Summary
Multiparameter פלואורסצנטי אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש כדי להעריך את המספר, הפצה יחסית, ולוקליזציה של אוכלוסיות תאים החיסון microenvironment הגידול. כתב היד מתאר את השימוש בטכניקה זו כדי לנתח תת-תאים של תאי T בסרטן הלוע.
Abstract
ארבעת צבעים אימונוהיסטוכימיה (IHC) הטכניקה היא שיטה לכמת אוכלוסיות תאים עניין תוך לקיחה בחשבון ההפצה היחסית שלהם לוקליזציה ברקמה. טכניקה זו יושמה בהרחבה כדי לחקור את החיסון החיסוני בסוגי הגידול השונים. Microenvironment הגידול הוא שחדר על ידי תאים החיסונית נמשכים לאתר הגידול. אוכלוסיות תאים חיסוניים שונים נמצאו לשחק תפקידים שונים microenvironment הגידול יש השפעה שונה על תוצאות המחלה. כתב יד זה מתאר את השימוש multifarameter פלואורסצנטי IHC על קרצינומה של תאי קשקש אורופרינגל (OPSCC) כדוגמה. טכניקה זו יכולה להיות מורחבת דגימות רקמות אחרות סוגי תאים של עניין. במחקר המוצג, ניתחנו את תא intraepithelial ו stromal של קבוצה גדולה OPSCC (n = 162). התמקדנו בלימפוציטים מסוג T (CD3 + ), immunosuppressive regulatאו תאי T (Tregs, כלומר, FoxP3 + ) ו T עוזר 17 (תאים TH17) ( כלומר, IL + 17 + CD3 + ) באמצעות counterstain גרעיני להבחין אפיתל הגידול מ stroma. נמצא כי מספר גבוה של תאי T נמצא בקורלציה עם הישרדות משופרת ללא מחלה בחולים עם מספר נמוך של תאי IL-17 + שאינם תאי T. דבר זה מצביע על כך שתאי ה- IL-17 + T עשויים להיות מתואמים עם תגובה חיסונית ירודה ב- OPSCC, אשר עולה בקנה אחד עם המתאם המתואר בין IL-17 להישרדות ירודה בחולי סרטן. נכון לעכשיו, רומן multiparameter פלואורסצנטי IHC טכניקות מפותחים באמצעות עד 7 fluorochromes שונים יאפשר אפיון מדויק יותר לוקליזציה של תאים חיסוניים microenvironment הגידול.
Introduction
קרצינומה של תאי הקשקש (OPSCC) של תאי הקשקש (OPSCC) הם קבוצה הטרוגנית של סרטן תאי קשקש שמקורם ב- oopharynx. גורמי הסיכון של OPSCC כוללים זיהום פפילומארוס (HPV) אנושי ושימוש באלכוהול ובטבק 1 , 2 . תפקידה של התגובה החיסונית וכיצד להשתמש בה במסגרת קלינית הוא רק מתחיל להיות בחנו. Microenvironment הגידול הוא שחדר על ידי תאים החיסונית נמשכים לאתר הסרטן. למרות CD8 גבוה + T ציטוטוקסיים תאי תדר כבר מתואם עם הישרדות משופרת בחולי OPSCC 3, תפקידיו של תת תאי T אחרים, כוללים תאי Tregs ו TH17, עדיין לא ברורים 4. בעוד תאי Th1 ו- TH17 אמורים לסייע לתאי הגידול מיקוד התגובה החיסונית, Tregs ידועים ביכולות שלהם כדי לדכא את הפעילות של תאי T אחרים 5. עם זאת, נוכחותו של Tובתקנות כבר נמצאו בקורלציה היא בתגובות חיוביות ושליליות ב סוגי גידולים שונים 6. מאחר שלא כל תאי החיסון הנמצאים בדם חודרים לגידול באותה מידה, לימוד המיקרו-סביבה של הגידול המקומי מספק את המדד הכי אמין לתגובה החיסונית המכוונת כנגד הגידול. מטרת המחקר היא לקבוע את המתאם בין המספרים וסוגי תאי החיסון לבין התוצאה הקלינית. השתמשנו ארבע צבע פלואורסצנטי הדמיה IHC לנתח את מספר לוקליזציה של תת שונות subpopulations T OPSCC האדם.
