Summary
Multiparameter-Fluoreszenz-Immunhistochemie kann verwendet werden, um die Anzahl, die relative Verteilung und die Lokalisierung von Immunzellpopulationen in der Tumor-Mikroumgebung zu bestimmen. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung dieser Technik zur Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei oropharyngealen Krebs.
Abstract
Die vierfarbige Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) -Technik ist eine Methode zur Quantifizierung von Zellpopulationen von Interesse unter Berücksichtigung ihrer relativen Verteilung und ihrer Lokalisierung im Gewebe. Diese Technik wurde intensiv angewendet, um das Immun-Infiltrat in verschiedenen Tumortypen zu untersuchen. Die Tumor-Mikroumgebung wird durch Immunzellen infiltriert, die an die Tumorstelle angezogen werden. Verschiedene Immunzellenpopulationen wurden gefunden, um unterschiedliche Rollen in der Tumor-Mikroumgebung zu spielen und einen anderen Einfluss auf das Ergebnis der Erkrankung zu haben. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von Multiparameter-Fluoreszenz-IHC auf oropharyngealem Plattenepithelkarzinom (OPSCC) als Beispiel. Diese Technik kann auf andere Gewebeproben und Zelltypen von Interesse erweitert werden. In der vorgestellten Studie analysierten wir das intraepitheliale und stromale Kompartiment einer großen OPSCC-Kohorte (n = 162). Wir konzentrierten uns auf totale T-Lymphozyten (CD3 + ), immunsuppressive RegulationOry T-Zellen (Tregs, dh FoxP3 + ) und T-Helfer 17 (Th17) -Zellen ( dh IL-17 + CD3 + ) unter Verwendung eines nuklearen Gegenstiftes zur Unterscheidung von Tumorepithel aus Stroma. Es wurde festgestellt, dass eine hohe Anzahl von T-Zellen mit einem verbesserten krankheitsfreien Überleben bei Patienten mit einer geringen Anzahl von intratumoralen IL-17 + Nicht-T-Zellen korreliert wurde. Dies deutet darauf hin, dass IL-17 + Nicht-T-Zellen mit einer schlechten Immunantwort in OPSCC korreliert werden können, was mit der Korrelation zwischen IL-17 und dem schlechten Überleben bei Krebspatienten übereinstimmt. Derzeit werden neuartige Multiparameter-Fluoreszenz-IHC-Techniken mit bis zu 7 verschiedenen Fluorochromen entwickelt und ermöglichen die präzisere Charakterisierung und Lokalisierung von Immunzellen in der Tumor-Mikroumgebung.
Introduction
Oropharyngeale Plattenepithelkarzinome (OPSCCs) sind eine heterogene Gruppe von Plattenepithelkarzinomen, die aus dem Oropharynx stammen. Risikofaktoren für OPSCC umfassen humanes Papillomavirus (HPV) Infektion und Alkohol und Tabakkonsum 1 , 2 . Die Rolle der Immunantwort und wie man sie in einer klinischen Umgebung einsetzt, beginnt erst zu erforschen. Die Tumor-Mikroumgebung wird durch Immunzellen infiltriert, die an der Krebs-Stelle angezogen werden. Obwohl eine hohe CD8 + zytotoxische T-Zell-Frequenz mit einem verbesserten Überleben bei OPSCC-Patienten 3 korreliert wurde, ist die Rolle anderer T-Zell-Teilmengen, einschließlich Tregs und Th17-Zellen, noch unklar 4 . Während Th1- und Th17-Zellen in der Immunantwort-Targeting-Tumorzellen helfen sollen, sind Tregs für ihre Fähigkeiten bekannt, um die Aktivität anderer T-Zellen zu unterdrücken 5 . Die Anwesenheit von TRegs wurde gefunden, um mit günstigen und ungünstigen Reaktionen in verschiedenen Tumortypen zu korrelieren 6 . Da nicht alle im Blut vorhandenen Immunzellen den Tumor in gleichem Maße infiltrieren, liefert das Studium der lokalen Tumor-Mikroumgebung das zuverlässigste Maß für die gegen das Tumor gerichtete Immunantwort. Das Ziel dieser Studie ist es, die Korrelation zwischen den Zahlen und Arten der Immunzellen und dem klinischen Ergebnis zu bestimmen. Wir verwendeten vierfarbige Fluoreszenz-IHC-Bildgebung, um die Anzahl und Lokalisierung verschiedener T-Zell-Subpopulationen in humanem OPSCC zu analysieren.
