Summary
우리는 초파리 Drosophila melanogaster 에서 짝짓기 행동에 영향을 미치는 환경 및 유전 신호를 분석하는 분석법을 시연합니다.
Abstract
개인의 성행위는 유전자형, 경험 및 환경 조건의 영향을받습니다. 이러한 요인들이 어떻게 상호 작용하여 성적 행동을 조절하는지는 여전히 잘 알려져 있지 않습니다. Drosophila melanogaster 에서는 식량 가용성과 같은 환경 적 단서가 성적 행동을 조절하는 메커니즘을 조사 할 수있는 다루기 쉬운 시스템을 제공하는 교미 활동에 영향을 미칩니다. D. melanogaster에서 , 환경 단서는 종종 화학 감각 기관과 후각 시스템을 통해 감지됩니다. 여기에서는 짝짓기 행동에 환경 화학 신호의 영향을 테스트하는 방법을 제시합니다. 이 분석법은 식품 매체와 짝짓기 커플을 포함하는 작은 짝짓기 경기장으로 구성됩니다. 각 커플의 교미 빈도는 24 시간 동안 지속적으로 모니터링됩니다. 여기서 우리는 가청 공기 시스템을 통해 외부 소스로부터 환경 화합물을 시험 할뿐만 아니라 짝짓기 경기장에서 환경 성분을 직접 조작하는이 분석의 적용 가능성을 제시합니다. 너는가압 에어 시스템은 매우 휘발성 인 화합물의 효과를 테스트하는 데 특히 유용하며, 상대방의 구성 요소를 직접 조작하는 것은 화합물의 존재를 확인하는 데 가치가 있습니다. 이 분석은 유전 적 및 환경 적 단서가 짝짓기 행동과 생식력 및 기타 남성과 여성의 생식 행동에 미치는 영향에 대한 질문에 대답 할 수 있습니다.
Introduction
생식 행동은 일반적으로 남성보다 큰 배우자를 생산하고 개발하는 자손을 키우기위한 조건을 신중하게 선택해야하는 여성에게 특히 높은 에너지 비용을 초래합니다. 에너지 비용 때문에 재생산이 영양 상태와 관련이 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 이것은 포유류를 포함한 대부분의 동물에서 마찬가지입니다. 포유 동물은 영양 부족으로 사춘기가 늦어 질 수 있으며 성행위가 식량 제한으로 인해 부정적인 영향을받을 수 있습니다 1 .
유전 모델 유기체 Drosophila melanogaster 의 번식은 영양 상태에 의해서도 영향을받습니다. 식품 휘발성이의 존재에 높은 수준의 남성 코트, 그리고 여성보다 성적 효모, 계란 생산 및 자손의 생존 3, 4, 5의 주요 영양소의 존재에 수용된다. 이진화 보존 된 식품에 대한 생식 적 반응은 환경 친화적 인 식품 이용 가능성을 유 전적으로 다루기 쉽고 시간이 절약되는 유기체에서 성 생식에 연결시키는 메커니즘을 연구 할 기회를 제공합니다. 실제로 D. melanogaster 에서의 연구는 인슐린 경로가 음식과 교미 행동 사이의 연관성에 대한 중요한 조절 자라는 것을 의미합니다 6 . 또한 자체를 정합하는 단계는 암컷의 음식 선호도뿐만 아니라 관련된 화학 감각 뉴런 7, 8, 9를 변경하는 것으로 나타났다.
D. melanogaster 에서 음식 단서가 생식 행동에 영향을주는 것은 분명합니다. 이러한 효과는 주로 여성, 특히 이미 5를 짝 지어 준 여성에게 영향을 미치는 것으로 보입니다. 그러나 환경 조건의 급성 영향을 시험하기 위해 여성의 행동에 고전적으로 사용되는 분석법이짝짓기 에피소드 간의 오랜 중단으로 인해 적합하지 않습니다. 클래식 remating 분석에서 처녀 여성 먼저 남성과 짝짓기, 즉시 격리하고 새로운 남성과 함께 24 ~ 48 시간 후에 제공됩니다. 이 고전적 분석법은 여성의 행동과 여성 반응을 수정하는 남성 사정의 구성 요소를 확인하는 데 큰 성공을 거두었습니다 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . 따라서 여기에서 입증 된 연속 교미 분석은 재생산 행동에 대한 환경 조건의 급성 효과를 연구하는 데 사용할 수있는 고전적 교미 분석법에 추가 된 것입니다.
여기에 설명 된 짝짓기 행동에 대한 연속 분석법을 사용하여 이전에 효모에 노출 된 한 쌍의 파리가24 시간 관찰 기간 5, 19, 20, 21 배 이상 everal, 파리만이 remate 한번 음식 (5)에 노출되지 않는 상태. 이 발견은 D. melanogaster 문헌의 많은 부분에 비추어 수수께끼 일 수 있습니다 . 암컷은 초기 교미 후 며칠 동안 remate하지 않는다는 것을 나타냅니다 (참고 문헌 10 , 11 에서 검토 됨). 그러나 이러한 불일치는 새로운 교미 기회가 제공되기 전에 암컷이 1 일에서 며칠 동안 격리 된 분석 조건에 의해 쉽게 설명 될 수 있습니다. 쌍이이 1 시간의 관측 기간에 짝짓기하지 않으면 암컷은 감수성이없는 것으로 특징 지어진다. 더욱이, 야생 잡힌 파리의 자료에 따르면 암컷에 저장 기관에 4 ~ 6 마리의 수컷이 들어있는 정자가 있다는 것을 감안할 때, 높은 교미 빈도는 놀랄만 한 일이 아니어야한다. 따라서여성 자연스럽게, 23 차례 (22) remate 것을 dicating.
