Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55957
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University
* These authors contributed equally

Summary

ونحن نقدم بروتوكول معمم على أساس استراتيجية بيوبرينتينج موائع جزيئية للهندسة على سرير الأوعية الدموية ميكروفيبروس، حيث يمكن زيادة المصنف نوع خلية الثانوية في الفضاء فراغي من هذا الهيكل ميكروفيبروس لتوليد أنسجة فاسكولاريزيد وأورجانويدس.

Abstract

هندسة الأنسجة فاسكولاريزيد بنيات وقد تم أورجانويدس تحديا تاريخيا. هنا يصف لنا طريقة جديدة استناداً إلى بيوبرينتينج موائع جزيئية لتوليد سقالة مع متعدد الطبقات التداخل ميكروفيبيرس المائية. لتحقيق سلاسة صمم بيوبرينتينج، رأس طباعة موائع جزيئية غمد أساسية التي تحتوي على صيغة بيوينك مركب مقذوف من تدفق الأساسية والحل كروسلينكينج بتدفق غمد، وتركيبها في بيوبرينتير. عن طريق مزج ميثاكريلويل الجيلاتين (جيلما) مع الجينات، تحديد السكاريد أن يخضع لحظية crosslinking الأيونية في حضور كل من أيونات ديفالينت، يليه فوتوكروسلينكينج ثانوي المكون جيلما لتحقيق الاستقرار الدائم، سقالة ميكروفيبروس يمكن الحصول عليها باستخدام هذه الاستراتيجية بيوبرينتينج. الأهم من ذلك، يمكن أن تشكل خلايا بطانية مغلفة داخل ميكروفيبيرس بيوبرينتيد التجويف تشبه هياكل تشبه المفرج على مدى ثقافة لمدة 16 يوما. قد تستعمل سقالة ميكروفيبروس اندوثيلياليزيد كذلك كفراش الأوعية الدموية لبناء أنسجة فاسكولاريزيد عن طريق البذر اللاحقة من نوع الخلية الثانوية في الفضاء فراغي من ميكروفيبيرس. بيوبرينتينج موائع جزيئية يوفر استراتيجية معمم في الهندسة مريحة للأنسجة فاسكولاريزيد في الدقة العالية.

Introduction

الأنسجة الأهداف الهندسية لتوليد البدائل الوظيفية الأنسجة التي يمكن استخدامها لاستبدال أو استعادة أو زيادة تلك المتضررة أو المريضة في جسم الإنسان1،2،،من34، غالباً من خلال مزيج من أنواع الخلايا المطلوب والجزيئات النشطة بيولوجيا5،6، والمواد الحيوية7،،من89،10. في الآونة الأخيرة، أيضا تم اعتمدت تقنيات هندسة الأنسجة متزايد لتوليد في المختبر الأنسجة والجهاز النماذج التي تحاكي مهام هامة من نظرائهم في فيفو ، لتطبيقات مثل تطوير الأدوية، في استبدال خلية مستو الإفراط في تبسيط التقليدية الثقافات11،12،13،14،15،16،17،،من1819. وفي كلتا الحالتين، أهمية حاسمة في تمكين وظيفة الأنسجة المهندسة10القدرة على تلخيص المصغرة المعقدة والهيكل الهرمي للأنسجة البشرية، وعلى وجه الخصوص، السبل لدمج شبكة الأوعية الدموية في الأنسجة المهندسة الطلب نظراً للأوعية الدموية ويعرض واحداً من أكبر التحديات لأن الحقل20،21،،من2223.

