تم الحصول عليها من أورام البلعوم الأولية التي تم تشخيصها في المركز الطبي لجامعة ليدن، ليدن، هولندا بين عامي 1970 و 2011، كما تم وصفها من قبل (ن = 162) باستخدام البروتوكول الموصوف 13 . تم تحليل واحد إلى أربعة صور عشوائية من كل شريحة ( الشكل 1 ). يشار إلى بعض الخلايا أوتوفلورزنت، والتي يمكن تمييزها بوضوح من خلال مظهرها الأصفر الكامل. الخلايا حقا مزدوجة أو ثلاثية الإيجابي فقط وصمة عار إيجابية لجسم مضاد معين في التعريب المتوقع، والذي هو في غشاء الخلية أو النواة، في هذه الحالة. لم الشرائح السيطرة السلبية لا تظهر أي تلطيخ محددة فوق الخلفية أوتوفلورزنس الأنسجة ( الشكل 2 والشكل 4 )، مؤكدا أن كل إشارة محددة للأهداف المعترف بها من قبل الابتدائيالأجسام المضادة. تم العثور على جميع العينات الورم أن تسلل من قبل خلايا CD3 + T إلى مستويات مختلفة. وأعرب فوكس + 3 تريجس دائما CD3 وكانت واحدة من تسلل الرئيسية خلايا الخلايا التائية. الخلايا CD3 معربا عن إيل-17 (خلايا TH17) كانت مجموعة صغيرة من الخلايا التائية المتسللة. إيل-17 التي أعرب عنها CD3 - كانت خلايا وفرة أخرى تسلل السكان الخلية. خلايا إيل + 17 + FoxP3 + لا تحتوي على أكثر من 0.01٪ من كافة خلايا + FoxP3.
وكانت جميع الاختبارات الإحصائية من جانبين، وكانت قيم P أقل من 0.05 تعتبر كبيرة 14 . يتم عرض الارتباطات بين داخل الخلايا الظهارية أو مجموع عدد الخلايا والبقاء على قيد الحياة، وذلك لأن الارتباطات بين انسجة أو إجمالي عدد الخلايا وبقاء المريض كانت مماثلة. وأظهر عدد كبير من التسلل الكلي خلايا CD3 + T اتجاها نحو الارتباط مع تحسين البقاء خالية من الأمراض (0.086، الشكل 5A ) بالمقارنة مع عدد قليل من الخلايا التائية ( أي أدنى ربع). عندما درس على وجه التحديد المرضى الذين يعانون من عدد قليل من الخلايا إيل-17 + ، كان هناك عدد كبير من مجموع الخلايا التسلل T مرتبطة مع البقاء على قيد الحياة خالية من الأمراض (ع = 0.012، الشكل 5B ). فقد أثر النذير الخلايا T-التسلل ورم في مجموعة من المرضى الذين يعانون من ارتفاع عدد خلايا IL-17 +-التسلل الورم (لا تظهر البيانات). وبالتالي، فإن تأثير الخلايا التائية تسلل الورم في أوبسك قد تكون ذات صلة إلى انخفاض عدد إيل-17 + الخلايا الحالية.
الشكل 1: فب أورفرينجيل سرطان الأنسجة ملطخة أربعة ألوان مضان إهك. صورة ممثل من وصمة عار إمونوفلورسنت ل CD3 ( A ، الأحمر)، إيل-17 ( B أونغ>، الأخضر)، و FoxP3 ( C ، الأزرق)، فضلا عن صورة مدمجة جنبا إلى جنب مع دابي (الرمادي) ( D ). يشار إلى اثنين من الخلايا أوتوفلورزنت من قبل الأسهم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: السيطرة السلبية ل CD3. صورة ممثل فب الأنسجة سرطان البلعوم، ملطخة كما هو موضح في البروتوكول، واستبدال الأجسام المضادة لمكافحة CD3 مع الأجسام المضادة السيطرة إيزوتيب الأرنب إغ مع خصوصية غير معروفة. لا تلطيخ للأرنب إيغ ( A ، الأحمر) جنبا إلى جنب مع تلطيخ ل إيل-17 ( B ، الأخضر)، FoxP3 ( C ، الأزرق)، و دابي ( D ، الرمادي) هو مبين.2large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: السيطرة السلبية لل إيل-17. صورة تمثيلية من فب الأنسجة سرطان البلعوم، ملطخة كما هو موضح في البروتوكول، واستبدال الأجسام المضادة المضادة إيل-17 مع الأجسام المضادة السيطرة إيز إيزوتيب مع خصوصية غير معروفة. لا تلطيخ لماعز إيغ ( B ، الأخضر) جنبا إلى جنب مع تلطيخ ل CD3 ( A ، الأحمر)، FoxP3 ( C ، الأزرق)، و دابي ( D ، رمادي) هو مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Fإيغور 4: السيطرة السلبية ل FoxP3. صورة تمثيلية من فب الأنسجة سرطان البلعوم، ملطخة كما هو موضح في البروتوكول، واستبدال الأجسام المضادة لمكافحة FoxP3 مع الأجسام المضادة الماوس IgG1 السيطرة على النمط النظري مع خصوصية غير معروفة. لا تلطيخ للماوس IgG1 ( C ، الأزرق) جنبا إلى جنب مع تلطيخ ل CD3 ( A ، الأحمر)، إيل-17 ( B ، الأخضر)، و دابي ( D ، رمادي) هو مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: منحنيات كابلان-ماير. بالنسبة للمرضى الذين يعانون من عدد أقل من المتوسط من خلايا إيل-17 + / مم 2 ، تظهر منحنيات البقاء على قيد الحياة خالية من الأمراض على مستوى منخفض جدا ( أي أدنى ربع) مقابل عدد كبير من توتا( A )، وانخفاض ( أي أقل من المتوسط) مقابل