여기에서 우리는 파리가 어떻게 모여지고 환경 조건에 대한 정보를 결합하여 짝짓기 빈도를 조절하는지에 대한이 연속 교배 분석법의 사용을 입증합니다. 이 분석을 통해 유전자 연구를 위해 비교적 많은 수의 교미 부부를 시험하고 휘발성 및 비 휘발성 환경 단서의 영향을 시험 할 수 있습니다. 이 분석은 일반적으로 24 시간 동안 실행되지만 48 시간까지 연장 될 수있어 명암주기 (light-dark, LD)주기와 같은 사이클링 환경 큐를 테스트 할 수 있습니다. 우리는 식품 기질에서 비 휘발성 효모 영양소의 가용성과 함께 가압 공기 시스템 내에서 효모 배양으로부터 휘발성 신호의 영향을 시험함으로써이 분석을 입증합니다.
가압 공기 시스템은 지속적으로 휘발성 큐를식품 기질 및 시험 커플 (그의 교미 행동이 모니터 됨). 효모가 짝짓기에 영향을주는 세부 사항을 더 결정하기 위해, 우리는 효모의 주요 휘발성 화합물, 즉 아세트산 24 를 펩톤 (아미노산)의 형태로 식품 기질의 효모에 상응하는 아미노산 함량과 함께 시험한다 동물성 단백질의 효소 소화에서 유래 된 산). 이 실험들은 함께 D. melanogaster 의 교미 작용에 대한 환경 신호의 영향이이 분석법으로 시험 될 수 있음을 보여줍니다.
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Protocol
1. 환경 제어 짝짓기 상자
- 제어가 쉽고 청소가 쉬운 테스트 영역을 확보하려면 그림 1A와 같이 120cm x 64cm x 85cm 크기의 스테인레스 스틸 주방 캐비닛을 설치하십시오.
- 천장 바로 아래의 캐비닛 뒤쪽에 구멍 하나와 양쪽에 직경 4cm의 구멍 4 개를 뚫습니다 (직경 2cm). 상자의 양쪽에서 4 개의 구멍의 처음 두 세트를 상자 바닥에서 7 cm 높이와 구멍 사이에 12.5 cm 높이로 뚫습니다. 상자의 각면에있는 다른 두 세트를 바닥에서 35cm 높이로 뚫습니다.
참고 : 카메라 전원 케이블과 공기 펌프 튜빙에 캐비닛을 출입 할 때 4 개의 구멍 4 개가 사용됩니다. 후면의 구멍은 조명 보드의 전원 케이블에 사용됩니다. - 각각의 light 사이에 2.5 cm 간격의 백색 및 적색 LED (light-emitting diodes)를 교대로 배치 한 40 개의 열이있는 조명 보드를 제작하십시오.전원 공급 장치. 각 LED를 560Ω, 0.25W 및 5 % 허용 오차의 저항과 직렬로 연결하십시오.
참고 : 적색 광선의 방출 파장은 590-661 nm에서 627 nm에서 날카로운 피크를 긋습니다. 실험 영역에서 결과로 나오는 광도는 약 900 럭스이며 두 개의 라이트가 켜져 있고 90 럭스는 빨간 불이 켜져 있습니다. 이것은 스마트 폰 광도계 앱을 사용하여 측정되었습니다. - 조명 보드를 스테인레스 스틸 캐비닛 상단에 연결하고 전원 케이블을 후면 구멍에 통과시킵니다.
- 백색 LED의 어댑터를 전원 제어 타이머에 연결하여 어두운 어두운 단계에서 백색 LED를 끌 수 있습니다. 파리의 25 번 광속 인 빨간불의 어댑터를 일반 전원 공급 장치에 연결하여 실험 기간 동안 계속 켜두십시오.
- 너비가 0.5cm 인 110cm 및 54cm 길이의 금속 브래킷 중 하나를 높이 50의 상자 안쪽에 고정하십시오상자 바닥에서 cm. 이 브래킷에 젖빛 유리 확산 판 (119.0cm x 54.5cm x 0.5cm 크기)을 놓습니다.
- 라이트 보드와 유리 플레이트 사이에 필터 종이 (120cm x 50cm) 3 층을 추가하여 빛을 확산시키고 상대방 경기장 표면의 눈부심을 제한하십시오 (4 절 참조). 자석을 사용하여 120cm 길이의 나무 막대에있는 긴 쪽 가장자리에 두 개의 종이 종이를 서로 붙여서 금속 캐비닛의 내부에 붙이십시오. 이 동작을 3 번 수행하십시오.
- 상자 측면에 4 개의 팬을 연결하여 연속적으로 짝짓기 상자를 뚫는 공기 흐름을 만드십시오. 라이트 보드에 의해 생성 된 열의 축적을 최소화하기 위해 라이트 보드와 유리 플레이트 사이에 8cm 팬의 첫 번째 세트를 부착하십시오. 왼쪽 입구에 공기 유입구가 있고 상자 오른쪽에 배출구가 있습니다.
- 캐비닛 바닥의 25cm 위에 12cm 팬 두 번째 세트를 부착하여 i를 배출하는 외부 공기 흐름을 만드십시오.캐비닛의 옆면과이를 안정적인 26 ° C로 식 힙니다. 배기 측의 팬을 흡입 호스에 연결하고 공기 스트림을 실내에서 배출하여 캐비닛의 공기 순환을 방지하십시오.
- 천장 바로 아래의 캐비닛 뒤쪽에 구멍 하나와 양쪽에 직경 4cm의 구멍 4 개를 뚫습니다 (직경 2cm). 상자의 양쪽에서 4 개의 구멍의 처음 두 세트를 상자 바닥에서 7 cm 높이와 구멍 사이에 12.5 cm 높이로 뚫습니다. 상자의 각면에있는 다른 두 세트를 바닥에서 35cm 높이로 뚫습니다.