وحتى الآن، وضعت مجموعة متنوعة من النهج في هذا الصدد في محاولة لبناء هياكل الأوعية الدموية في الأنسجة المهندسة بنيات بدرجات مختلفة من النجاح8. على سبيل المثال، التجميع الذاتي لخلايا بطانية يسمح لجيل من شبكات microvascular24؛ تسليم عوامل نمو الأوعية يدفع25،نيوفاسكولاريزيشن المطرد26؛ استخدام خلايا السلف الأوعية الدموية وبيريسيتيس ويسهل نمو الخلايا البطانية والجمعية24،27؛ تصميم خصائص سقالة يتيح التعديل الدقيق للأوعية الدموية28،29؛ وتتيح تكنولوجيا خلايا ورقة مريحة للتلاعب بطبقات الأوعية الدموية30. ومع ذلك، لا يمنح هذه الاستراتيجيات القدرة على السيطرة على الزخرفة المكانية للمفرج، غالباً ما يؤدي إلى توزيع عشوائي للأوعية الدموية داخل بناء هندسة الأنسجة وإمكانية تكرار نتائج محدودة وهكذا. وخلال السنوات القليلة الماضية برز بيوبرينتينج كفئة لتمكين التكنولوجيات تجاه الحل لهذا التحدي، بسبب استعمالاتها لا مثيل لها لإيداع أنماط الأنسجة المعقدة في الدقة العالية وإمكانية تكرار نتائج طريقة تلقائية أو شبه الآلي31،32،33. بيوبرينتينج الذبيحة34،35،36،،من3738، جزءا لا يتجزأ من بيوبرينتينج39،،من4041، وهيكل أجوف،بيوبرينتينج/بيوفابريكيشن4243،44،45،،من4647،48،49،50،51،52،53 قد الجميع أظهر إمكانية توليد أنسجة الأوعية الدموية أو فاسكولاريزيد.

بدلاً من ذلك، وضعت استراتيجية بيوبرينتينج موائع جزيئية لاختلاق السقالات ميكروفيبروس مؤخرا، حيث بيوينك مختلطة مكونة من الجينات والجيلاتين ميثاكريلويل (جيلما) تم تسليمها عن طريق جوهر رأس متحدة مركز وحل كلوريد الكالسيوم (كاكل2) تم من خلال تدفق الغلاف الخارجي ل رأس الطباعة،من5455. البثق المشترك تدفقات اثنين يسمح ل crosslinking المادية الفورية المكون الجينات لتمكين تكوين ستوكات، بينما فوتوكروسلينكينج اللاحقة ضمان الاستقرار الدائم من السقالة ميكروفيبروس متعدد الطبقات. من المذكرة، تم العثور على خلايا بطانية مغلفة داخل ميكروفيبيرس بيوبرينتيد تتكاثر وتهاجر نحو أطراف ميكروفيبيرس على افتراض هياكل تشبه التجويف الذي يحاكي54،سرير الأوعية الدموية55. هذه بيوبرينتيد، أسرة الأوعية الدموية اندوثيلياليزيد يمكن أن يكون في وقت لاحق نشر مع الرغبة أنواع الخلايا الثانوية لمواصلة بناء الأنسجة فاسكولاريزيد55. وهكذا يوفر هذا البروتوكول إجراء مفصل مثل موائع جزيئية بيوبرينتينج استراتيجية لتمكين تصميم فوهة متحدة المركز، مما يضمن تصنيع مريحة للأنسجة فاسكولاريزيد للتطبيقات المحتملة في هندسة الأنسجة والنمذجة أورجانويد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كارديوميوسيتيس الفئران حديثي الولادة المستخدمة في هذا البروتوكول كانت معزولة من الفئران سبراغ داولي عمره 2 يوما عقب إجراءات راسخة56 وافقت عليها لجنة الاستخدام في مستشفى بريغهام والنساء ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-الأجهزة بيوبرينتير