Wir konzentrierten uns auf totale T-Lymphozyten (CD3 + ), Th17-Zellen und immunsuppressive FoxP3 + Tregs, deren Differenzierungsweg eng mit Th17-Zellen verwandt ist. Th17-Zellen zeichnen sich durch die Kombination von CD3 und IL-17 aus. Das Cytokin IL-17 kann auch durch Nicht-T-Zellen 7 hergestellt werden . Wir haben die Verteilung der Intra-Epitierung bestimmtHelialen und stromalen T-Zellen, Tregs, Th17 und IL-17 + Nicht-T-Zellen in einer großen Reihe von OPSCC-Fällen und analysierten die Korrelationen mit dem Überleben des Patienten. Mehrfarbige Fluoreszenz IHC wurde verwendet, um die Expression von CD3, Foxp3 und IL-17 in Kombination mit einem DAPI-Gegenfleck zu identifizieren. Dieser Assay erlaubte die einfache und klare Identifizierung von beiden Tumorzellen (unter Verwendung von DAPI-Kernfärbung) und der infiltrierenden T-Zellpopulationen (unter Verwendung einer Kombination verschiedener Marker). Nach der Probenvorbereitung und der Färbung wurde ein Fluoreszenzmikroskop und eine Imaging-Software verwendet, um die verschiedenen verwendeten Fluoreszenzfarben zu trennen und die Anzahl und den Typ der Zellen zu bestimmen, die sowohl im Tumorepithel als auch im Tumor-assoziierten Stroma vorhanden waren.
Ein alternativer Assay zur Quantifizierung und Phänotypen von Immunzellpopulationen ist die Durchflusszytometrieanalyse oder die Zytometrie nach der Zeit des Fluges (CyTOF) -Analyse von Tumor- oder peripheren Proben ( dh Blut oder Aszites). Mit diesemTechnik, alle Informationen über die Lokalisierung und die relative Verteilung der verschiedenen Zelltypen geht verloren. Die Verwendung und Analyse von peripheren Proben liefert auch keine Information darüber, welche Zellen in der Lage sind, die Tumor-Mikroumgebung zu infiltrieren. Blut- und Ascite-Immunzellenanalysen haben gezeigt, dass sie nicht den Phänotyp und die Häufigkeit der Immunzelleninfiltration des Tumorgewebes 8 , 9 widerspiegeln.
Eine weitere Alternative ist die Verwendung von Hellfeldmikroskopie. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber der Fluoreszenz-Bildgebung ist die Abwesenheit von Gewebe-Autofluoreszenz. Obwohl einige Proben mehr Autofluoreszenz - insbesondere Erythrozyten, aber auch andere Zelltypen enthalten, einschließlich neutrophiler Granulozyten - können diese Bereiche bei der Analyse fast aller Proben leicht entfernt werden. Immunfluoreszenz bietet den Vorteil, mehrere Marker in einer Probe zu analysieren, indem ein Panel mit gezielter Fluoreszenz verwendet wirdNt Wellenlängen. Dies ist derzeit in gleichem Maße für die Hellfeldmikroskopie aufgrund des Fehlens einer ausreichenden Anzahl von Etiketten und handelsüblichen Antikörper-Isotypen für ein bestimmtes Antigen unmöglich.