- 스탠드 바닥에서 28cm와 30cm의 두 개의 클램프로 2 개의 스탠드 (높이 약 48cm)를 설치하십시오. 각 클램프에 웹캠을 고정하십시오. 4 대의 카메라를 모니터링 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결하십시오.
- 각 웹캠 아래에 A4 용지를 놓습니다. 짝 지어지는 경기장 (4 절에서 설명)을 수용 할 수 있도록 인쇄되지 않은 흰색 시트 또는 4cm 축이있는 7x5 격자의 사전 번호가 지정된 격자가있는 시트를 사용하십시오.
참고 : 78 ° 광각보기 및 5 백만 픽셀 해상도의 HD 웹캠 카메라는 21 cm x 30 cm의 영역을 A4 용지에 해당하고 20-35 개의 경기장 사이를 모니터 할 수 있습니다.
2. 비행 사육 및 수집
- 20 명의 남성과 20 명의 여성 야생 형 캔톤 -S 장소3 ~ 4 일 동안 45 mL의 풍부한 파리 식품 배지 (섹션 3 참조)가 들어있는 비행 조급 병으로 날아갑니다. 같은 성인을 처음으로 세 번 누른 다음 신선한 병에 넣고 세 번 옮기십시오.
- 25 ° C에서 배양기에 병을 놓고 12 시간 : 09:00에 빛이 켜지는 12 시간의 명암주기 (Zeitgeber time (ZT) 0). 새로운 세대는 약 10 일 후에 나타날 것입니다.
- 5 분 이내에 더 이상 이산화탄소 패드에 새롭게 부화 된 파리를 마취하고 페인트 브러시로 파리의 음식병에 모으십시오.
- 야생형 Canton-S 스톡 병에서 처녀 (새롭게 출현 한) 암컷과 처녀 남성을 2.5cm x 9.5cm 크기의 파리 제트 약병에 6.5mL의 풍부한 파리 식품을 넣으십시오.
- 25 ° C 및 12 시간 : 5 시간에서 8 일간 파리 주유 약병에서 각각 20 마리의 파리를 동성 집단으로 파리 시키며, 12 시간의 명암주기와 9:00에 점등됩니다 (ZT 0).
- Transf실험 전 날에 날아 다니는 파리를 신선한 파리를 키우는 약병으로 옮겨라.
3. 식품 매체 준비
- 다음과 같이 1L의 부유 한 배지를 준비한다.
- 자기 교반 막대가있는 2 L 유리 비이커에 수돗물 1 L를 부어 자석 가열판에 놓습니다. 교반을 멈추고 끓는 온도에 도달 할 때까지 가열을 300 ° C까지 돌립니다.
참고 : 다음 단계에서 장시간 끓이는 동안 물의 비율이 증발하지만 첨가 된 성분과 함께 약 22 ° C의 실내 온도에서 준비 할 때 1 L의 부유 한 배지가됩니다. - 분당 500 회전으로 켜고 다음 재료를 끓는 물에 넣는다 : 한천 10g, 포도당 30g, 수크로오스 15g, 밀가루 옥수수 15g, 밀 배아 10g, 콩가루 10g, 콩 가루 30g 당밀, 활성 건조 효모 35g. 효모가 격렬하게 거품이 생길 때까지 기다린 다음 핫 플레이트 온도를 내립니다.120 ° C까지 고온.
- 10 분 후 30 ℃로 핫 플레이트를 내리고 48 ℃로 냉각 될 때까지 혼합물을 저어줍니다. 음식에 온도계를 직접 삽입하여 온도를 모니터링하십시오.
- 96 g 에탄올 10 mL에 p- 히드 록시 벤조산 메틸 에스테르 2 g (tegosept, 100 %)을 녹인다. 이것을 1M 프로피온산 5 mL와 혼합한다. 3 분 동안 저어 준다.
- 파리 식품 매체를 경기장 (4 절에서 설명)에 부어 경기장 바닥에 0.3cm 두께의 층을 만듭니다.
- 쏟아지는 데 200mL 유리 비이커를 사용하십시오. 정확한 양이 중요 할 때, 10 ML 혈청 피펫을 사용하십시오.
- 자기 교반 막대가있는 2 L 유리 비이커에 수돗물 1 L를 부어 자석 가열판에 놓습니다. 교반을 멈추고 끓는 온도에 도달 할 때까지 가열을 300 ° C까지 돌립니다.
- 3.1.1에서 3.1.5까지 설명 된대로 정확하게 배지에서 효모를 빼내고, 3.1.2에서 효모를 제거하십시오.
- 끓는 물 1L에 10g 한천과 펩톤 35g을 혼합하여 펩톤이 있거나없는 한천 배지를 준비하고 3.1.4 ~ 3.1.5 단계를 수행한다.
4. 마틴g 투기장 준비
- 가열 준비 바늘 (분젠 버너에 적색으로 가열 됨)을 사용하여 3.5cm x 1.0cm 플라스틱 페트리 접시의 윗면에 직경 약 0.3cm의 구멍을 뚫습니다. 또는 납땜 인두를 사용하십시오.
- 냄새가 나는 화합물로 음식물을 준비 할 때, 첫 번째 피펫은 30 분 동안 실험 요리의 절반을 위해 접시에 원하는 화합물의 최종 식품 매체 (예 : 아세트산 빙하 100 %)의 1 %를 피펫. 비교를 위해 나머지 절반은 비워 두십시오.