התמקדנו בלימפוציטים מסוג T (CD3 + ), בתאי ה- TH17 וב- FoxP3 + טרגס החיסוני, אשר מסלול ההבחנה שלהם קשור קשר הדוק לתאי ה- TH17. תאי ה- TH17 מתאפיינים בשילוב של CD3 ו- IL-17. הציטוקין IL-17 יכול גם להיות מיוצר על ידי תאים שאינם T 7 . קבענו את ההתפלגות של intra-epitתאי tials, T17, ו- IL-17 + שאינם תאי T בסדרה גדולה של מקרים OPSCC ונותחו את המתאמים עם הישרדות המטופל. Multicolor פלואורסצנטי IHC שימש כדי לזהות את הביטוי של CD3, Foxp3, ו- IL-17, בשילוב עם Counterstain DAPI. Assay זה איפשר זיהוי קל וברור של שני תאים סרטניים (באמצעות מכתים גרעיני DAPI) ואוכלוסיות תאי T חדיר (באמצעות שילוב של סמנים שונים). בעקבות הכנת המדגם מכתים, מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוכנות הדמיה שימשו להפריד בין צבעים פלואורסצנטיים שונים המשמשים כדי לקבוע את מספר וסוג התאים הנוכחי הן אפיתל הגידול הגידול stroma הקשורים.
Assay חלופי לכמת פנוטיפ אוכלוסיות תאים החיסון הוא זרימת cytometry זרימה, או cytometry לפי זמן הטיסה (CyTOF) ניתוח, של דגימות הגידול או היקפי ( כלומר, דם או מיימת). באמצעות זהטכניקה, כל המידע על לוקליזציה והפצה יחסית של סוגי תאים שונים הולך לאיבוד. השימוש וניתוח של דגימות היקפי גם אינו מספק מידע על אילו תאים מסוגלים לחדור microenvironment הגידול. דם ו ASCite תאים חיסוניים ניתוחים הוכחו לא כדי לשקף את הפנוטיפ ואת התדירות של חיסון התא החיסונית של רקמת הגידול 8 , 9 .
חלופה נוספת היא השימוש במיקרוסקופ שדה בהיר. יתרון של טכניקה זו על הדמיה פלואורסצנטי הוא היעדר autofluorescence רקמות. למרות כמה דגימות להכיל יותר autofluorescence, במיוחד אריתרוציטים, אבל גם סוגי תאים אחרים, כולל גרנולוציטים נויטרופילי, אזורים אלה יכולים בקלות להסיר את הניתוח של כמעט כל הדגימות. Immunofluorescence מציעה את היתרון של ניתוח סמנים מרובים במדגם אחד באמצעות פאנל של fluoresce ממוקדאורכי גל. זה כרגע בלתי אפשרי באותה מידה עבור מיקרוסקופ שדה בהיר בשל היעדר מספר מספיק של תוויות ואיזוטופים נוגדן זמין מסחרית עבור אנטיגן מסוים.
טכניקת ה- IHC של הקרינה הרב-גונית המתוארת כאן שימשה בסוגי סרטן רבים ושילובים שונים של נוגדן כדי לחקור אוכלוסיות תאים חיסוניות שונות, כמו גם מולקולות של תאים המופיעים בתאים, כגון אנטיגנים של לויקוציטים אנושיים (HLA) ו- PD-L1 10 , 11 , 12 . הפרוטוקול הוקם ו תוקף באמצעות סוגים שונים של דגימות ונוגדנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות החולה טופלו על פי הנחיות האתיקה הרפואית המתוארות בקוד ההתנהגות לשימוש משני משני של רקמת האדם של הפדרציה ההולנדית של אגודות מדעיות ביו רפואיות (www.federa.org).
1. הכן שקפים
- השגת חומר רקמה משוכפל (כל סוג של רקמה) ממחלקת הפתולוגיה לאחר קבלת ועדת אתית רפואית רשות להשתמש בחומר רסקטד.
הערה: עבור הניסוי הנוכחי, דגימות הגידול לפני הטיפול התקבלו מגידולים ראשוניים אוופרינגליים שאובחנו במרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן, ליידן, הולנד בין השנים 1970 ו -2011, שנבחרו כמתואר לעיל (n = 162) 13 . גודל הרקמה היה מוגבל רק על ידי דרישה כמות מספקת של רקמת הגידול באופן אמין לקחת 4 תמונות מיקרוסקופיות בתוך הגידול. - תקן את הרקמה בפורמלין 4% שנאגרו עבור מינימום של 12 שעות. מייבשים את הרקמה ב agסדרה ממוצעת של אתנול. שטפו אותו קסילן ו לשבץ אותו שעווה פרפין באמצעות מעבד רקמות אוטומטיות.