Die hier beschriebene mehrfarbige Fluoreszenz-IHC-Technik wurde in vielen verschiedenen Krebsarten und Antikörperkombinationen verwendet, um verschiedene Immunzellpopulationen sowie Tumorzell-exprimierte Moleküle wie menschliche Leukozytenantigene (HLA) und PD-L1 10 , 11 , 12 Das Protokoll wurde mit vielen verschiedenen Arten von Proben und Antikörpern etabliert und validiert.
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Protocol
Patientenproben wurden nach den medizinischen Richtlinien behandelt, die im Verhaltenskodex für die ordnungsgemäße Sekundärnutzung des menschlichen Gewebes des niederländischen Verbandes der biomedizinischen wissenschaftlichen Gesellschaften (www.federa.org) beschrieben sind.
1. Vorlagen vorbereiten
- Erhalten Sie reseziertes Gewebematerial (jede Art von Gewebe) aus einer Pathologie-Abteilung, nachdem Sie medizinischen ethischen Ausschuss die Erlaubnis erhalten, reseziertes Material zu verwenden.
HINWEIS: Für das aktuelle Experiment wurden vor der Behandlung von primären oropharyngealen Tumoren, die in der Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande zwischen 1970 und 2011, ausgewählt wurden, wie zuvor beschrieben (n = 162) 13, diagnostiziert. Die Größe des Gewebes war nur durch die Anforderung für eine ausreichende Menge an Tumorgewebe begrenzt, um zuverlässig 4 mikroskopische Bilder innerhalb des Tumors zu nehmen. - Fix das Gewebe in 4% gepufferten Formalin für mindestens 12 h. Dehydrieren Sie das Gewebe in AgAusgestreckte Reihe von Ethanol. Waschen Sie es in Xylol und legen Sie es in Paraffinwachs mit einem automatisierten Gewebeprozessor ein.
- Schneiden Sie 4 μm dicke Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Gewebeschnitten auf Glasrutschen mit einem Mikrotom. Legen Sie den Gewebeblock in den Mikroton-Gewebehalter mit Standardverfahren.
- Schneiden Sie Bänder des Gewebes und legen Sie sie auf die Oberfläche eines Wasserbades, das entionisiertes Wasser bei 45 ºC enthält. Verwenden Sie eine Folie, die für die immunhistochemische Färbung geeignet ist, um einen Abschnitt zu fischen, indem Sie die Folie direkt unter den Abschnitt ins Wasser legen. Ziehen Sie den Schieber vorsichtig schräg nach oben, nehmen Sie den Abschnitt aus dem Wasser und kleben ihn auf die Rutsche.
- Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei 37 ° C trocknen.
- Deparaffinieren Sie die FFPE-Folien, indem Sie sie vollständig in frisches 100% Xylol eintauchen, dreimal für jeweils 5 min. Rehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie sie zweimal in frischem 100% igem Ethanol, 70% Ethanol und 50% Ethanol für jeweils 5 min eintauchen.
2. Antigen Retrieval durchführen
- Waschen Sie die Dias in deionisiertem Wasser für 5 min.
- Vor dem Erwärmen von Tris-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Puffer (10 mM Tris plus 1 mM EDTA, pH 9,0) auf Siedetemperatur unter Verwendung einer Mikrowelle vorheizen. Führen Sie Antigen-Retrieval durch Tauchen der Folien in den vorgeheizten EDTA-Puffer und halten den Puffer bei dieser Temperatur für 10 min in der Mikrowelle.
HINWEIS: Jede Mikrowelle mit einer Leistung von 900 W kann verwendet werden. - Lassen Sie die Objektträger 2 Stunden lang im Puffer abkühlen.
3. Flecken Tissue Slides
- Die Folien zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für jeweils 5 min waschen.
- Zeichnen Sie einen Kreis um das Gewebe mit einem hydrophoben Stift, um zu verhindern, dass die verdünnten Antikörper die Folie verschütten. Mit PBS noch einmal waschen Das ist optional.
- Inkubieren des Gewebes mit primären Antikörpern (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 und anti-IL-17 1:50), verdünnt in 1% w / v Rinderserum aLbumin (BSA) in PBS bei Raumtemperatur über Nacht.