참고 : 여기에 설명 된 설정을 사용하면 최대 140 개의 경기장을 한 번에 테스트 할 수 있습니다. - 10 ML 혈청 피펫을 사용하여 원하는 화합물의 위에 접시의 바닥에 식품 매체 3 ML을 부어. 오염을 방지하기 위해 치즈 헝겊으로 덮고 상온에서 약 1 시간 동안 고형물을 고화시킨 채로 두십시오.
- 접시에 뚜껑을 놓고 양면에 각각 테이프를 둡니다. 작은 파라핀 필름 플러그를 준비하여 구멍을 막습니다.파라핀 필름 조각을 0.2cm 두께의 롤에 롤링 한 후 0.5cm 세그먼트로 자른다.
5. 냄새에 대한 누룩 문화
- 14.0 cm x 2.06 cm 배양 접시에서 효모 추출물 펩톤 덱스 트로 오스 (YPD) 한천에 건조 활성 효모를 재배하십시오. 이 단계에서 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오.
- 끓는 초순수 1 L에 효모 추출물 10 g, 펩톤 20 g, 포도당 (0 (+) - 포도당 1 수화물) 22 g 및 한천 (순수한) 15 g을 넣고 YPD 한천 접시를 준비합니다. 모든 것이 녹 으면 페트리 접시의 바닥에 놓고 4 ° C의 냉장고에 거꾸로 뒤집어서 최대 2 개월 동안 보관하십시오.
- 건조한 효모의 몇 알갱이를 YPD 배지에 뿌려서 녹인다. 그런 다음 멸균 루프를 사용하여 중간 플레이트를 줄무늬. 밤새 30 ° C 배양기에 접시를 보관하십시오. 그런 다음 문화를 1 주일 이상 냉장고에 보관하십시오.
- YPD 액체 배지 준비효모 추출물 10g, 펩톤 20g, 포도당 (0 (+) - 포도당 1 수화물) 22g 및 교반 막대를 1L의 초순수에 가하여 1L 병에 넣는다.
- 120 ° C 및 1 bar 압력에서 25 분 동안 오토 클레이브하십시오. 그 다음에 병을 4 ℃에서 보관할 때까지 최대 2 개월 동안 보관하십시오.
- 0.32 cm 두께의 실리콘 격막이있는 열린 병 뚜껑 (4.5 cm)을 장착하십시오.
- 격벽에 2 개의 작은 구멍을 잘라 미늘 모양의 벌크 헤드 피팅에 꼭 맞 춥니 다. 병을 나가는 출구와 병에 들어가는 입구 중 하나에 작은 폴리 염화 비닐 (PVC) 튜브 (직경 0.8 cm 및 내부 0.5 cm)를 부착하십시오. 그림 1B를 참조하십시오.
- 120 ° C 및 1 bar 압력에서 25 분 동안 알루미늄 호일과 오토 클레이브에 장착 된 캡과 튜빙을 싸십시오.
- 이 단계에서 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오. YPD 한천 접시에서 효모 식민지 중 하나에 멸균 100 μL 피펫 팁을 딥 (D 조5.1에서 설명)을 넣고 오토 클레이브 된 YPD 액체 배지 병에 떨어 뜨립니다.
- 이 yeast-inoculated YPD 액상 배지뿐만 아니라 in-outlet과 outlet을 가진 오토 클레이브 캡 (단계 5.3 참조)이있는 YPD medium control bottle (효모가 첨가되지 않음)을 캡핑하십시오. 별도의 자성 접시에 두 병을 넣고 효모 배양을 허용 실험의 시작하기 전에 24 시간 상온에서 100 rpm으로 저어.
- 두 병의 입구를 연결하여 효모 배양에 공기를 공급하는 수족관 펌프를 분리하십시오. 실험에 방해가되지 않도록 실험실에서 효모 냄새를 배출하는 튜브에 실험 효모 병의 콘센트를 연결하십시오.
6. 공기 펌프 설정
- 큰 PVC 튜빙 (지름 : 외부 1.2 cm 및 내부 0.9 cm)을 압축 공기 공급 장치에 연결하고 활성탄으로 채워진 2 개의 1 L 유리 삼각 플라스크를 통해 800 mL공기를 정화하는 라인. 실험실에서 일반적으로 공급되는 가압 공기를 공기 공급 장치로 사용하거나 공기 펌프에 연결하십시오 (여기에서는 가압 공기를 사용했습니다).
참고 : 배관 재료는 휘발성 물질의 화학적 성질에 따라 선택되어야하며 휘발성 물질이 튜브의 라이닝 (예 : 폴리 테트라 플루오르 에틸렌, 나일론 또는 스테인리스 강)에 달라 붙지 않도록 시험해야합니다. - 15 ML 튜브와 각 1,000 μL 피펫 팁에서 두 공기 분배기를 확인하십시오.
- ~ 1cm 직경의 3 개의 구멍을 만드십시오. 먼저 가열 된 준비 바늘 (분젠 버너에서 가열 된 적색)을 사용하여 2 개의 구멍을 구우십시오. 15 mL 튜브의 뚜껑 바로 아래에서 서로 인접 해 있습니다. 그런 다음 튜브의 바닥을 제거하여 세 번째 구멍을 만드십시오.
- 좁은 끝이 바깥 쪽을 향하도록 구멍에 1,000 μL 피펫 팁을 붙입니다. 더 큰 공기 흐름을 허용하기 위해 피펫 팁 끝을 자릅니다.
- c의 콘센트에서 대형 PVC 튜빙을 연결하십시오.15 ML 튜브의 하단에있는 피펫 팁에 harcoal - 가득한 삼각 플라스크. 두 개의 수평 피펫 팁에 작은 PVC 튜빙 콘센트를 추가하고 컨트롤과 실험 병쪽으로 그들을 안내하십시오.
