Summary
Demonstramos um ensaio para analisar as pistas ambientais e genéticas que influenciam o comportamento de acasalamento na mosca da fruta Drosophila melanogaster .
Abstract
A movimentação sexual de um indivíduo é influenciada pelo genótipo, experiência e condições ambientais. A forma como esses fatores interagem para modular os comportamentos sexuais permanece mal compreendida. Em Drosophila melanogaster , as pistas ambientais, como a disponibilidade de alimentos, afetam a atividade de acasalamento oferecendo um sistema atraente para investigar os mecanismos que modulam o comportamento sexual. Em D. melanogaster , as sugestões ambientais são muitas vezes detectadas através dos sistemas gustativos e olfativos quimiossensíveis. Aqui, apresentamos um método para testar o efeito de pistas químicas ambientais sobre o comportamento de acasalamento. O ensaio consiste em uma pequena arena de acasalamento contendo meio alimentar e um casal de acasalamento. A frequência de acasalamento para cada casal é monitorada continuamente por 24 h. Aqui apresentamos a aplicabilidade deste ensaio para testar compostos ambientais de uma fonte externa através de um sistema de ar pressurizado, bem como a manipulação dos componentes ambientais diretamente na arena de acasalamento. VocêUm sistema de ar pressurizado é especialmente útil para testar o efeito de compostos muito voláteis, enquanto a manipulação de componentes diretamente na arena de acasalamento pode ser útil para determinar a presença de um composto. Este ensaio pode ser adaptado para responder a perguntas sobre a influência de pistas genéticas e ambientais sobre comportamento e fecundidade de acasalamento, bem como outros comportamentos reprodutivos masculinos e femininos.
Introduction
Os comportamentos reprodutivos tipicamente têm altos custos de energia, especialmente para as mulheres, que produzem gametas maiores do que os machos e devem escolher cuidadosamente as condições para elevar sua prole em desenvolvimento. Devido ao custo da energia, não é surpreendente que a reprodução esteja ligada a condições nutricionais. Isso é verdade na maioria, se não em todos, animais, incluindo mamíferos, cuja puberdade pode ser adiada pela desnutrição e cuja excitação sexual pode ser afetada negativamente pela restrição alimentar 1 .
A reprodução do organismo modelo genético Drosophila melanogaster também é afetada por condições nutricionais. Tribunal dos machos em nível superior na presença de voláteis alimentares 2 , e as mulheres são mais receptivas sexualmente na presença de fermento, um importante nutriente para a produção de ovos e a sobrevivência da prole 3 , 4 , 5 . esteA resposta reprodutiva reproduzida evolutiva aos alimentos oferece a oportunidade de estudar mecanismos que conectem a disponibilidade de alimentos ambientais à reprodução sexual em um organismo genéticamente atraente e eficiente em termos de tempo. Na verdade, o trabalho em D. melanogaster implicou a via da insulina como um importante regulador da conexão entre alimentação e comportamento de acasalamento 6 . Também mostrou que o ato de se acasalar altera a preferência alimentar das fêmeas, bem como os neurônios quimiossensíveis associados 7 , 8 , 9 .
É claro que as indicações alimentares afetam os comportamentos reprodutivos em D. melanogaster . Esses efeitos parecem afetar principalmente as fêmeas, especificamente aqueles que já se acasalaram 5 . No entanto, para testar esses efeitos agudos das condições ambientais, o ensaio clássico usado para o comportamento de acasalamento feminino podeNão seja muito adequado devido às longas interrupções entre os episódios de acasalamento. No clássico ensaio de rematamento, uma fêmea virgem primeiro mata com um macho e é imediatamente isolada e apresentou um novo macho 24 a 48 h depois. Este ensaio clássico tem sido usado com grande sucesso para identificar componentes da ejaculação masculina que modificam o comportamento feminino e a resposta feminina 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . O ensaio de acoplamento contínuo demonstrado aqui é, portanto, uma adição aos ensaios clássicos de acoplamento que podem ser usados para estudar o efeito agudo das condições ambientais nos comportamentos reprodutivos.
Usando o ensaio contínuo para comportamento de acasalamento que é explicado aqui, anteriormente mostramos que um par de moscas expostas à fermento irá remeter sSempre em um período de observação de 24 h 5 , 19 , 20 , 21 , enquanto as moscas não expostas aos alimentos só serão rematadas uma vez 5 . Esta descoberta pode ser intrigante à luz de uma grande parte da literatura de D. melanogaster , indicando que as fêmeas não remontam por vários dias após um acasalamento inicial (revisado nas referências 10 , 11 ). No entanto, esta discrepância pode ser facilmente explicada por condições de ensaio, onde uma fêmea é isolada por um a vários dias antes de uma nova oportunidade de acasalamento ser fornecida. Se o par não se acasalar nesse período de observação de uma hora, a fêmea é caracterizada como não receptiva. Além disso, a alta freqüência de acasalamento não deve ser surpreendente, dado que os dados de moscas selvagens mostram que as fêmeas contêm esperma de 4 a 6 machos em seus órgãos de armazenamento; Assim, emDicionando que as fêmeas naturalmente remontam várias vezes 22 , 23 .