HINWEIS: Das Volumen pro Folie hängt von der Größe des Gewebes ab, aber es ist typischerweise 50 - 150 μl. Ersetzen Sie die primären Antikörper mit Antikörpern der gleichen Isotypklasse mit einer unbekannten Spezifität für die negativen Kontrollrutschen bei der gleichen Verdünnung wie die CD3-, CD8- und FoxP3-Antikörper ( dh Kaninchen-Ig-Isotyp-Kontroll-Antikörper, Maus-IgG1-Isotyp-Kontroll-Antikörper und Ziege IgG-Isotyp-Kontroll-Antikörper). - Waschen Sie die Dias dreimal mit PBS für jeweils 5 min.
- Inkubieren Sie das Gewebe mit einer Kombination von fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern, die auf die primären Antikörper-Spezies und / oder Isotypen ( dh 1: 200-Esel-Anti-Ziegen-IgG Alexa 488, Esel-Anti-Kaninchen-IgG A546 und Esel-Anti-Maus A647) 1% BSA in PBS bei Raumtemperatur für 1 h.
HINWEIS: Das Volumen pro Folie hängt von der Größe des Gewebes ab, beträgt aber typischerweise 50 - 150 μl.- NachHinzufügen des sekundären Antikörpers, halten die Dias so lange wie möglich vor Licht geschützt, indem man sie in einem dunklen Kasten aufbewahrt oder die Schachtel in Aluminiumfolie umwickelt.
4. Aufsatz- und Gegenfärbefolien
- Waschen Sie die Dias dreimal in PBS für jeweils 5 min.
- Montieren Sie die Objektträger mit einem wässrigen Anti-Fade-Montagemedium mit einem nuklearen Gegenfleck ( zB DAPI). Analysieren Sie die Folien mit einem Fluoreszenzmikroskop so schnell wie möglich (innerhalb von zwei Wochen). Die Dias im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Analyse aufbewahren.
5. Analysieren Sie gefärbte Gewebe-Folien
- Erhalten Sie vier Bilder von jeder Folie mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20 - 25X Objektiv ausgestattet ist. Nehmen Sie Bilder an zufälligen Orten in der gesamten Tumor-Bereich in der Folie enthalten, um eine repräsentative Fraktion des Tumors zu erfassen.
HINWEIS: Eine Standardvergrößerung von 250X sollte verwendet werden. Irgendein fluoreszierender oR Laser-Scanning-Mikroskop verwendet werden kann, vorausgesetzt, es hat die Filter und Laser benötigt, um die verwendeten Fluorochrome zu visualisieren.- Zur Visualisierung von Alexa 488 verwenden Sie ein Erregungsmaximum von 490 und ein Emissionsmaximum von 525; Zur Visualisierung von Alexa 546, verwenden Sie ein Erregungsmaximum von 556 und ein Emissionsmaximum von 573; Zur Visualisierung von Alexa 647, verwenden Sie ein Erregungsmaximum von 650 und ein Emissionsmaximum von 665; Und zur Visualisierung von DAPI verwenden Sie ein Erregungsmaximum von 358 und ein Emissionsmaximum von 461.
- Speichern Sie die Bilder als Bilddateien (dh, JPEG und TIFF) in der Software dem Benutzer zur Verfügung.
- Diskriminieren zwischen Tumorepithel und Tumorstroma Bereichen auf der Grundlage der nuklearen und zellulären Formen der Tumorepithel gegen versromale Zellen nach Rücksprache mit einem Pathologen.
- Um die gesamte stromale Oberfläche zu bestimmen, zeichnen Sie eine Linie um alle Bereiche, die von Stromazellen (anstelle von Tumorzellen) und Rekorder besetzt sindD die Oberfläche mit der Bildanalyse-Software des Mikroskopherstellers.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Overlay" unter dem Bild. Wähle die "Closed Poly-line" -Form und klicke darauf. Abgrenzung der Grenze zwischen Tumor-Epithel- und Stroma-Feldern durch Anklicken um den Bereich bis zum Erreichen des ersten Punktes wieder; Dies ist eine Maßnahme für diesen Bereich.