  1. إدراج إبرة حادة أصغر (مثلاً، ز 27، 1 بوصة) كنواة في مركز إبرة حادة أكبر (مثلاً، 18 جرام، نصف بوصة) غمد لبناء طبقة مزدوجة، رأس الطباعة موائع جزيئية متحدة المركز؛ تأكد من أن الإبرة الأساسية هو جاحظ قليلاً (~ 1 مم) أطول من الغلاف الخارجي (الشكل 1أ). عادة ما يتم ضبط المحاذاة يدوياً، لكن إذا كانت الفواصل اللازمة ذات أحجام مناسبة يمكن أن تقع وقتيا بين الإبر الداخلي/الخارجي في كلا من الجانبين للبرميل لمساعدة محاذاة متحدة المركز والتلميح. إغلاق تقاطع برميل مع الغراء الإيبوكسي وإزالة الفواصل المحاذاة من الجانب تلميح عند الاقتضاء.
  2. إدراج آخر إبرة (23G) في فوهة الإبرة المركزية في اتجاه عكسي.  ثم إنشاء حفرة على جانب فوهة الإبرة الخارجي وإدراج موصل معدني لمطابقة حجم في الحفرة، متبوعاً بالختم مع الغراء الإيبوكسي.
  3. توصيل المداخل لرأس الطباعة لضخ حقنه مزدوجة القناة للحقن في بيوينك والحل كروسلينكينج، كل على حدة، من خلال اثنين من الأنابيب البلاستيكية. جبل الطارد إلى رأس بيوبرينتير استخدام حامل بلاستيك المصنوعة من poly(methyl methacrylate) (البولي ميثيل ميثا اكريلات).
    ملاحظة: اختيار بيوبرينتير يعتمد على توافر. وفي حالتنا، اختبرناها بنجاح هذا الإعداد على عدة بيوبرينتيرس المتاحة تجارياً. ومع ذلك، أي بيوبرينتير أن ملامح مرحلة يجهز x-y-z ينبغي، من حيث المبدأ، تمكين التكامل من هذا رأس موائع جزيئية.

2-بيوبرينتينج السرير والأوعية الدموية ميكروفيبروس

  1. جعل بيوينك استخدام خليط من الجينات (4 w/v%، اللزوجة منخفضة) والجيلاتين57،ميثاكريلويل (جيلما، w/v% 1-2)58فوتوينيتياتور 2959 إيرجاكوري (0.2-0.5 wt.%) حلت في 25 مم 2-[4-(2-hydroxyethyl) بيبيرازين-1-يل] الإيثان حمض السلفونيك (حبيس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على 10 vol.% الجنيني البقري المصل (FBS).
  2. جعل حل كاكل 0.3 م2 في حبيس المخزن المؤقت الذي يحتوي على 10 vol.% FBS كالسائل الناقل كروسلينكينج.
  3. مباشرة قبل بيوبرينتينج، ننأى بالوريد السري البشرية خلايا بطانية (هوفيكس) من قوارير استخدام العلاج عن طريق 0.05 w/v% التربسين لمدة 5-10 دقائق، ومن ريسوسبيند الخلايا في بيوينك بتركيز 5-10 × 106 خلايا/مل. "الماصة؛" التعليق ببطء من 5 إلى 10 مرات لضمان توزيع متجانس.
  4. بدء حقن السوائل بيوينك/كروسلينكينج باستخدام مضخة حقنه مزدوجة القناة بنفس المعدلات تدفق 5 ميليلتر/مل. يمكن السماح تدفق تشغيل بشكل مستمر لمدة تصل إلى 1 دقيقة حتى أنهم استقرار. وفي وقت لاحق، بدء حركة رأس الطباعة بالسيطرة على بيوبرينتير بسرعة ترسب حوالي 4 مم/ثانية (الشكل 1ب). قد تحتاج إلى هذه السرعات بشكل جيد ضبط مع كل الإعداد الجديدة لضمان بيوبرينتينج الأمثل. عادة ما يتم إجراء عملية بيوبرينتينج في درجة حرارة الغرفة (21-25 درجة مئوية) ولكن يمكن تغيير درجة الحرارة هذه. ينبغي أن تسمح بعملية بيوبرينتينج جيلاتيون الأيونية سريعة لمكونات الجينات وترسب السقالة ميكروفيبروس (الشكل 1ب).
  5. بعد السقالة بيوبرينتيد، تحقيق جيلاتيون الكيميائية بمزيد فوتوكروسلينكينج المكون جيلما، في حوالي 5-10 ميغاواط/سم2 من الأشعة فوق البنفسجية (360 480 nm) ل 20-30 s (الشكل 1ج).
  6. وعقب بيوبرينتينج وكروسلينكينج، بلطف شطف السقالة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة كاكل الزائدة2. تغيير الثقافة سقالة هوفيكس لادن ميكروفيبروس في نمو الخلية البطانية المتوسطة (EGM) في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5 vol.% CO2 لمدة 16 يوما مع المتوسطة على الأقل مرة كل يومين. رصد مورفولوجيس هوفيكس تحت مجهر أثناء فترة الثقافة.