Aqui, demonstramos o uso deste ensaio de acoplamento contínuo para desvendar como as moscas se reúnem e combinam informações sobre condições ambientais para modular a freqüência de acasalamento. Este ensaio permite testar um número relativamente grande de casais de acasalamento para estudos genéticos e testar a influência de pistas ambientais voláteis e não voláteis. O ensaio normalmente é executado por 24 h, mas pode ser prolongado para 48 h, permitindo o teste de pistas ambientais de ciclagem, como o ciclo luz-escuro (LD). Demonstramos este ensaio testando a influência das pistas voláteis de uma cultura de fermento dentro de um sistema de ar pressurizado em combinação com a disponibilidade de nutrientes de fermento não volátil no substrato alimentar.
O sistema de ar pressurizado bombeia continuamente sinais voláteis para uma arena de acasalamento que contémUm substrato alimentar e um casal teste (cujo comportamento de acasalamento é monitorado). Para determinar ainda mais as especificidades através das quais a levedura influencia o acasalamento, testamos um grande composto volátil de fermento, a saber, ácido acético 24 , em combinação com um teor de aminoácidos que corresponde ao de fermento no substrato alimentar, na forma de peptona (amino Ácidos derivados da digestão enzimática de proteínas animais). Juntos, essas experiências demonstram como o efeito de pistas ambientais sobre o comportamento de acoplamento de D. melanogaster pode ser testado com este ensaio.
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Protocol
1. Caixa de acoplamento ambientalmente controlada
- Para garantir uma área de teste controlada e fácil de limpar, configure um armário de cozinha de aço inoxidável de 120 cm x 64 cm x 85 cm como ilustrado na Figura 1A.
- Faça um furo na parte de trás do armário logo abaixo do teto e quatro conjuntos de quatro furos nos lados, cada um com um diâmetro de 2 cm. Perfure os dois primeiros conjuntos de quatro furos, em cada lado da caixa a uma altura de 7 cm do fundo da caixa e com 12,5 cm entre os orifícios. Perfure os outros dois conjuntos de cada lado da caixa a uma altura de 35 cm da parte inferior.
NOTA: Os quatro conjuntos de quatro furos são usados para cabos de alimentação da câmera e tubulação da bomba de ar para entrar e sair do armário. O furo na parte de trás é usado para os cabos de alimentação de uma placa de luz. - Construa uma placa de luz com 18 linhas de 40 diodos emissores de luz brancos e vermelhos alternativos (LED) com espaço de 2,5 cm entre cada luz. Montar os LEDs brancos e vermelhos em um circuiT com fonte de alimentação. Conecte cada LED em série com um resistor de 560 Ω, 0,25 W e 5% de tolerância.
NOTA: Os comprimentos de onda de emissão da luz vermelha foram de 590-661 nm com um pico afiado a 627 nm. A intensidade da luz resultante na área experimental é de aproximadamente 900 lux com luzes e 90 lux com apenas as luzes vermelhas acesas; Isso foi medido usando um aplicativo de medidor de luz do smartphone. - Coloque a placa de luz na parte superior do armário de aço inoxidável e passe os cabos de alimentação através do orifício na parte traseira.
- Conecte o adaptador dos LEDs brancos a um temporizador de controle de energia para permitir desligar o LED branco durante a fase escura do experimento. Conecte o adaptador da luz vermelha, que voa é cego para 25 , para uma fonte de alimentação regular para mantê-los ativados durante toda a duração do experimento.
- Fixar um suporte de metal de 110 cm e dois 54 cm de comprimento, cada um com uma largura de 0,5 cm, nos lados internos da caixa a uma altura de 50Cm da parte inferior da caixa. Coloque uma placa de difusão de vidro fosco (dimensões de 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) nestes suportes.
- Adicione três camadas de papel de filtro (120 cm x 50 cm) entre a placa de luz e a placa de vidro para difundir a luz e limitar o brilho na superfície das arenas de acoplamento (descrito na seção 4). Empurre duas folhas de papel de filtro juntas em sua borda longa com varas de madeira de 120 cm de comprimento usando ímãs (no lado), para enfiá-las no interior do armário metálico; Execute esta ação 3 vezes.
- Anexe quatro ventiladores nos lados da caixa para criar um fluxo de ar que apresente continuamente a caixa de acasalamento. Anexe o primeiro conjunto de ventiladores de 8 cm entre a placa de luz e a placa de vidro, com a entrada de ar no lado esquerdo e o escape no lado direito da caixa, para minimizar a acumulação de calor gerada pela placa de luz.
- Conecte o segundo conjunto de ventiladores de 12 cm a 25 cm acima da parte inferior do armário para criar um fluxo de ar externo que apresente o iNo lado do armário e esfria até um estável de 26 ° C. Conecte os ventiladores do lado de escape a uma mangueira de sucção e guie o fluxo de ar para fora da sala para evitar o reciclado do ar no gabinete.