HINWEIS: Sobald die Form geschlossen ist, erscheint neben der Form, die den Oberflächenbereich des ausgewählten Bildes umgibt (A = x μm 2 ), eine Zahl.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Overlay" unter dem Bild. Wähle die "Closed Poly-line" -Form und klicke darauf. Abgrenzung der Grenze zwischen Tumor-Epithel- und Stroma-Feldern durch Anklicken um den Bereich bis zum Erreichen des ersten Punktes wieder; Dies ist eine Maßnahme für diesen Bereich.
- Subtrahieren Sie diese Fläche von der Gesamtbildfläche (in den Bildeigenschaften vorgesehen), um die Epithelfläche zu berechnen. Ausschließen von vaskulären, nekrotischen und autofluoreszierenden Bereichen durch Zeichnen einer Linie um sie herum, Aufzeichnen der Größe des vorgesehenen Bereichs und Subtrahieren der von der Epitheloberfläche.
- Sichern Sie alle Flächennummern in einer Tabellenkalkulation, um die durchschnittlichen Flächen zu berechnen undZellzahlen pro Folie.
- Mit der Bildanalyse-Software bestimmen Sie, ob die Zellen ein-, doppel- oder dreifach positiv sind, indem Sie die Fluoreszenz aller vier Kanäle überprüfen.
- Zählen Sie die Einzel-, Doppel- und Dreifach-Positiv-Zellen in jedem Bild mit ImageJ.
- Herunterladen ImageJ. Öffnen Sie ein Bild, indem Sie auf "Datei" und "Öffnen" klicken und das zu analysierende Bild auswählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das "Point Tool" (ein rotes Quadrat in der Mitte von vier Zeilen) und wählen Sie das "Multi-Point Tool". Doppelklicken Sie auf das "Multi-Point Tool" und zählen Sie die Anzahl der verschiedenen Zelltypen im Bild, indem Sie für jeden Zelltyp eine andere Zählernummer auswählen.
HINWEIS: Zähle alle Zellen jedes einzelnen Zelltyps, wie durch die Anwesenheit von einer, zwei oder allen drei fluoreszierenden Farben identifiziert. DAPI ausschließen, da dieser nukleare Gegenfleck in allen Zellen vorhanden ist und zur Unterscheidung von Tumorzellen aus Immunzellen verwendet wird. Jeder Zellentyp wird gezähltMit einer anderen Zählerzahl. Zählen Sie die Zellzahlen jedes Zelltyps separat in den Tumorepithel- und Stroma-Gebieten, indem Sie jeweils eine andere Zählerzahl wählen. Zählen Sie keine Zellen in Blutgefäßen und weitgehend autofluoreszierenden Bereichen. - Notieren Sie die Anzahl der Zellen, die in jedem Zähler für jedes Bild in einer Tabellenkalkulation analysiert wurden.
- Teilen Sie die Gesamtzahl der Zellen für jeden Zelltyp über die Gesamtfläche des Tumorepithels und des Tumorstromas analysiert.
- Herunterladen ImageJ. Öffnen Sie ein Bild, indem Sie auf "Datei" und "Öffnen" klicken und das zu analysierende Bild auswählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das "Point Tool" (ein rotes Quadrat in der Mitte von vier Zeilen) und wählen Sie das "Multi-Point Tool". Doppelklicken Sie auf das "Multi-Point Tool" und zählen Sie die Anzahl der verschiedenen Zelltypen im Bild, indem Sie für jeden Zelltyp eine andere Zählernummer auswählen.
- Zählen Sie die Einzel-, Doppel- und Dreifach-Positiv-Zellen in jedem Bild mit ImageJ.
- Um die gesamte stromale Oberfläche zu bestimmen, zeichnen Sie eine Linie um alle Bereiche, die von Stromazellen (anstelle von Tumorzellen) und Rekorder besetzt sindD die Oberfläche mit der Bildanalyse-Software des Mikroskopherstellers.