- גזור 4 מיקרומטר עבה פורמלין קבוע, paraffin- מוטבע (FFPE) סעיפים רקמות על שקופיות זכוכית באמצעות microtome. מניחים את בלוק רקמה מחזיק רקמות microtone באמצעות נהלים סטנדרטיים.
- לחתוך סרטים של רקמות ולהניח אותם על פני המים באמבטיה המכילים מים deionized ב 45 מעלות צלזיוס. השתמש שקופית מתאימה מכתים אימונוהיסטוכימי לדוג קטע על ידי הצבת השקופית במים ישירות מתחת לסעיף. בזהירות להזיז את השקופית למעלה בזווית, לוקח את הקטע מתוך המים דבק אותו על השקופית.
- בואו השקופיות יבש לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
- Deparaffinize שקופיות FFPE ידי immersing אותם לחלוטין קסילן 100% טרי, שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד. Rehydrate את השקופיות על ידי שקוע אותם פעמיים אתנול 100% טרי, אתנול 70%, ואתנול 50% 5 דקות כל אחד.
2. ביצוע אחזור אנטיגן
- שטפו את השקופיות במים deionized במשך 5 דקות.
- מחממים Tris-ethylenediaminetetraetetic חומצה (EDTA) חיץ (10 מ"מ טריס בתוספת 1 מ"מ EDTA, pH 9.0) לטמפרטורת רותחים באמצעות מיקרוגל. לבצע אחזור אנטיגן על ידי שקע שקופיות החיץ EDTA שחון מראש שמירה על המאגר בטמפרטורה זו במשך 10 דקות במיקרוגל.
הערה: ניתן להשתמש במיקרוגל עם הספק של 900 W. - תן את השקופיות להתקרר במאגר במשך 2 שעות.
3. כתם רקמות שקופיות
- לשטוף את השקופיות פעמיים עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) במשך 5 דקות כל אחד.
- צייר מעגל סביב הרקמה עם עט הידרופובי כדי למנוע נוגדנים מדולל מן נשפך את השקופית. לשטוף שוב עם PBS; זה אופציונלי.
- דגירה את הרקמה עם נוגדנים ראשוניים (אנטי CD3 1:50, אנטי FoxP3 1: 200, אנטי IL-17 1:50) בדילול של 1% w / v שור בסרום aLbumin (BSA) ב- PBS בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
הערה: נפח לכל שקופית תלוי בגודל הרקמה, אבל זה בדרך כלל 50-150 μL. תחליף את הנוגדנים הראשוניים עם נוגדנים מאותו סוג איסוטייפ, עם סגוליות לא ידועה לשקופיות הבקרה השליליות באותו דילול כמו הנוגדנים CD3, CD8 ו- FoxP3 ( כלומר, נוגדנים לבקרת איגוט של ארנבת Ig, עכבר IgG1 נוגדן שליטה איסוטיפ, ועז IgG נוגדן שליטה איזוטופית). - לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- לדגור את הרקמה עם שילוב של נוגדנים משני שכותרתו fluorescently המכוונים מינים נוגדנים העיקריים ו / או איסוטיפים ( כלומר, 1: 200 חמור אנטי עז IgG Alexa 488, חמור נגד ארנבת IgG A546, חמור נגד עכבר A647) מדולל ב 1% BSA ב PBS בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות.
הערה: נפח לכל שקופית תלוי בגודל הרקמה אבל הוא בדרך כלל 50-150 μL.- לאחרהוספת נוגדנים משני, לשמור את השקופיות מוגן מפני האור ככל האפשר על ידי אחסון אותם בתיבת כהה או על ידי גלישת התיבה בנייר אלומיניום.
4. הר ו Counterstain רקמות שקופיות
- לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- הר השקופיות באמצעות המדיום הרכבה אנטי דהייה מימית המכילה counterstain גרעיני ( למשל, DAPI). לנתח את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהקדם האפשרי (בתוך שבועיים). אחסן את השקופיות בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח.