- Faça um furo na parte de trás do armário logo abaixo do teto e quatro conjuntos de quatro furos nos lados, cada um com um diâmetro de 2 cm. Perfure os dois primeiros conjuntos de quatro furos, em cada lado da caixa a uma altura de 7 cm do fundo da caixa e com 12,5 cm entre os orifícios. Perfure os outros dois conjuntos de cada lado da caixa a uma altura de 35 cm da parte inferior.
- Configure dois suportes (aproximadamente 48 cm de altura) montados com duas braçadeiras, um a 28 cm e um a 30 cm da base do suporte. Corrija uma webcam em cada uma das braçadeiras. Conecte as 4 câmeras a um computador que executa o software de monitoramento.
- Coloque folhas A4 debaixo de cada webcam. Use folhas ou folhas brancas não impressas com grade pré-numerada de 7 por 5 quadrados com eixos de 4 cm para acomodar arenas de acasalamento (descrito na seção 4).
NOTA: Uma câmera de webcam HD com visão de grande angular de 78 ° e resolução de 5 milhões de pixels pode cobrir uma área de 21 cm x 30 cm correspondente a uma folha A4 e monitorar entre 20 e 35 arenas de acasalamento.
2. Criação e coleta de moscas
- Coloque 20 machos e 20 fêmeas de tipo selvagem Canton-SVoa em garrafas de criação de moscas contendo 45 mL de meio rico de mosca média (ver seção 3) por três a quatro dias. Transfira os mesmos adultos três vezes, primeiro tocando-os e depois em garrafas frescas.
- Coloque as garrafas em uma incubadora a 25 ° C e 12 h: 12 h luz-escuro ciclo com luzes acesas às 09:00 (horário Zeitgeber (ZT) 0). Uma nova geração aparecerá cerca de 10 dias depois.
- Anestesiar as moscas recém-eclosed resultantes nas almofadas de dióxido de carbono por não mais de 5 minutos e recolhê-las em frascos de mosca usando um pincel.
- Recolher fêmeas virgens (recém-fechadas) e machos virgens das garrafas de estoque de tipo selvagem de Cantão-S em frascos de criação de mosca de 2,5 cm x 9,5 cm com 6,5 mL de meio rico de mosca.
- Idade, as moscas nos grupos do mesmo sexo de 20 moscas cada vez em frascos de criação de mosca por 5 a 8 dias a 25 ° C e 12 h: 12 h ciclo luz-escuro e luzes acesas às 09:00 (ZT 0).
- TransfAs moscas para os frascos de criação de moscas frescas no dia anterior ao experimento.
3. Preparação do Meio Ambiente
- Prepare 1 L de meio de mosca rico da seguinte maneira.
- Despeje 1 L de água da torneira em um copo de vidro de 2 L com uma barra de agitação magnética e coloque o copo em uma placa magnética quente. Mantenha a agitação e gire o aquecimento até 300 ° C até atingir a temperatura de ebulição.
NOTA: Durante o tempo de ebulição longo nas etapas a seguir, uma proporção de água irá evaporar, mas, juntamente com os ingredientes adicionados, este protocolo resulta em 1 L de meio de mosca rico quando preparado a temperatura ambiente de aproximadamente 22 ° C. - Ligue a agitação para 500 rodadas por minuto (rpm) e adicione os seguintes ingredientes à água a ferver: 10 g de ágar, 30 g de glicose, 15 g de sacarose, 15 g de farinha de milho, 10 g de germe de trigo, 10 g de farinha de soja, 30 g Melaço, 35 g de fermento seco ativo. Aguarde até que o fermento espuma vigorosamente e depois baixe a temperatura da placa quenteAté 120 ° C.
- Após 10 minutos, aplaca a placa quente até 30 ° C e deixa a mistura mexer até arrefecer até 48 ° C. Monitore a temperatura inserindo um termômetro diretamente no alimento.
- Dissolver 2 g de éster metílico do ácido p-hidroxi-benzóico (tegosept, 100%) em 10 mL de etanol a 96%. Adicione isso e 5 mL de ácido propiónico 1 M à mistura. Agitar durante 3 min.
- Despeje o meio de alimento para moscas nas arenas (descrito na seção 4) para criar uma camada de 0,3 cm de espessura na parte inferior da arena.
- Use um copo de vidro de 200 mL para verter. Quando as quantidades exatas são importantes, use uma pipeta sorológica de 10 mL.
- Despeje 1 L de água da torneira em um copo de vidro de 2 L com uma barra de agitação magnética e coloque o copo em uma placa magnética quente. Mantenha a agitação e gire o aquecimento até 300 ° C até atingir a temperatura de ebulição.
- Prepare o meio da mosca menos levedura exatamente como descrito no passo 3.1.1 até 3.1.5, mas deixe de lado a levedura no passo 3.1.2.
- Prepare o meio com ágar com ou sem peptona misturando 10 g de agar e 35 g de peptona em 1 L de água fervente e execute as etapas 3.1.4 a 3.1.5.
4. MatinG Preparação da arena
- Pierce um orifício de aproximadamente 0,3 cm de diâmetro no lado superior de uma placa de Petri de 3,5 cm x 1,0 cm com uma agulha de preparação aquecida (aquecida a vermelhidão em um queimador de Bunsen). Alternativamente, use um ferro de solda.