6. Statistische Analyse
ANMERKUNG: Alle statistischen Analysen sollten mit einem Statistiker besprochen werden, um die Qualität der Daten zu gewährleisten. Für allgemeine Statistiken, verwenden Sie alle medizinischen Statistiken Führer 14 .
- Testen Sie die Korrelationen zwischen Zellfrequenzen mit einem Spearman-Rangkorrelation rho-Test.
- Testen Sie die statistischen Unterschiede in der Anzahl der positiven celZwischen Patientengruppen mit dem Wilcoxon Mann-Whitney-Test.
- Testen Sie die Korrelationen zwischen Zellzahlen und krankheitsfreiem Überleben ( dh Zeit von der Diagnose bis zum lokalen oder entfernten Wiederauftreten von Tod oder Krankheit), indem Sie die Patienten in Gruppen auf der Grundlage einer Cut-off-Anzahl von Zellen unter Verwendung der Kaplan-Meier-Kurvenerzeugung und -protokoll teilen Ranganalyse 15
- Führen Sie multivariate Analysen mit Cox Proportional Hazard Regression Analyse.
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Representative Results
Eine Reihe von FFPE - Proben - Vorbehandlung Tumor aus primären oropharyngealen Tumoren in der Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande zwischen 1970 und 2011 diagnostiziert erhalten, wie zuvor beschrieben ausgewählt wird (n = 162), gefärbt wurde unter Verwendung des Protokolls 13 beschrieben. Ein bis vier zufällige Bilder jeder Folie wurden analysiert ( Abbildung 1 ). Es sind einige autofluoreszierende Zellen angegeben, die sich deutlich durch ihr vollständiges gelbes Aussehen unterscheiden können. Zellen wirklich doppelt oder dreifach-positiv nur Fleck positiv für einen bestimmten Antikörper an der erwarteten Lokalisierung, die an der Zellmembran oder dem Kern ist, in diesem Fall. Negative Kontrollrutschen zeigten keine spezifische Färbung über der Hintergrundgewebe-Autofluoreszenz ( Abbildung 2 und Abbildung 4 ), was bestätigt, dass alle Signale spezifisch für die vom Primär erkannten Ziele sindAntikörper Alle Tumorproben wurden durch CD3 + -T-Zellen in unterschiedlichem Ausmaß infiltriert. FoxP3 + Tregs exprimierten immer CD3 und waren eine der wichtigsten infiltrierenden T-Zellpopulationen. CD3-Zellen, die IL-17 exprimierten (Th17-Zellen), waren eine kleinere Population der infiltrierenden T-Zellen. IL-17 durch CD3 - Zellen exprimiert waren eine weitere reichlich infiltrieren Zellpopulation. IL-17 + FoxP3 + -Zellen enthielten nicht mehr als 0,01% aller FoxP3 + -Zellen.
Alle statistischen Tests waren zweiseitig, und p-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen 14 . Die Korrelationen zwischen intraepithelialen oder totalen Zellzahlen und Überleben werden vorgestellt, da die Korrelationen zwischen Stroma- oder Gesamtzellzahlen und Patientenüberleben ähnlich waren. Eine hohe Anzahl infiltrierender Gesamt-CD3 + -T-Zellen zeigte einen Trend zu einer Korrelation mit einem verbesserten krankheitsfreien Überleben (0.086, Fig. 5A ) im Vergleich zu einer niedrigen Anzahl von T-Zellen ( dh dem niedrigsten Quartil). Bei der Untersuchung von Patienten mit einer geringen Anzahl von IL-17 + -Zellen wurde eine hohe Anzahl an infiltrierenden T-Zellen mit einem verbesserten krankheitsfreien Überleben korreliert (p = 0,012, 5B ). Die prognostische Wirkung von Tumor-infiltrierenden T-Zellen war in der Gruppe von Patienten mit einer hohen Anzahl von Tumor-infiltrierenden IL-17 + -Zellen verloren (Daten nicht gezeigt). Somit kann die Wirkung von tumorinfiltrierenden T-Zellen in OPSCC auf die geringe Anzahl an vorhandenen IL-17 + -Zellen bezogen sein.