- 미생물이있는 YPD 배지의 오염을 막기 위해 작은 튜브를 필터쪽으로가는 벌크 헤드 튜빙 커넥터의 플라스틱 밀어 넣기와 필터를 떠나는 플라스틱 벌크 커넥터의 나사를 사용하여 살균 주사기 필터 (0.45 μm 구멍 크기)에 부착하십시오. 그런 다음 튜브를 YPD 배양기 입구에 연결하십시오 ( 그림 1B 참조).
- 부유 효모가 배양 플라스크에서 실험장으로 이동하지 못하도록 작은 튜브를 사용하여 각 YPD 배양 병의 출구에 유리 튜브 (길이 6.5cm, 외경 = 0.5cm 및 내경 = 0.3cm)를 부착하십시오. 유리 튜브의 다른쪽에 PVC 튜브를 연결하고 실험 상자의 아래쪽 구멍 (각 측면에 구멍이 뚫려 있음)쪽으로이 튜브를 연결합니다.
- 튜브를 유리 섬유로 채우고 사용하기 전에 고압 멸균하십시오.
- 실험 상자의 양쪽에있는 소형 PVC 튜빙에 다른 15 mL 튜브 스플리터 (섹션 6.2에 설명 됨)를 추가하여 실험 측면 (팬 공기 흐름의 배출에 가장 근접) 및 제어 측면 (팬 공기 흐름의 입구에 가장 가깝게, 왼쪽).
- 동시에 80 개의 짝짓기 커플을 테스트 할 수있는 10 개의 콘센트가있는 8x 25 mL 혈청 형 피펫을 준비하십시오 ( 예 : 각 공기 상태마다 40 개).
- 피펫에 ~ 0.8cm 직경, 2cm 간격으로 10 개의 구멍을 구울.
- 1 mL 주사기의 바깥 부분을 하나의 작은 (2.5 cm) 콘센트와 하나의 큰 (5 cm) 콘센트로 자릅니다.
- 핫 아교로 구멍에이 아울렛을 붙입니다.
- 콘센트의 끝 부분에 플라스틱 파라핀 필름의 작은 밴드를 감싸고 1,000 μL 피펫 팁을 부착하십시오. 팁 입구의 직경은 0.1cm입니다. 각 실험마다 팁을 사용하십시오.
- 외경이 ≥0.5 cm이고 작은 PVC 튜브가 짧은 T- 스플리터를 사용하여 양측의 두 콘센트에 각각 두 개의 혈청 형 피펫을 부착합니다. 흰 종이 시트에 피펫을 평평하게 붙이십시오 (스틸 상자의 카메라 아래).
- 공기 유량 모니터를 사용하여 1000 μL 피펫 팁의 출구에서 공기 속도가 0.5 m / s가되도록 공기 흐름을 설정하십시오. 이는 팁당 0.0017 L / s의 공기 흐름에 해당합니다.
7. 짝짓기 행동의 모니터링
- 입 피펫 (참조 26에 설명 된대로)을 사용하여 한 실험용 여성을 15시 방향 (ZT 6)에 작은 페트리 접시 (4 절에서 설명)에 넣고 그녀에게 1 시간을 주어 짝 지어주는 경기장에 순응시킵니다.
- 실험 상자 (1 절에서 설명)를 다음과 같이 설정합니다.
- 조명을 켭니다. 즉 , 12h : 12h 밝음 - 어두운 사이클의 흰색 표시 등 LED가 켜지면 타이머에 연결됩니다.09:00 (ZT0)의 밝음과 연속적인 적색 LED가 실험의 어두운 단계에서 파리를 모니터링 할 수 있습니다. 팬을 켜서 광원에 의한 캐비닛의 가열을 제한하고 과도한 냄새가 테스트 영역 바깥으로 배출되도록하십시오.
- 웹캠 카메라를 컴퓨터에 연결하고 사진 모니터링을위한 모니터링 소프트웨어로 컴퓨터를 시작하십시오.
- 각 카메라에 대해 모니터링 소프트웨어에서 초점, 밝기 및 확대 / 축소를 설정하십시오.
- 카메라 화면에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 "카메라 속성"을 연 다음 "자동 초점"을 클릭 해제하십시오. 그리드 또는 종이에 쓰여진 단어를 명확히하기 위해 "포커스"를 조정하십시오. 필요한 경우 "밝기"및 "확대 / 축소"를 변경하십시오.
- 2 분마다 1 장의 사진을 캡처하도록 모니터링 소프트웨어의 프로그램을 설정하십시오. 각 카메라 화면을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "카메라 편집"을 선택한 다음 "작업"옵션을 선택하십시오. 액션을 시작하려면 클릭하십시오 "at regular intervals "를 선택하고 시간을"2 분 "으로 변경하십시오. 수행 할 작업을 선택하고"ok "를 클릭하십시오.
- 각 카메라 화면을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "모니터링 시작"을 선택하십시오.
- 1 시간 후 (ZT 7시), 구강 피펫을 사용하여 페트리 접시에 야생형 남성을 옮기고, 웹캠 카메라 아래 A4 접시에 접시를 놓고 24 시간 동안 "모니터링 시작"을 클릭하십시오. 공기 펌프 실험을 위해 피펫 출구가 상대방 경기장의 입구 구멍에 연결되도록 접시를 놓으십시오.
- 부부의 짝짓기 행동을 분석하려면 다음을 수행하십시오.
- 이미지보기 소프트웨어에서 모든 사진을 선택하여 열어 페이지를 순서대로 표시합니다.
- 날짜, 실험 번호, 요리 번호 및 시작 시간을 같은 행의 스프레드 시트에 기록하십시오. webca 아래 놓인 순간부터 각 경기장의 시작 시간을 가져라.m 카메라. 사진에서 타임 스탬프를 기록하십시오.