العدد المرتفع من الخلايا التائية الكلية ( B ) في منطقة الورم الكلي. استنساخ بإذن من مجلة علم المناعة إمونولوغي السرطان 13 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لبروتوكول وصفها، واحدة من الخطوات الأكثر أهمية هو تحديد التخفيف الصحيح من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. كان التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية المسمى 1: 200، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة لهذه الأجسام المضادة المسمى اليكسا محددة. وينبغي بعد ذلك تحديد التخفيف من الأجسام المضادة الأولية عن طريق التخفيف التسلسلي، ويفضل استخدام اثنين من عينات مختلفة من نوع الأنسجة المقصود (في هذه الحالة، أوبسك). ويتمثل التخفيف الأمثل للعمل في التخفيف الذي يتم عنده الحصول على إشارة واضحة دون ضوضاء في الخلفية وفي غياب إشارة للتحكم السلبي عند نفس التركيز. يمكن إجراء تعديلات فيما يتعلق بنوع الأجسام المضادة الثانوية ومتوسطة التركيب المستخدمة، اعتمادا على نوع المجهر المتاح وتفضيل الباحث. إذا لم يتم تحقيق النتائج المرجوة، فإننا نوصي بالنظر في نوع الشرائح الزجاجية المستخدمة، حيث أن بعض من المعروف أن يسبب مشاكل مع إشارات الخلفية لأنواع معينة من حلول تلطيخ (على سبيل المثال، بيرما الأزرق). ثانيا، قد تتعطل بعض المستضدات عن طريق استخدام استحثاث حاتمة الناجم عن الحرارة. في هذه الحالة، يمكن للباحث استبدال خطوة التدفئة من العازلة مع تقنيات أخرى، مثل انزيم الناجم عن استرجاع حاتمة. ثالثا، إذا كان استخدام القلم مسعور، لا ينبغي أن يتم وضع علامات قريبة جدا من الأنسجة، وهذا سوف يمنع حل تلطيخ من العمل بشكل صحيح. وفيما يتعلق بعدد الأقسام لكل عينة وعدد الصور المطلوبة لكل قسم، يعود للباحث والسؤال البحثي المحدد لتحديد العدد المطلوب للرد على سؤال البحث بقوة إحصائية كافية. لتحليلنا، استخدمنا قسما واحدا لكل عينة وأربع صور لكل قسم. وأخيرا، عند استخدام تلطيخ إمونوفلورسنت، وينبغي أن تؤخذ الرعاية عند استخدام طلاء الأظافر لختم زلات الغطاء، كما أن الكحول موجود في حل طلاء الأظافر يمكن أن تؤثر على إشارة الفلورسنت.
ve_content "> بروتوكول الموصوفة هنا لا تنطوي على تحليل الإنتاجية العالية.وقد حاولنا لأتمتة هذه الخطوة، ولكن التفسير الذاتي للحجم الخلوي والمورفولوجيا يعقد أتمتة التحليل مع حزم البرامج المتاحة في ذلك الوقت على الرغم من أن إعداد الأنسجة وتلطيخ يمكن أن تكون آلية إلى حد كبير، تم إجراء العد من الخلايا يدويا.كنا قادرين على دراسة الارتباطات بين تسلل مجموعات فرعية الخلايا التائية ونتائج السريرية باستخدام بروتوكول وصفها. تم العثور على عدد كبير من الخلايا التائية لتكون مرتبطة مع تحسن البقاء على قيد الحياة خالية من الأمراض في المرضى الذين يعانون من عدد قليل من الخلايا إنتيرومورال إيل-17 + غير T. وهذا يشير إلى أن الخلايا إيل-17 + غير T قد تكون ذات صلة استجابة مناعية ضعيفة في أوبسك، وهو ما يتفق مع الارتباط الموصوف بين إيل-17 وضعف البقاء على قيد الحياة في مرضى السرطان 16 .
الظهورأصبحت برامج البرمجيات المبيض الآن متاحة تجاريا لأتمتة هذه الخطوة وتحل محل حاليا مراقبة الخلية اليدوية والعد، الأمر الذي سيؤدي إلى نتائج أكثر موثوقية، موضوعية، وقابلة للتكرار، وسريعة.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن توافر مجموعات التجارية السماح لتعدد علامات الفلورسنت المناعية حاليا في الارتفاع 17 . وهذا يسمح لتعدد تصل إلى 7 علامات المناعة المختلفة / المؤشرات الحيوية في تركيبة مع كونترستين النووية. ومع ذلك، فإننا نعتقد أن البروتوكول المذكور هنا سوف لا يزال أكثر كفاءة وسهولة تطبيقها في المختبرات التي تفتقر إلى بنية تحتية معقدة ومكلفة، المجاهر، وحزم البرمجيات لتحليل تلطيخ متعدد الأطياف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن المؤلفان عدم وجود تضارب مصالح تجاري أو مالي.
Acknowledgments
تم دعم سيمون بانت من قبل UL2010-4801 منحة من جمعية السرطان الهولندية. نود أن نشكر جميع المؤلفين المشاركين في الورقة الأصلية أن هذا البروتوكول جوف يستند إلى: إميلي أ. درونكرز، ماريج جب ويلترز، رينسكي غوديمانز، سينادا كولينوفيتش، إليزابيث بلومينا، بيتر جف سنيجدرز، أركو غورتر، وسجورد فان دير بورغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