Abbildung 1: FFPE Oropharynx Krebs Gewebe gefärbt von Vier-Farben-Fluoreszenz IHC. Repräsentatives Bild eines Immunfluoreszenzflecks für CD3 ( A , Rot), IL-17 ( B Ong>, grün) und FoxP3 ( C , blau) sowie das zusammengeführte Bild kombiniert mit DAPI (grau) ( D ). Zwei autofluoreszierende Zellen sind durch die Pfeile gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Negative Steuerung für CD3. Repräsentatives Bild von FFPE-oropharyngealem Krebsgewebe, gefärbt, wie in dem Protokoll beschrieben, wobei der Anti-CD3-Antikörper durch einen Kaninchen-Ig-Isotyp-Kontroll-Antikörper mit unbekannter Spezifität ersetzt wird. Keine Färbung für Kaninchen Ig ( A , Rot) kombiniert mit Färbung für IL-17 ( B , Grün), FoxP3 ( C , Blau) und DAPI ( D , Grau) wird gezeigt.2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Negative Kontrolle für IL-17. Repräsentatives Bild des FFPE-oropharyngealen Krebsgewebes, gefärbt wie im Protokoll beschrieben, wobei der Anti-IL-17-Antikörper durch einen Ziegen-Ig-Isotyp-Kontroll-Antikörper mit unbekannter Spezifität ersetzt wird. Keine Färbung für Ziegen-Ig ( B , Grün), kombiniert mit Färbung für CD3 ( A , Rot), FoxP3 ( C , Blau) und DAPI ( D , Grau). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
FIgure 4: Negative Kontrolle für FoxP3. Repräsentatives Bild des FFPE-oropharyngealen Krebsgewebes, gefärbt wie im Protokoll beschrieben, wobei der Anti-FoxP3-Antikörper durch einen Maus-IgG1-Isotyp-Kontroll-Antikörper mit unbekannter Spezifität ersetzt wird. Keine Färbung für Maus IgG1 ( C , Blau) kombiniert mit Färbung für CD3 ( A , Rot), IL-17 ( B , Grün) und DAPI ( D , Grau) wird gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Kaplan-Meier-Überlebenskurven. Für Patienten mit einer unter-medianen Anzahl von IL-17 + Zellen / mm 2 sind krankheitsfreie Überlebenskurven für eine sehr niedrige ( dh niedrigste Quartil) gegenüber einer hohen Anzahl von tota gezeigtL T-Zellen ( A ) und einem niedrigen ( dh unterhalb mittleren) gegenüber einer hohen Anzahl von Gesamt-T-Zellen ( B ) in der gesamten Tumorfläche. Reproduziert mit Genehmigung aus der Cancer Immunology Immunotherapy journal 13 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Für das beschriebene Protokoll ist eines der kritischsten Schritte, um die korrekte Verdünnung der verwendeten primären Antikörper zu bestimmen. Die Verdünnung der markierten Sekundärantikörper betrug 1: 200, wie vom Hersteller dieser spezifischen Alexa-markierten Antikörper empfohlen. Die Verdünnung der primären Antikörper sollte dann durch eine serielle Verdünnung bestimmt werden, vorzugsweise unter Verwendung von zwei verschiedenen Proben des beabsichtigten Gewebetyps (in diesem Fall OPSCC). Die optimale Arbeitsverdünnung ist die Verdünnung, bei der ein klares Signal erhalten wird, ohne Hintergrundrauschen und in Abwesenheit eines Signals für die Negativkontrolle bei gleicher Konzentration. Modifikationen können in Bezug auf die Art der Sekundär-Antikörper und Montage-Medium verwendet werden, je nach Art des verfügbaren Mikroskops und die Präferenz des Forschers gemacht werden. Wenn die beabsichtigten Ergebnisse nicht erreicht werden, empfehlen wir Ihnen, die Art der verwendeten Glasrutschen zu betrachten, da einige bekanntermaßen Probleme mit Hintergrundsignalen verursachen Für besondere Arten von Färbelösungen ( zB Perma Blue). Zweitens