- Ao preparar o meio alimentar com compostos odorosos, primeiro pipeta 30 μL (1% do meio alimentar final, por exemplo, ácido acético glacial 100%) do composto desejado no prato para metade dos pratos experimentais. Deixe a outra metade dos pratos vazios para comparação.
NOTA: Com a configuração descrita aqui, um máximo de 140 arenas pode ser testado de uma só vez. - Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, despeje 3 mL de meio alimentar no fundo do prato sobre o composto desejado. Cubra-o com um pano de queijo para evitar a contaminação e deixe o meio para solidificar por aproximadamente 1 h à temperatura ambiente.
- Coloque uma tampa no prato e fita cada um em ambos os lados. Prepare pequenos tampões de parafina para cobrir os orifícios deOs pratos puxando pedaços de película de parafina em rolos de 0,2 cm de espessura e depois cortá-los em segmentos de 0,5 cm.
5. Cultura de fermento para odor
- Cultivar levedura ativa seca em soro de extração de levedura de dextrose (YPD) em uma placa de Petri de 14,0 cm x 2,06 cm. Use luvas para evitar a contaminação nesta etapa.
- Prepare placas de agar YPD adicionando 10 g de extracto de levedura, 20 g de peptona, 22 g de glicose (0 (+) - monohidrato de glicose) e 15 g de ágar (puro) a 1 L de água ultrapura a ferver. Coloque a parte inferior da placa de Petri uma vez que tudo esteja dissolvido e guarde a cabeça na geladeira a 4 ° C, por até 2 meses.
- Polvilhe alguns grãos de fermento seco em uma placa média YPD, deixe-os dissolver. Em seguida, trace a placa média usando um loop estéril. Armazene a placa em uma incubadora a 30 ° C durante a noite. Depois, armazene a cultura na geladeira por não mais de 1 semana.
- Prepare YPD líquido médio iN 1 L de garrafas adicionando 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona, 22 g de glicose (monohidrato de 0 (+) - glicose) e uma barra de agitação a 1 L de água ultrapura.
- Autoclave durante 25 minutos a 120 ° C e 1 bar de pressão. Depois, armazene as garrafas a 4 ° C por até 2 meses até o uso.
- Coloque tampas de garrafas abertas (4,5 cm) com um septo de silicone de 0,32 cm de espessura.
- Corte dois pequenos orifícios no septo para encaixar perfeitamente os acessórios de anteparas com farfalheiras. Anexe a pequena tubulação de cloreto de polivinilo (PVC) (diâmetros: 0.8 cm externo e 0,5 cm interno) para ambas as saídas que saem da garrafa e apenas uma das entradas que entram na garrafa. Veja a Figura 1B para ilustração.
- Enrole as tampas e tubos adequados em papel alumínio e autoclave durante 25 minutos a 120 ° C e 1 bar de pressão.
- Use luvas para proteger contra a contaminação nesta etapa. Dip uma ponta de pipeta estéril de 100 μL em uma das colônias de levedura da placa de ágar YPD (dEscrito em 5.1) e solte-o no frasco de líquido líquido YPD autoclavado.
- Capte esta garrafa líquida YPD inoculada em fermento, bem como uma garrafa de controle médio YPD (fermento não adicionado) com tampas autoclavadas montadas com entrada e saída (descritas no passo 5.3). Coloque ambos os frascos em placas magnéticas separadas e agite a 100 rpm à temperatura ambiente durante 24 h antes do início da experiência para permitir que a cultura de fermento cresça.
- Conecte as entradas de ambos os frascos para separar bombas de aquário para fornecer ar à cultura de fermento. Certifique-se de conectar a saída do frasco de fermento experimental a um tubo que ventila o cheiro de fermento da sala experimental para evitar interferências com o experimento.
6. Instalação da bomba de ar
- Conecte o tubo de PVC grande (diâmetros: 1,2 cm exterior e 0,9 cm interno) a um fornecimento de ar pressurizado e leve-o através de dois frascos Erlenmeyer de vidro de 1 L cheios com carvão ativado aos 800 mLLinha para purificar o ar. Use ar pressurizado comumente fornecido em laboratórios como suprimento de ar, ou conecte os tubos a uma bomba de ar (o ar pressurizado foi usado aqui).
NOTA: O material da tubulação deve ser selecionado com base nas propriedades químicas do volátil e testado para evitar que o volátil fique aderente ao revestimento da tubulação (por exemplo, politetrafluoroetileno, nylon ou aço inoxidável). - Faça dois separadores de ar de tubos de 15 mL e três pontas de pipeta de 1.000 μL cada.
- Faça três furos de ~ 1 cm de diâmetro. Primeiro queime dois orifícios, usando uma agulha de preparação aquecida (aquecida vermelha em um queimador de Bunsen), adjacente entre si apenas abaixo da tampa do tubo de 15 mL. Em seguida, faça o terceiro furo removendo o fundo do tubo.
- Cola as pontas de pipeta de 1.000 μL nos orifícios com a extremidade estreita apontando para fora. Corte o final das pontas da pipeta para permitir um maior fluxo de ar.