- 같은 행에있는 각 교미의 시작 시간을 스프레드 시트에 표시하십시오. 수컷이 암컷을 거치고 커플이 적당히 고정되어 있고 적어도 5 연속 프레임 (10 분) 동안 같은 자세로있을 때 짝짓기를 사건으로 간주하십시오.
참고 :이 기준은 D. melanogaster 에서 12 분에서 27 분 사이의 교미 기간과 10 분 이상 교미가 비옥 한 관측 결과를 기준으로합니다 27 , 28 . - 짝짓기 빈도를 결정하기 위해 스프레드 시트의 각 행에 대한 교배 수를 세십시오. 또는 짝짓기 대기 시간의 측정으로 각 행의 첫 번째 짝짓기 시간에서 실험의 시작 시간을 빼거나 지연 대기 시간의 측정으로 두 번째 짝짓기 시간에서 첫 번째 짝짓기 시간을 뺍니다.
- 지연 시간을 계산하려면 다음을 수행하십시오.첫 번째와 두 번째 짝짓기 날짜를 스프레드 시트 소프트웨어에서 연속 일로 정의하십시오.
- 데이터의 정규 분포를 가정하고 임의의 요인으로 실험 날짜를 포함하여 혼합 효과 모델을 사용하여 데이터를 분석하고 통계 소프트웨어 (재료 표 참조)를 사용하여 독립 변수의 통계적 중요성 - 식품 매개체, 공기 유형 및 상호 작용 - 이전에 설명한 바와 같이 5 .
- 로그 가능성 (log-likelihood) 비율 테스트 및 관련 Akaike 정보를 사용하여 중요하지 않은 독립 변수를 역방향으로 제거하여 가장 잘 설명 할 수있는 모델을 선택하십시오. 모델을 실행 한 후 데이터 잔차를 육안으로 검사하여 정상을 확인합니다. Levene의 테스트를 사용하여 분산의 균질성을 확인하십시오. 동일하지 않은 균등성의 경우, 제곱근은 데이터를 변환합니다.
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Representative Results
이 연속 분석법을 사용하여 실험적 환경 조건 하에서 교미 행동 및 특정 주파수에서의 교미 빈도를 결정할 수 있습니다. 환경 조건을 제어하기 위해 우리는 스테인리스 스틸 주방 캐비닛을 자체 광원 및 확산 장치를 사용하여 테스트 영역으로 변형 시켰습니다.이 캐비닛은 결합 영역의 상단에서 높은 광량과 눈부심을 보장합니다 ( 그림 1A ) . 내부 테스트 영역은 헥산이나 에탄올과 같은 유기 용제로 세척 할 수있는 스테인리스 스틸과 유리로 완전히 덮여 있습니다. 또한 캐비닛에는 튜빙 용 입구 역할을하는 구멍이있어 압축 공기 시스템의 휘발성 큐를 가져옵니다 ( 그림 1A 및 1B 참조). 효모 냄새에 맞게 조정 된 가압 공기 시스템은 4 개의 피펫 스플리터를 통해 시험장에 들어가기 전에 액체 효모 배양을 통해 안내되는 기류로 구성됩니다.각각 10 개의 콘센트 ( 그림 1C ). 전체 시스템은 밀폐되어 있으며, 효모 배양에 들어가기 전과 후에 여러 가지 입자 필터가 장착되어 혼란스러운 냄새 ( 그림 1B )로 인한 오염을 최소화합니다.
이 분석의 사용을 입증하기 위해, 우리는 효모 배양 물에서 휘발성 큐가 짝짓기 행동에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 공기는 24 시간 동안 액체 이스트 배양액을 통해 버블 링되었고 공기 배출구는 각 짝 지어주는 경기장의 입구에 배치되었습니다 ( 그림 2A 참조). 짝짓기 경기장의 절반에는 효모 (식품 + 효모)가 함유 된 플라이 음식이 들어 있고 나머지 절반에는 효모가 첨가되지 않은 플라이 음식 (식품 효모)이 들어 있습니다. 야생형 수컷과 암컷은 외부 효모 배양에서 유래 된 악취에 노출되었고, 그들의 교미 빈도가 기록되었다. 그래프로 표시된 결과를 설명하는 데 필요한 변수를 확인하기 위해 포함되거나 제외 된 혼합 효과 모델을 실행했습니다.식품 매개체, 효모 공기 및이 둘의 상호 작용에 대한 독립적 인 변수를 제공합니다. 그림 2B 의 데이터는 식품 매개체 (p = 0.001)와 효모 대기 (p = 0.061)의 독립 변수를 포함하는 모델로 가장 잘 표현되지만 상호 작용 효과를 설명하지는 않습니다. 효모 대기 변수가이 전체 데이터 세트에서 중요하지 않더라도 결과를 설명 할 필요가 있습니다. 식품 매개체로 분리 된 효모 공기의 분석은 식품 매체 (공기 : p = 0.992)에 존재하는 효모가 없을 때 교미 부부가 효모 냄새에 반응하지 않는 것을 보여 주지만, 효모가있을 때 효모 공기의 교미 빈도를 증가시킵니다 또한 식품 배지 (공기 : p = 0.018)에 첨가 하였다. 함께, 이러한 결과는 식품 매체 조건과 함께 환경 악취의 영향을 시험하기위한 가압 공기 시스템의 적용 가능성을 입증합니다.