3-بناء الأنسجة فاسكولاريزيد

  1. بمجرد هوفيكس هاجروا إلى أطراف ميكروفيبيرس في سقالة لتشكيل هياكل مثل التجويف (الشكل 1د)، استرداد السقالة ووضعه برفق على سطح سطح الماء (مثلاً، لوح من بوليميثيلسيلوكساني [PDMS]). استخدام قطعة من ورق الترشيح العقيمة لإزالة جميع المتوسطة بعناية من الفضاء فراغي من السقالة مع القوة الشعرية.
  2. فورا إضافة قطره (حوالي 20-40 ميكروليتر) تعليق من نوع الخلية الثانوية (مثلاً، كارديوميوسيتيس) في المتوسط في كثافة 1-10 × 106 خلايا/مل فوق السقالة، الذي ينبغي أن التسلل كامل المساحة المتداخلة من السقالة (الشكل 1ﻫ). احتضان هذا تكوين في حاضنة (37 درجة مئوية، 5 vol.% CO2، 95% رطوبة نسبية) عن 0.5-2 ح للسماح للخلايا للانضمام إلى ميكروفيبيرس الفردية. مراقبة حجم الحبرية على مدى الفترة تكفل التقيد لا تبخر ملحوظ.
  3. بلطف تغسل السقالات التي تهز في حمام برنامج تلفزيوني لإزالة أي من الخلايا غير ملتصقة والثقافة البناء في المتوسطة ذات الصلة حتى يتم تشكيل الأنسجة vascularized المرجوة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الاستراتيجية بيوبرينتينج موائع جزيئية تسمح بيوبرينتينج البثق المباشر من السقالات ميكروفيبروس استخدام منخفض اللزوجة بيوينكس،من5455. كما هو موضح في الشكل 2أ، سقالة بحجم 6 × 6 × 6 مم3 التي تحتوي على > يمكن أن تكون طبقات 30 من ميكروفيبيرس بيوبرينتيد داخل 10 دقيقة. Crosslinking الأيونية الفوري المكون الجينات مع كاكل2 يسمح للسلامة الهيكلية ممتازة أثناء عملية بيوبرينتينج أثناء فوتوكروسلينكينج المادية اللاحقة جيلما المكون الذي يكفل الاستقرار الطويل الأجل من السقالة ميكروفيبروس بيوبرينتيد، كما هو مبين في عرض أعلى وعرض الجانب تظهر في الأرقام 2 و 2 ج. ميكروفيبيرس يتحقق في هذه الحالة، وفقا للشروط بيوبرينتينج المحددة في البروتوكول، وكانت حوالي 100-150 ميكرومتر في القطر، والذي سيكون قليلاً زيادة ساعات العمل الإضافية مع تورم.

عملية بيوبرينتينج، بما في ذلك قذف موائع جزيئية في بيوينك، وكروسلينكينج الأيونية، وفوتوكروسلينكينج، لا يؤثر إلى حد كبير جدوى هوفيكس مغلفة. يمكن الحفاظ على الخلايا إمكانية عالية نسبيا > 80% بعد الانتهاء من جميع هذه الإجراءات (الشكل 2د). كما ذكرت سابقا54،55، هوفيكس يمكن تدريجيا تتكاثر وتهاجر في ميكروفيبيرس من التوزيع العشوائي في بادئ الأمر في اليوم 0 (الشكل 2ه) لأطراف ميكروفيبيرس لتحمل هياكل مثل التجويف في يوم 16 وظيفة-بيوبرينتينج في الثقافة (الشكل 2و). مثل هذا سلوك ملاحظة هوفيكس كان احتمالاً بسبب ميل خلايا بطانية يحركها واجهة الأصيلة، فضلا عن توافر أعلى من المواد المغذية والأكسجين المحيطة ميكروفيبيرس مما في55،الداخلية على59.