- Conecte o tubo de PVC grande da saída do cFrasco Erlenmeyer checo-preenchido na ponta da pipeta na parte inferior do tubo de 15 mL. Adicione pequenas saídas de tubos de PVC às duas pontas de pipeta horizontais e guie-as para um controle e uma garrafa experimental.
- Para evitar a contaminação do meio YPD com microorganismos, coloque a tubulação pequena em um filtro de seringa estéril (tamanho de poro de 0,45 μm) com um empuxo de plástico no conector da tubulação da antepara indo para o filtro e um parafuso no conector de antepara de plástico deixando o filtro. Em seguida, prenda a tubulação na entrada do frasco de cultura YPD (veja a Figura 1B ).
- Para evitar que o fermento no ar passe do balão de cultura para a arena experimental, prenda um tubo de vidro (6,5 cm de comprimento, diâmetro externo = 0,5 cm e diâmetro interno = 0,3 cm) à saída de cada frasco de cultura de YPD usando pequenas tubulações. Conecte a tubulação de PVC ao outro lado do tubo de vidro e guie-a para os orifícios inferiores (perfurados a cada lado) da caixa da experiência.
- Encha o tubo com fibra de vidro e enrole-o antes de usar.
- Adicione outro divisor de tubos de 15 mL (descrito na seção 6.2) para a pequena tubulação de PVC, em cada lado da caixa experimental, para obter dois tubos correndo para a caixa no lado experimental (mais próximo da exaustão do fluxo de ar do ventilador, à direita) E o lado de controle (mais próximo da entrada do fluxo de ar do ventilador, à esquerda).
- Prepare 8 x 25 mL de pipetas sorológicas cada uma com 10 saídas para testar 80 casais acoplados ao mesmo tempo, ou seja , 40 para cada condição de ar.
- Queime 10 furos de 0,8 cm de diâmetro, separados 2 cm na pipeta.
- Corte a parte externa de uma seringa de 1 mL em uma pequena (2,5 cm) e uma grande (5 cm) de saída.
- Cola estas saídas nos orifícios com cola quente.
- Enrole uma pequena faixa de filme de parafina de plástico ao redor da extremidade das tomadas e prenda uma ponta de pipeta de 1.000 μL. O diâmetro da abertura da ponta é de 0,1 cm. Use dicas limpas para cada experiência.
- Anexe duas pipetas sorológicas, usando um divisor de T com diâmetro externo ≥0,5 cm e pequenos pedaços de pequena tubulação de PVC, para cada uma das duas saídas em ambos os lados. Tape as pipetas na folha de papel branco (sob as câmeras na caixa de aço).
- Usando um monitor de fluxo de ar, ajuste o fluxo de ar para que a velocidade do ar na saída da ponta da pipeta de 1000 μL seja de 0,5 m / s. Isso corresponde a um fluxo de ar de 0,0017 L / s por dica.
7. Monitoramento do comportamento de acoplamento
- Use uma pipeta de boca (como descrito na referência 26 ) para colocar uma fêmea experimental em uma pequena placa de Petri (descrita na seção 4) às 15:00 horas (ZT 6) e dar-lhe 1 h para aclimatação na arena de acasalamento.
- Configure a caixa experimental (descrita na seção 1) da seguinte maneira:
- Ligue as luzes, ou seja , LEDs de luz branca em um ciclo luz-escuro de 12h: 12 conectado a um temporizador que liga oLuz às 09:00 (ZT0) e LEDs de luz vermelha contínua para permitir o monitoramento das moscas durante a fase escura do experimento. Ligue os ventiladores para limitar o aquecimento do gabinete pela fonte de luz e para garantir que o excesso de odores seja ventilado fora da área de teste.
- Conecte câmeras de webcam a um computador e comece com o software de monitoramento para monitoramento de imagens.
- Para cada câmera, defina o foco, o brilho e o zoom no software de monitoramento.
- Clique com o botão direito do mouse na tela da câmera, abra "propriedades da câmera" e desmarque "foco automático". Ajuste o "foco" para esclarecer a grade ou qualquer palavra escrita na folha de papel. Se necessário, altere o "brilho" e "zoom".
- Defina o programa do software de monitoramento para capturar 1 imagem a cada 2 min. Clique com o botão direito do mouse em cada tela da câmera e escolha "editar câmera" e depois a opção "Ações". Clique para iniciar as ações "No int regularErvais "e altere o tempo para" 2 minutos ". Escolha" Tirar foto "para selecionar ações para executar e, finalmente, clicar em" ok ".
- Clique com o botão direito do mouse em cada tela da câmera e selecione "iniciar o monitoramento".
- Após 1 h (no ZT 7), transfira um macho de tipo selvagem para a placa de Petri usando a pipeta da boca, coloque o prato nas folhas de papel A4 nas câmeras da webcam e clique em "iniciar a monitoração" por 24 h. Para a experiência da bomba de ar, coloque o prato de forma que uma saída de pipeta seja conectada ao orifício de entrada da arena de acasalamento.
- Para analisar o comportamento de acasalamento do casal, faça o seguinte.