5. ניתוח מוכתם רקמות Slides
- השג ארבע תמונות של כל שקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מטרה 20 - 25X. קחו תמונות במקומות אקראיים בכל אזור הגידול הכולל הכלול בשקופית כדי ללכוד חלק מייצג של הגידול.
הערה: יש להשתמש בהגדלה סטנדרטית של 250X. כל פלואורסצנטיR לייזר סריקת מיקרוסקופ ניתן להשתמש, ובלבד יש את המסננים לייזרים צורך לדמיין את fluorochromes בשימוש.- להדמיה של Alexa 488, השתמש מקסימום עירור של 490 ו מקסימום פליטה של 525; עבור ויזואליזציה של Alexa 546, להשתמש מקסימום עירור של 556 ו מקסימום פליטה של 573; עבור ויזואליזציה של Alexa 647, להשתמש מקסימום עירור של 650 ו פליטה מקסימלית של 665; ו להדמיה של DAPI, להשתמש מקסימום עירור של 358 ו מקסימום פליטה של 461.
- שמור את התמונות כמו קבצי תמונה ( כלומר, jpeg ו טיף) בתוכנה הזמינה למשתמש.
- להפלות בין אפיתל הגידול לאזורים stroma הגידול מבוסס על צורות גרעיניות וסלולריות של תאים אפיתל לעומת תאים סטרומה לאחר התייעצות פתולוג.
- כדי לקבוע את השטח הכולל שטח סטרומה, למתוח קו סביב כל השטח (ים) שנכבשו על ידי תאים סטרומה (ולא תאים סרטניים) ו recorד שטח השטח באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המסופקים על ידי היצרן מיקרוסקופ.
- לחץ על הכרטיסייה "שכבה" שמתחת לתמונה; לבחור את "סגור פולי" קו צורה ולחץ על זה. סמן את הגבול בין שדות אפיתל סרטניים ושדות סטרומה על ידי לחיצה על האזור עד להגיע לנקודה הראשונה .; זה מספק מדד לאותו אזור.
הערה: לאחר סגירת הצורה, יופיע מספר ליד הצורה המקיפה את פני השטח של התמונה הנבחרת (A = x מיקרומטר 2 ).
- לחץ על הכרטיסייה "שכבה" שמתחת לתמונה; לבחור את "סגור פולי" קו צורה ולחץ על זה. סמן את הגבול בין שדות אפיתל סרטניים ושדות סטרומה על ידי לחיצה על האזור עד להגיע לנקודה הראשונה .; זה מספק מדד לאותו אזור.
- להחלץ משטח זה משטח השטח הכולל השטח התמונה (בתנאי תכונות תמונה) כדי לחשב את השטח משטח אפיתל. לא לכלול אזורים וסקולריים, נמק, ו autofluorescent על ידי ציור קו סביבם, הקלטה בגודל של השטח המסופק חיסור כי משטח השטח אפיתל.
- שמור את כל שטח השטח מספרים בקובץ גיליון אלקטרוני כדי לחשב את שטח פני השטח הממוצעמספרי טלפון לכל שקופית.
- באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, לקבוע אם התאים הם בודדים, פעמיים, או משולשת חיובית על ידי בדיקת הקרינה של כל ארבעת הערוצים.
- ספירת תאים בודדים, פעמיים, משולשת חיובי בכל תמונה באמצעות ImageJ.
- הורד תמונה. פתח תמונה על ידי לחיצה על "קובץ" ו "פתח" ובחירת התמונה כדי לנתח. לחץ לחיצה ימנית על "נקודת כלי" (ריבוע אדום באמצע ארבע שורות) ובחר את "Multi-Point כלי". לחץ פעמיים על "Multi-Point כלי" ולספור את מספר סוגי תאים שונים בתמונה על ידי בחירת מספר נגד שונים עבור כל סוג התא.
הערה: ספירת כל התאים של כל סוג תא שונה, כפי שזוהו על ידי נוכחות של אחד, שניים, או כל שלושת צבעי ניאון. לא לכלול DAPI, כמו counterstain גרעיני זה נמצא בכל התאים והוא משמש להפלות תאים סרטניים מתאי החיסון. כל סוג תא נספרבאמצעות מספר מונה שונה. ספירת מספרי התא של כל סוג תא בנפרד באזור הגידול אפיתל ו סטרומה על ידי בחירת מספר מונה שונים בכל פעם. אין לספור תאים בתוך כלי הדם באזורים autofluorescent בעיקר. - רשום את מספר התאים שנותחו בכל אחד מהדפים הנגדיים עבור כל תמונה בקובץ גיליון אלקטרוני.