können einige Antigene durch die Verwendung von Wärme-induzierten Epitop-Retrieval unterbrochen werden. In diesem Fall kann der Forscher den Erwärmungsschritt des Puffers durch andere Techniken ersetzen, wie z. B. Enzym-induzierte Epitop-Retrieval. Drittens sollte bei der Verwendung des hydrophoben Stifts die Markierung nicht zu nahe am Gewebe erfolgen, da dadurch die Färbelösung nicht richtig funktioniert. In Bezug auf die Anzahl der Abschnitte pro Probe und die erforderliche Anzahl von Bildern pro Abschnitt ist es Aufgabe des Forschers und der spezifischen Forschungsfrage, die Anzahl zu bestimmen, die erforderlich ist, um die Forschungsfrage mit ausreichender statistischer Leistung zu beantworten. Für unsere Analyse verwendeten wir einen Abschnitt pro Probe und vier Bilder pro Sektion. Schließlich sollte bei der Verwendung von Immunfluoreszenz-Färbung bei der Verwendung von Nagellack die Versorgung der Deckgläser beachtet werden, da der in der Nagellacklösung vorhandene Alkohol das Fluoreszenzsignal beeinflussen kann.
Ve_content "> Das hier beschriebene Protokoll beinhaltet keine Hochdurchsatzanalyse, wir haben versucht, diesen Schritt zu automatisieren, aber die subjektive Interpretation von Zellgröße und Morphologie erschwert die Automatisierung der Analyse mit den zur Zeit verfügbaren Softwarepaketen Und Färbung kann weitgehend automatisiert werden, das Zählen der Zellen wurde manuell durchgeführt.Wir konnten die Korrelationen zwischen den infiltrierenden T-Zell-Teilmengen und dem klinischen Ergebnis mit dem beschriebenen Protokoll untersuchen. Es wurde festgestellt, dass eine hohe Anzahl von T-Zellen mit einem verbesserten krankheitsfreien Überleben bei Patienten mit einer geringen Anzahl von intratumoralen IL-17 + Nicht-T-Zellen korreliert wurde. Dies legt nahe , dass IL-17 + Nicht-T - Zellen zu einem schlechten Immunantwort in OPSCC in Zusammenhang stehen können, die in Übereinstimmung mit der Korrelation zwischen IL-17 und einem schlechten Überleben von Krebspatienten 16 beschrieben ist.
ImprOved Software-Programme sind nun kommerziell verfügbar, um diesen Schritt zu automatisieren und ersetzen derzeit die manuelle Zellbeobachtung und -zählung, was zu zuverlässigeren, objektiveren, reproduzierbaren und schnellen Ergebnissen führt.
Darüber hinaus ist die Verfügbarkeit von kommerziellen Kits für das Multiplexen von fluoreszierendem immunhistochemischen Marker ermöglichen derzeit auf dem Vormarsch 17. Dies ermöglicht das Multiplexen von bis zu 7 verschiedenen Immunmarkern / Biomarkern in Kombination mit einem nuklearen Gegenschlag. Allerdings glauben wir, dass das hier gemeldete Protokoll in Laboratorien, die keine komplexen und teuren Infrastrukturen, Mikroskope und Softwarepakete für die multispektrale Färbeanalyse aufweisen, noch effizienter und einfacher angewendet werden kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen kommerziellen oder finanziellen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Simone Punt wurde von der Niederlassung UL2010-4801 von der niederländischen Krebsgesellschaft unterstützt. Wir danken allen Co-Autoren des Originalpapiers, auf denen dieses JoVE-Protokoll basiert: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter und Sjoerd van Der Burg
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
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