- Selecione e abra todas as imagens em um software de visualização de imagens e passe por elas em ordem cronológica.
- Anote a data, o número da experiência, o número do prato e o tempo de início em uma planilha na mesma linha. Pegue a hora de início de cada arena a partir do momento em que é colocado sob a webcaM câmera. Grave o carimbo de data / hora das imagens.
- Marque a hora de início de cada copulação na mesma linha na planilha. Contar um acasalamento como um incidente quando o macho montou a fêmea e o casal permanece moderadamente estacionário e na mesma postura por pelo menos cinco quadros consecutivos (10 min).
NOTA: Este critério é baseado no comprimento de copulação relatado, variando de 12 a 27 minutos em D. melanogaster , e a observação de que as cópulas de 10 min e mais são férteis 27 , 28 . - Contar o número de cópulas para cada linha na planilha para determinar a frequência de acasalamento. Alternativamente, subtrai a hora de início da experiência a partir do momento do primeiro acasalamento para cada linha como medida de latência de acasalamento ou subtrai o tempo do primeiro acasalamento a partir do momento do segundo acasalamento como medida de latência de remate.
- Para calcular a latência de remate, certifique-se deDefina as datas do primeiro e segundo acasalamento como dias consecutivos na planilha eletrônica.
- Analisar os dados com modelos de efeitos mistos, assumindo a distribuição normal dos dados e incluindo a data da experiência como um fator aleatório, usando um software estatístico (veja a tabela de materiais) para determinar a significância estatística das variáveis independentes - meio alimentar, Tipo de ar e interação - como descrito anteriormente 5 .
- Selecione o melhor modelo de explicação, realizando a eliminação de variáveis independentes não significativas usando testes de razão log-verossimilhança e as informações Akaike associadas. Depois de executar o modelo, inspecione visualmente os resíduos de dados para confirmar a normalidade. Confirme a homogeneidade das variâncias usando o teste de Levene. Em caso de homogeneidade desigual, a raiz quadrada transforma os dados.
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Representative Results
O uso desse ensaio contínuo, comportamento de acasalamento e freqüência de acoplamento em específico, pode ser determinado em condições ambientais experimentais. Para controlar as condições ambientais, transformamos um armário de cozinha de aço inoxidável em uma área de teste, com sua própria fonte de luz e difusão, o que garante uma alta abundância de luz e um mínimo de brilho do topo das arenas de acoplamento ( Figura 1A ) . A área de teste interna é completamente encapsulada por aço inoxidável e vidro, que permite a limpeza com solventes orgânicos, como hexano ou etanol. Além disso, o armário está equipado com furos que atuam como entradas para tubulação, trazendo indícios voláteis do sistema de ar pressurizado (ver Figuras 1A e 1B ). O sistema de ar pressurizado, ajustado para odores de levedura, consiste em um fluxo de ar guiado através de uma cultura de levedura líquida antes de entrar nas arenas de teste através de 4 separadores de pipetas com10 saídas cada ( Figura 1C ). Todo o sistema é hermético e equipado com vários filtros de partículas, antes e depois de entrar na cultura de fermento, para minimizar a contaminação com odores de confusão ( Figura 1B ).
Para demonstrar o uso deste ensaio, testámos se as pistas voláteis de uma cultura de fermento podem influenciar o comportamento de acasalamento. O ar foi borbulhado através de uma cultura de fermento líquido durante 24 h, e as saídas de ar foram colocadas na entrada de cada arena de acasalamento (ver Figura 2A ). A metade das arenas de acasalamento continha alimentos com mosca com levedura (Alimentos + fermento), e a outra metade continha alimentos com mosca sem fermento adicionado (Alimento - fermento). Um tipo selvagem homens e mulheres foram expostos aos odores provenientes da cultura de levedura externa, e sua freqüência de acasalamento foi registrada. Para determinar quais variáveis são necessárias para explicar os resultados graficados, realizamos modelos de efeitos mistos, incluindo ou excluindoAs variáveis independentes do meio alimentar, o ferro ferroso e a interação dos dois. Os dados na Figura 2B são melhor representados por um modelo que inclui as variáveis independentes do meio alimentar (p = 0,001) e do ar de fermento (p = 0,061), mas não há efeito de interação de explicação. Embora a variável do ar de fermento não seja significante neste conjunto completo de dados, é necessário explicar os resultados. A análise do ar de fermento separado para meio alimentar mostra que um casal não responde aos odores de levedura quando não há leveduras presentes no meio alimentar (ar: p = 0,992), mas aumentam a freqüência de acasalamento no ar de levedura quando o fermento é Também adicionado ao meio alimentar (ar: p = 0,018). Juntos, esses resultados demonstram a aplicabilidade do sistema de ar pressurizado para testar a influência de odores ambientais em combinação com condições de meio alimentar.