- מחלקים את המספר הכולל של תאים עבור כל סוג תא על פני השטח הכולל של השטח של אפיתל הגידול הגידול stroma ניתח.
- הורד תמונה. פתח תמונה על ידי לחיצה על "קובץ" ו "פתח" ובחירת התמונה כדי לנתח. לחץ לחיצה ימנית על "נקודת כלי" (ריבוע אדום באמצע ארבע שורות) ובחר את "Multi-Point כלי". לחץ פעמיים על "Multi-Point כלי" ולספור את מספר סוגי תאים שונים בתמונה על ידי בחירת מספר נגד שונים עבור כל סוג התא.
- ספירת תאים בודדים, פעמיים, משולשת חיובי בכל תמונה באמצעות ImageJ.
- כדי לקבוע את השטח הכולל שטח סטרומה, למתוח קו סביב כל השטח (ים) שנכבשו על ידי תאים סטרומה (ולא תאים סרטניים) ו recorד שטח השטח באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המסופקים על ידי היצרן מיקרוסקופ.
6. ניתוח סטטיסטי
הערה: יש לנתח את כל הניתוחים הסטטיסטיים עם סטטיסטיקאי כדי להבטיח את איכות הנתונים. לקבלת נתונים סטטיסטיים כלליים, השתמש בכל מדריך סטטיסטיקה רפואית 14 .
- בדוק את המתאמים בין תדרי תאים באמצעות מבחן Rear של קורלציה דרגה של Spearman.
- בדוק את ההבדלים הסטטיסטיים במספרים של cel חיוביLs בין קבוצות המטופלים באמצעות מבחן Wilcoxon Mann-Whitney.
- בדוק את המתאמים בין מספרי תאים לבין הישרדות ללא מחלה ( כלומר, זמן מאבחנה עד להישנות מקומית או רחוקה של מוות או מחלה) על ידי חלוקת החולים בקבוצות בהתבסס על מספר חתוך של תאים באמצעות הדור עקומת קפלן-מאייר ולוג ניתוח דרגה 15.
- בצע ניתוחים רב משתנים באמצעות ניתוח רגרסיה סיכון יחסי Cox.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סדרה של דגימות גידול של FFPE, שהתקבלו בגידולים ראשוניים אוופרינגליים שאובחנו במרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן, ליידן, הולנד בין השנים 1970 ו -2011, שנבחרו כמתואר לעיל (n = 162), הוכתמו באמצעות הפרוטוקול המתואר 13 . אחת לארבע תמונות אקראיות של כל שקופית נותחו ( איור 1 ). כמה תאים autofluorescent מסומנים, אשר ניתן להבחין בבירור על ידי המראה המלא שלהם צהוב. תאים באמת כפול או משולשת חיובי רק כתם חיובי נוגדנים מסוימים בלוקליזציה צפויה, אשר נמצא קרום התא או הגרעין, במקרה זה. שלילי שליטה שקופיות לא להראות שום מכתים ספציפיים מעל autofluorescence רקמות רקע ( איור 2 ו איור 4 ), המאשר כי כל האות הוא ספציפי את המטרות המוכרות על ידי העיקרינוגדנים. כל דגימות הגידול נמצאו מחלחלות על-ידי תאי CD3 + לטווחים שונים. FoxP3 + Tregs תמיד ביטא CD3 ו היו אחת הגדולות חדירה T- תא אוכלוסיות. תאי ה- CD3 המבטאים את IL-17 (תאי ה- TH17) היו אוכלוסיה קטנה של תאי ה- T החודרים. IL-17 לידי ביטוי על ידי CD3 - תאים היה עוד שופע אוכלוסייה תאים חדירים. IL + 17 + FoxP3 + תאים לא היו יותר מ 0.01% של כל התאים + FoxP3.