우리는 또한 가압 공기 시스템이 어떻게 수행 될 수 있는지 보여줍니다시험장에 직접 환경 화학적 단서를 추가하면됩니다. 특정한 효모 화합물이 교미 빈도에 영향을 미치는지를 입증하기 위해 효모의 아미노산 함량이 효모가 한천에 공급하는 아미노산에 상응하는 펩톤 (가수 분해 된 단백질)의 복용량을 배치함으로써 교미에 미치는 영향에 필수적이라는 가설을 시험했다 매칭 아레나를 라이닝하는 기판. 우리는 또한 교미 빈도를 높이기 위해 효모의 주요 휘발성 발효 산물 중 하나 인 아세트산의 필요성을 테스트했습니다. 이것은 식품 매체에 아세트산을 직접 첨가하여 이루어졌습니다. 야생형 남성과 여성은 아세트산이 포함되거나 포함되지 않은 펩톤이 함유 된 한천 또는 한천을 함유 한 경기장에서 식품 배양액에서 직접 테스트를 받았다 ( 그림 3B ). 이것은 아주 간단한 음식 매체와 빈약 한 환경을 만듭니다. 따라서 평균 교미 빈도도 그림 2B와 비교하여 감소합니다. 그림 3B 의 데이터는식품 매개체 (p = 0.002), 아세트산 공기 (p = 0.001), 두 가지 상호 작용 (p = 0.022)의 독립 변수. 여성 수용체는 아세트산이 존재할 때 증가하지만, 펩톤이 배지에 존재하는 상태에서만 증가합니다. 이것은 파리가 짝짓기 빈도를 증가시키기 위해 아미노산과 아세트산을 동시에 감지해야 함을 보여줍니다 ( 그림 3B ). 이것은 시험장에 냄새가 나는 화합물을 직접 추가하면 짝짓기 행위에 영향을 미칠 수 있으며 이러한 영향은 매우 간단한 환경 조건에서 감지 될 수 있음을 보여줍니다.
그림 1 : 효모가있는 실험용 박스 및 압축 공기 시스템의 다이어그램. ( A ) 섹션 1에서 설명한 환경 제어 짝짓기 상자의 개략도. 주석이 달린 숫자와 화살표의 설명 : 1. al 흰색과 붉은 빛을 ternating; 2. 작은 팬; 3. 3 층의 여과지, 2 층의 여과지로 구성된 각 층; 상자의 3면에 부착 된 브래킷 위에 놓인 유리 확산 판; 5. 큰 팬; 6. 관과 케이블을위한 구멍; 7. 실험 지역; 큰 화살, 유리 접시에 50cm; 가운데 화살표, 케이블 구멍 높이 35cm; 작은 화살표, 튜빙 구멍 용 높이 7cm. ( B ) 섹션 5, 6.4 및 6.5에서 설명한대로 공기 흐름과 액체 효모 문화의 도식 그림. 주석이 달린 번호의 설명 : 1. 일회용 필터 유닛; 2. 실리콘 셉텀과 아웃 및 인렛이있는 캡; 액체 매질; 및 4. 유리 섬유와 유리 튜브. ( C ) 6.7 절에 설명 된 공기 배출구의 개략도. 주석이 달린 숫자의 설명 : 1. 혈청 피펫; 2. 1 mL 주사기에서 자른 튜브 및 3. 1,000 μL 피펫 팁.target = "_ blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 효모 냄새는 식품 기질에서 효모의 존재 하에서 여성 수용성을 증가시킵니다. ( A ) 입구 구멍을 통해 들어가는 그림 1C의 공기 출구에서 한 남성과 한 여성과 피펫 팁을 가진 교배 경기장의 개략도. ( B ) Canton-S 교배 빈도에서 효모가 있거나없는 효모 악취에 대한 반응 빈도를 플라이 식품 배지 (식품 - 효모 : 중간 공기 n = 12, 효모 공기 n = 13 및 식품 + 효모 : 중간 공기 n = 24, 효모 공기 n = 23). SEM 오차 막대와 독립 변수로 공기를 사용하고 각 식품 매체에 대한 임의의 변수로 날짜를 독립적으로 포함하는 혼합 효과 모델의 통계 출력을 가진 선형 그래프. 주요 통계l 모델은 음식 (p = 0.001)과 누룩 공기 (p = 0.061)를 포함한다. 참고 문헌 5 에서 수정 됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 플라이 음식 기질의 아세트산은 펩톤 존재 하에서 여성 수용성을 증가시킵니다. ( A ) 아세테이트 산을 함유 한 플라이 음식물과 진입 구멍을 막는 플라스틱 파라핀 필름 플러그가있는 결합 경기장의 개략도. ( B ) 한천 또는 펩톤 배지 (아세아 : - 아세트산 n = 52, + 아세트산 n = 40 및 펩톤 : - 아세트산)에서 아세트산에 대한 반응으로 Canton-S 교배 쌍의 교미 빈도를 그래프로 나타낸다. n = 28, + 아세트산 n = 25). SEM 오류 막대 및 통계가있는 선 그래프식품 매개체 (p = 0.002), 아세트산 공기 (p = 0.001), 식량 공기 (p = 0.022)를 독립 변수로 사용하고 혼합 변수 모델을 확률 변수로 사용한 통계적 결과 참고 문헌 5 에서 수정 됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 짝짓기 커플이 짝짓기 빈도를 결정하는 데 사용하도록 가정 된 환경 신호를 지속적으로 제어하면서 24 시간 동안 짝짓기 행위를 테스트하는 분석을 설명합니다. 배지에 효모가 들어있을 때 가압 공기 시스템을 통해 전달되는 효모 공기에 반응하여 결합 빈도를 높일 수 있습니다 ( 그림 2B ). 또한 짝짓기 빈도의 비슷한 반응은 배지에서 한천, 펩톤 및 아세트산 냄새만을 포함하는 간략한 식품 배지에서 관찰 할 수 있습니다 ( 그림 3B )
여기에서 실험을 통해, 남녀가 동일한 환경 조건에 노출되기 때문에 부부의 일반적인 교미 행동에만 결론을 이끌어 낼 수 있습니다. 그러나 이전 연구에서 우리는 교미 빈도의 47 %가 여성에 의해 결정되지만 남성 기여는 단지 11 %에 불과하다는 것을 알고 있습니다20 . 따라서 관찰 된 교미 빈도의 변화의 대부분은 여성의 성적 수용성의 결과 일 수 있습니다. 증가 된 남성 성인 D.이 여성이 성공적으로 짝짓기 (29)를 시도 편향 수 melanogaster의로 여전히 그대로 사용하거나 짝짓기를 거부 할 수있는 여성 잎 구애. 확고한 결론을 내리고 여성의 성적 수용성과의 교미 빈도의 차이를 구체적으로 밝히기 위해서는 여성의 유전형이 다양하지만 남성의 유전형이 일정하게 유지되는 추가 교미 부부를 시험 할 필요가 있습니다.