Nós também ilustramos como o sistema de ar pressurizado pode ser bypAssed através da adição de pistas químicas ambientais diretamente na arena do teste. Para demonstrar quais compostos de levedura específicos afetam a freqüência de acasalamento, testamos a hipótese de que o teor de aminoácidos da levedura é necessário para seu efeito no acasalamento, colocando uma dose de peptona (proteínas hidrolisadas) correspondente aos aminoácidos fornecidos pela levedura no ágar Substrato que reúne a arena de acasalamento. Nós também testou a necessidade de ácido acético, um dos principais produtos de fermentação volátil de fermento, para aumentar a freqüência de acoplamento. Isto foi feito adicionando ácido acético diretamente ao meio alimentar. Um macho selvagem e macho foram testados em arenas contendo agar ou agar com peptona, com ou sem ácido acético diretamente no meio alimentar ( Figura 3B ). Isso faz com que um meio alimentar muito simples e um ambiente pobre; Portanto, a freqüência de acoplamento média também é diminuída em comparação com a Figura 2B. Os dados da Figura 3B são melhor representados por um modelo que inclui oVariáveis independentes de meio alimentar (p = 0,002), ar de ácido acético (p = 0,001) e a interação dos dois (p = 0,022). A receptividade feminina aumenta após a presença de ácido acético, mas apenas na condição em que a peptona está presente no meio. Isso mostra que moscas precisam detectar sensivelmente aminoácidos e ácido acético para aumentar sua freqüência de acoplamento ( Figura 3B ). Isso demonstra que a adição de compostos odorosos diretamente à arena de teste pode influenciar o comportamento de acasalamento e que essas influências podem ser detectadas em condições ambientais muito simples.
Figura 1: Diagrama da caixa experimental e sistema de ar pressurizado com levedura. ( A ) Ilustração esquemática da caixa de acasalamento ambientalmente controlada descrita na seção 1. Descrição dos números e setas anotados: 1. placa de luz com al Ternando luzes brancas e vermelhas; 2. ventilador pequeno; 3. 3 camadas de papel de filtro, cada camada consistindo de duas folhas de papel de filtro; 4. placa de difusão de vidro em repouso em suportes anexados a 3 lados da caixa; 5. grande fã; 6. furos para tubos e cabos; 7. área experimental; Flecha grande, 50 cm para a placa de vidro; Seta do meio, 35 cm de altura para os orifícios dos cabos; E flecha pequena, 7 cm de altura para os orifícios da tubulação. ( B ) Ilustração esquemática da cultura de levedura líquida com fluxo de ar, conforme descrito nas seções 5, 6.4 e 6.5. Descrição dos números anotados: 1. unidade de filtro descartável; 2. tampa com septo de silicone e fora e entradas; 3. meio líquido; E 4. tubo de vidro com fibra de vidro. ( C ) Ilustração esquemática das saídas de ar como descrito na seção 6.7. Descrição dos números anotados: 1. pipeta sorológica; 2. Corte de tubulação de 1 mL de seringa e 3. 1.000 μL de ponta de pipeta.Target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O odor de fermento aumenta a receptividade feminina na presença de fermento no substrato alimentar. ( A ) Ilustração esquemática de uma arena de acasalamento com uma macho e uma fêmea e uma ponta de pipeta da saída de ar na Figura 1C entrando pelo orifício de entrada. ( B ) Apresentação gráfica da resposta na frequência de acasalamento de um casal de acasalamento Canton-S com odor de fermento com e sem levedura no meio de comida de mosca (Alimento - fermento: ar médio n = 12, ar de fermento n = 13 e Alimento + levedura : Ar médio n = 24, levedura de ar n = 23). Gráfico de linha com barras de erro SEM e saída estatística de modelos de efeitos mistos com o ar como variável independente e a data como variável aleatória para cada meio alimentar de forma independente. A estatística principalO modelo inclui alimentos (p = 0,001) e ar de levedura (p = 0,061). Adaptado da referência 5 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3: O ácido acético no substrato de alimento para mosca aumenta a receptividade feminina na presença de peptona. ( A ) Ilustração esquemática de uma arena de acasalamento, com meio de alimento de mosca contendo ácido acético e um plugue de película de parafina de plástico que fecha o orifício de entrada. ( B ) Uma apresentação gráfica da frequência de acoplamento de um casal acasalamento Canton-S em resposta ao ácido acético quer no meio de agar ou peptona (ágar: ácido acético n = 52, + ácido acético n = 40 e peptona: ácido acético N = 28, + ácido acético n = 25). Gráfico de linha com barras de erro SEM e o statiSaída stica do modelo de efeitos mistos com meio alimentar (p = 0,002), ar de ácido acético (p = 0,001) e alimento * ar (p = 0,022) como variáveis independentes e a data como variável aleatória. Adaptado da referência 5 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um ensaio para testar o comportamento de acasalamento ao longo de 24 h, enquanto controla continuamente as pistas ambientais que um casal de acasalamento tem a hipótese de usar para determinar a freqüência de acasalamento. É possível aumentar a frequência de acasalamento em resposta ao ar de fermento entregue através de um sistema de ar pressurizado quando o meio também contém levedura ( Figura 2B ). Além disso, uma resposta semelhante na freqüência de acoplamento pode ser observada com um meio alimentar simplificado contendo apenas odor de agar, peptona e ácido acético diretamente no meio ( Figura 3B )
Com os experimentos demonstrados aqui, as conclusões só podem ser desenhadas sobre o comportamento de acasalamento geral do casal, uma vez que ambos os sexos estão expostos às mesmas condições ambientais. No entanto, sabemos de pesquisa anterior que 47% da variação na freqüência de acasalamento é determinada pela fêmea, enquanto a contribuição masculina apenas representa 11% da variação20 . Portanto, a maioria das mudanças na freqüência de acasalamento observada são provavelmente um resultado da receptividade sexual feminina. O namoro aumentado do sexo masculino ainda deixa a fêmea para aceitar ou rejeitar o acasalamento, pois as fêmeas adultas de D. melanogaster podem desviá-las com sucesso 29 . Para conclusões firmes e especificamente atribuir diferenças na frequência de acasalamento à receptividade sexual feminina, é necessário testar casais de acasalamento adicionais onde o genótipo da fêmea é variado, mas o do homem é mantido constante.