כל המבחנים הסטטיסטיים היו דו-צדדיים, וערכי p מתחת ל -0.05 נחשבו משמעותיים 14 . מתאמים את הקשר בין מספרים תאיים אפיתלריים או סך הכל הישרדות מוצגים, שכן המתאמים בין מספרי תאים סטרומה או סה"כ הישרדות החולה היו דומים. מספר גבוה של חולי CD3 + T מסתננים הראו מגמה לקשר עם הישרדות משופרת ללא מחלה (0.0)86, איור 5 א ) לעומת מספר נמוך של תאים T ( כלומר, הרביעון הנמוך ביותר). כאשר נבדקו באופן ספציפי חולים עם מספר נמוך של תאי IL-17 + , מספר גבוה של תאי T מסתננים בסך הכל היה קשור עם הישרדות משופרת ללא מחלה (p = 0.012, איור 5 ב ). האפקט הפרוגנוסטי של תאי T חדירים גידולים אובד בקבוצה של חולים עם מספר גבוה של תאי IL-17 + חדירת הגידול (נתונים שאינם מוצגים). לפיכך, ההשפעה של תאים T חדירת T ב OPSCC עשוי להיות קשור למספר הנמוך של IL + 17 תאים קיימים.
איור 1: FFPE סרטן Oroparngeal סרטן רקמה מוכתמת על ידי ארבעה צבעים פלואורסצנטי IHC. תמונה נציג של כתם אימונופלורסנט עבור CD3 ( A , אדום), IL-17 ( B Ong>, ירוק), ו- FoxP3 ( C , כחול), כמו גם את התמונה הממוזגת בשילוב עם DAPI (אפור) ( D ). שני תאים autofluorescent מסומנים על ידי החצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: בקרה שלילית עבור CD3. תמונה מייצגת של רקמת סרטן FFPE אורופרינגל, מוכתמת כמתואר בפרוטוקול, החלפת נוגדן אנטי CD3 עם ארנב Ig נוגדן בקרת איסוטיפ עם ספציפיות לא ידוע. אין מכתים ארנב Ig ( A , אדום) בשילוב עם מכתים עבור IL-17 ( B , ירוק), FoxP3 ( C , כחול), DAPI ( D , אפור) מוצג.2large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: בקרה שלילית עבור IL-17. תמונה מייצגת של רקמת סרטן FFPE Opharyngeal, מוכתמת כמתואר בפרוטוקול, החלפת נוגדן אנטי IL 17 עם נוגדנים Ig איגודיפ שליטה עיגול עם ספציפיות לא ידוע. אין מכתים עבור Ig עיזים ( B , ירוק) בשילוב עם מכתים עבור CD3 ( A , אדום), FoxP3 ( C , כחול), DAPI ( D , אפור) מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
F4: שליטה שלילית עבור. תמונה נציג של רקמת סרטן FFPE Opharyngeal, מוכתמת כמתואר בפרוטוקול, החלפת נוגדן אנטי FoxX3 עם נוגדנים IgG1 IgG1 נוגדן שליטה עם ספציפיות לא ידוע. אין מכתים עבור העכבר IgG1 ( C , כחול) בשילוב עם מכתים עבור CD3 ( A , אדום), IL-17 ( B , ירוק), DAPI ( D , אפור) מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: קפלן-מאייר הישרדות הקימורים. עבור מטופלים עם מספר נמוך של חציון של IL + 17 + / mm 2 , עקומות ההישרדות ללא מחלה מוצגים עבור רמה נמוכה מאוד ( כלומר, הרביע התחתון) לעומת מספר גבוה של טוL תאים ( A ) ו נמוך ( כלומר, מתחת לחציון) לעומת מספר גבוה של סך כל תאי T ( B ) באזור הגידול הכולל. שוחזר באישור של אימונותרפיה לסרטן אימונוטרפיה 13 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבור הפרוטוקול המתואר, אחד הצעדים הקריטיים ביותר היא לקבוע את הדילול הנכון של הנוגדנים העיקריים בשימוש. הדילול של נוגדנים משניים שכותרתו היה 1: 200, כפי שמומלץ על ידי היצרן של אלה נוגדנים ספציפיים שכותרתו Alexa. הדילול של הנוגדנים העיקריים צריך להיקבע על ידי דילול סדרתי, עדיף באמצעות שתי