이 프로토콜은 가압 공기 시스템 또는 식품 매체에 직접적으로 부부에게 향기로운 화합물을 전달하는 두 가지 방법을 입증했습니다. 가압 공기 시스템은 어떤 효과가 공기를 통해 전달되는 화합물에 기인 할 수있는 이점이 있지만, 화합물이 식품 매체에 직접 투입 될 때 결론 지을 수는 없습니다. 반면에, w암염 효과가 가압 공기 시스템에서 발견되면 자동으로 신호가 행동에 영향을 미치지 않는다는 의미는 아닙니다. 또한 화합물이 가압 공기 시스템을 통해 효율적으로 전달되지 않는다는 것을 의미 할 수도 있습니다. 공기 공급 시스템의 출구에서의 공기 조성은 탄화수소 필터를 배치하고 질량 분석기와 결합 된 가스 크로마토 그래피로 포획 된 공기 함량을 분석함으로써 분석 될 수있다. 가압 공기 시스템은 장거리에서 쉽게 공기 중으로 만들 수있는 화합물을 시험하기위한 훌륭한 분석법입니다. 휘발성이 적은 화합물은 식품 매체에 직접 넣어 야합니다. 가압 공기 시스템의 또 다른 단점은 공기 속도가 파리의 행동에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 공기 유속이 30 (0.7-1.6 m / s 이상)이 너무 높은 경우에는 파리의 움직임이 정지. 또한 가압 공기 시스템은 식품 매체를 건조시켜 간단하고 낮은 품질의 환경을 견딜 수 없게합니다. 두 경우 모두, 파리는 빠르지 않을 수 있습니다오메가도 똑같이 잘 나타나기 때문에 테스트 한 특정 화합물에 대한 결론을 내릴 수 없습니다.
이러한 분석법을 최적으로 수행하기위한 준비 중에 몇 가지 단계가 필수적입니다. 주의를 요하는 첫 번째 단계는 매체 준비입니다. 아세트산과 같은 냄새가 나는 휘발성 화합물을 포함한 매질은 증발을 피하기 위해 실험 당일에 조제되어야하며 조만간 조제하는 것이 중요합니다. 또한, 공기 흐름이 악취의 증발을 자극 할 수 있기 때문에 매체가 여분의 공기 흐름이없는 표면에서 단단해야합니다 (퓸 후드 사용을 피하십시오). 특별한주의가 필요한 두 번째 단계는 압축 공기 시스템을 확립하는 것입니다. 기류는 아레나에 액체를 옮기지 않고 부드럽게 거품을 일으킬만큼 충분히 높아야합니다.
이 프로토콜은 짝짓기 행동과 함께 효모 냄새를 이용한 행동 분석을 보여줍니다. 그러나이 시스템은냄새의 유형뿐만 아니라 다른 유형의 행동. 다른 냄새에이 시스템을 사용하려면 기류와 냄새 매체를 조정하여 화합물을 접시에 옮기는 것을 최적화해야합니다. 그러나 일반적으로 공기로 옮겨지는 화합물은이 시스템으로 테스트 할 수 있습니다. 또한, 남녀 모두에서 동일한 유형의 요리를 사용하거나 더 크거나 작은 테스트 영역에 도달하고 연결할 수 있도록 튜빙을 조정하여 모든 유형의 행동을 테스트 할 수 있습니다. 또한 더 자세한 동작을 테스트 할 때 사용되는 카메라의 프레임 속도와 해상도를 다시 고려해야합니다. 어떤 경우 에라도, 시험 냄새가 있거나없는 두 가지 실험이 동시에 그리고 동일한 공기원에서 실행되면, 한 실험에서 다른 실험으로의 압력 또는 농도의 변화에 관계없이 환경 큐에 대한 반응을 감지 할 수 있습니다. 마지막으로, 여기에 설명 된 분석법은 f (F)가 가능한 한 다른 LD 사이클 (최대 48 시간) 동안 연장 될 수 있습니다.ood 공급이 마르지 않습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 경쟁적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 비행 주식에 대한 블루밍턴 Drosophila 주식 센터 감사드립니다; C. Gahr, JT Alkema 및 S. van Hasselt가 가압 공기 분석법 개발 초기 시도 재스퍼 보스 만 (Jasper Bosman) : 효모 배양에 대한 조언; 원래는 Drosophila 교배 행동의 저속 모니터링을 개발 한 Rezza Azanchi와 Joel Levine입니다. JA Gorter는 Neuroscience Research School BCN / NWO 대학원 프로그램 지원금으로 지원되었습니다. 이 작업은 JC Billeter에 대한 네덜란드 연구 기관 (NWO) (참고 : 821.02.020)이 부분적으로 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
References
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