Este protocolo demonstrou duas maneiras de fornecer compostos odorosos para um casal de acasalamento, com sistema de ar pressurizado ou diretamente no meio alimentar. O sistema de ar pressurizado tem a vantagem de que qualquer efeito pode ser atribuído aos compostos que são entregues através do ar, enquanto isso não pode ser concluído quando os compostos são colocados diretamente no meio alimentar. Por outro lado, wQuando nenhum efeito é encontrado com o sistema de ar pressurizado, isso não significa automaticamente que a sugestão não afeta o comportamento. Isso também pode significar que o composto não é administrado eficientemente através do sistema de ar pressurizado. A composição do ar na saída do sistema de fornecimento de ar pode ser analisada colocando um filtro de hidrocarbonetos e analisando o conteúdo de ar preso com cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa. O sistema de ar pressurizado é um bom ensaio para testar compostos que podem ser facilmente feitos no ar por um longo alcance. Os compostos menos voláteis podem ter que ser colocados diretamente no meio alimentar. Outra desvantagem do sistema de ar pressurizado é o efeito que a velocidade do ar pode ter no comportamento da mosca. As moscas param de se mover quando a velocidade do ar é muito alta (acima de 0,7-1,6 m / s) 30 . Além disso, o sistema de ar pressurizado pode tornar um ambiente simples e de baixa qualidade, intolerável ao secar o meio alimentar. Em ambos os casos, as moscas podem não serOrm igualmente bem, e nenhuma conclusão pode ser atribuída aos compostos específicos testados.
São essenciais vários passos durante a preparação para o melhor funcionamento desses ensaios. O primeiro passo que requer atenção é a preparação do meio. É importante que o meio, incluindo compostos voláteis odorosos, como o ácido acético, seja preparado no dia da experiência e não antes, para evitar a evaporação. Além disso, o meio precisa se endurecer em uma superfície sem fluxo de ar extra (evite usar exaustores para isso), pois o fluxo de ar pode estimular a evaporação do odor. O segundo passo que requer cuidados especiais é o estabelecimento do sistema de ar pressurizado. O fluxo de ar precisa ser alto o suficiente para bolha suavemente da cultura de fermento sem transferir nenhum fluido para a arena.
Este protocolo demonstra um ensaio comportamental com odores de levedura em combinação com comportamento de acasalamento. No entanto, este sistema pode ser aplicado a qualquerTipo de odor, bem como a outros tipos de comportamentos. Para usar este sistema para outros odores, é necessário ajustar o fluxo de ar e odor para otimizar a transferência dos compostos para os pratos. No entanto, em geral, qualquer composto que pode ser transferido por via aérea pode ser testado com este sistema. Além disso, qualquer tipo de comportamento, tanto em machos e fêmeas, pode ser testado, seja usando o mesmo tipo de pratos ou ajustando a tubulação para alcançar e conectar-se a áreas de teste maiores ou menores. Além disso, quando os comportamentos mais detalhados são testados, as taxas de quadros e as resoluções das câmeras usadas precisam ser reconsideradas. Em qualquer caso, se ambos os experimentos com e sem o odor de teste forem executados ao mesmo tempo e com a mesma fonte de ar, qualquer resposta à sugestão ambiental pode ser detectada, independentemente de mudanças de pressão ou concentração de uma experiência para a outra. Por fim, o ensaio demonstrado aqui pode ser prolongado para pelo menos outro ciclo LD (até 48 h), desde que o fO fornecimento de água não seca.
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Disclosures
Os autores não têm interesses concorrentes a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Bloomington Drosophila Stock Center pelas ações da mosca; C. Gahr, JT Alkema e S. van Hasselt por sua tentativa inicial de desenvolver o ensaio de ar pressurizado; Jasper Bosman, pelo conselho sobre o cultivo de fermento; E Rezza Azanchi e Joel Levine por desenvolverem originalmente o monitoramento do lapso de tempo do comportamento de acoplamento de Drosophila . A JA Gorter foi apoiada por uma bolsa do Programa de Pós-Graduação da Escola de Pesquisa de Neurociências BCN / NWO. Este trabalho foi apoiado em parte pela organização holandesa de pesquisa científica (NWO) (referência: 821.02.020) a JC Billeter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
References
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