דגימות שונות של סוג הרקמה המיועדת (במקרה זה, OPSCC). דילול העבודה האופטימלי הוא הדילול שבו מתקבל איתות ברור, ללא רעש רקע ובהיעדר אות לבקרה שלילית באותו ריכוז. שינויים ניתן לעשות לגבי סוג של נוגדנים משני בינוני הרכבה בשימוש, בהתאם לסוג המיקרוסקופ זמין העדפה של החוקר. אם התוצאות המיועדות לא יושגו, אנו ממליצים לבדוק את סוג שקופיות הזכוכית בשימוש, כמו כמה ידועים לגרום לבעיות עם אותות רקע עבור סוגים מסוימים של פתרונות מכתים ( למשל, כחול פרמה). שנית, כמה אנטיגנים עשויים להיות משבשים על ידי שימוש באפיטופ epitope המושרה בחום. במקרה זה, החוקר יכול להחליף את שלב החימום של המאגר עם טכניקות אחרות, כגון אחזור האנזים epitope המושרה אנזים. שלישית, אם באמצעות עט הידרופובי, סימון לא צריך להיות קרוב מדי לרקמה, כמו זה ימנע את הפתרון מכתים לעבוד כראוי. לגבי מספר הסעיפים למדגם ומספר התמונות הנדרש לכל סעיף, זה תלוי בחוקר ובשאילתת המחקר הספציפית כדי לקבוע את המספר הנדרש כדי לענות על שאלת המחקר עם כוח סטטיסטי מספיק. לניתוח שלנו, השתמשנו סעיף אחד לכל מדגם וארבע תמונות לכל סעיף. לבסוף, בעת שימוש מכתים immunofluorescent, יש להקפיד בעת שימוש לק לק על מנת לאטום את תלושי לכסות, כמו אלכוהול נוכח הפתרון פולנית מסמר יכול להשפיע על האות ניאון.
"הפרוטוקול המתואר כאן אינו כולל ניתוח תפוקה גבוהה, ניסינו להפוך את השלב הזה לאוטומטי, אבל הפרשנות הסובייקטיבית של גודל הסלולר והמורפולוגיה מסבכת את אוטומציה של הניתוח עם חבילות התוכנה הקיימות באותו זמן. ואת מכתים יכול להיות אוטומטי במידה רבה, ספירת התאים בוצעה באופן ידני.הצלחנו לחקור את המתאמים בין תת-הקבוצות של תאי ה- T המסתננים לבין התוצאות הקליניות באמצעות הפרוטוקול המתואר. נמצא כי מספר גבוה של תאי T נמצא בקורלציה עם הישרדות משופרת ללא מחלה בחולים עם מספר נמוך של תאי IL-17 + שאינם תאי T. הדבר מצביע על כך IL-17 + תאים שאינם T עשויים להיות קשורים תגובה ירודה חיסונית OPSCC, אשר עולה בקנה אחד עם המתאם תאר בין IL-17 ו- הישרדות עניה בקרב חולי סרטן 16.
הופעותתוכנות oved הפכו כעת זמינים מסחרית כדי להפוך את הצעד הזה ועכשיו הם מחליפים את התצפית תא ידני וספירה, אשר יוביל לתוצאות אמין יותר, אובייקטיבי, לשחזור, מהיר.
בנוסף, הזמינות של ערכות מסחריות המאפשר ריבוב של סמנים immunohistochemical ניאון נמצא כרגע במגמת עלייה 17 . זה יאפשר ריבוב של עד 7 סמנים חיסוניים שונים / סמנים ביולוגיים בשילוב עם counterstain גרעיני. עם זאת, אנו מאמינים כי הפרוטוקול המדווח כאן עדיין יהיה יעיל יותר ליישם בקלות במעבדות חסרים תשתית מורכבת ויקרה, מיקרוסקופים, חבילות תוכנה לניתוח מכתים multispectral.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מכריזים על ניגוד אינטרסים מסחרי או כספי.
Acknowledgments
סימון פונט נתמכה על ידי הענקת UL2010-4801 מן האגודה ההולנדית לסרטן. ברצוננו להודות לכל המחברים השותפים של המאמר המקורי כי פרוטוקול זה מבוסס על: אמילי א. דרונקרס, מארי ג'יי.פי וולטרס, רנסקה גודמן, סנאדה קולנוביץ ', אליזבת בלומנה, פיטר ג'ף סנייגרס, ארקו גורט, וסוורד ואן בית Seating
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