سقالة ميكروفيبروس يمكن أن تعمل أيضا كمنبر مستقل لهندسة الأنسجة. استخدام أنسجة عضلة القلب على سبيل مثال، كانت الفئران حديثي الولادة cardiomyocytes المصنف على مساحة فراغي من السقالة بيوبرينتيد في كثافة 5 × 106 خلايا/مل، ومثقف في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 10 vol.% FBS. تم تغيير المتوسط كل يوم في 2-3 أيام الأولى حتى بدأت كارديوميوسيتيس الضرب، وبعد ذلك تبادلت ½ فقط كان متوسط كل 2-3 أيام55،60،،من6162. يمكن الحفاظ على الخلايا عفوية والمتزامنة ضرب لمدة تصل إلى 9-28 يوما تبعاً للمصدر الخلية وتكوين السقالات55. كما أظهر cardiomyocytes الناضجة على السقالة التعبير القوى عن المؤشرات الحيوية القلب الوظيفية كما هو موضح في الصور الأسفار [كنفوكل] في الشكل 3، بما في ذلك ساركوميريك α-أكتينين (الشكل 3ب) وكونيكسين-43 (الشكل 3ج).

الجمع بين خلايا بطانية ونوع الخلية الثانوية، vascularized أنسجة يمكن مواصلة تشييد. مرة أخرى، استخدام عضلة القلب على سبيل مثال، بعد أن شكلت السرير الأوعية الدموية في سقالة ميكروفيبروس بيوبرينتيد بعد ما يقرب من 16 يوما ثقافة، المصنف cardiomyocytes الفئران حديثي الولادة كانت في وقت لاحق إلى المساحة المتداخلة من السقالة. بعد استزراع والنضج في متوسط مشتركة مؤلفة من 1:1 حجم الحصص التموينية من EGM:DMDM، يمكن أن يتشكل أنسجة عضلة القلب اندوثيلياليزيد العارضة الضرب عفوية ومتزامن55. وكشفت الصور الأسفار [كنفوكل] طائرة واحدة في الشكل 4 كذلك التعايش بين كل أنواع الخلايا، مع هوفيكس موجودة أساسا في حدود ميكروفيبيرس (الشكل 4ب) وفي cardiomyocytes المحيطة الخارجيات ميكروفيبيرس (الشكل 4ج).

Figure 1
الشكل 1 : نيات استراتيجية بيوبرينتينج موائع جزيئية لتوليد أنسجة فاسكولاريزيد.
(أ) تصميم رأس الطباعة الأساسية-غمد المحور لقذف المشارك بيوينك المركب و كاكل2. (ب-E) إنشاء تخطيطات عرض إجراء تصنيع الأنسجة فاسكولاريزيد. وقد تم تعديل هذا الرقم بإذن من الرقم55. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : بيوبرينتينج سرير الأوعية الدموية ميكروفيبروس.
(أ) صورة فوتوغرافية تظهر سقالة ميكروفيبروس 30-طبقة بيوبرينتيد. (ب، ج) آراء ميكروجرافس عرض سقالة بيوبرينتيد العليا والجانبية. (د) "السلامة من هوفيكس" آدن في سقالة ميكروفيبروس بيوبرينتيد. الأخضر والأحمر تشير إلى الخلايا الحية والميتة، على التوالي. (ه، و) ميكروجرافس fluorescence عرض المنظمة للبروتين فوريسسينت الخضراء (التجارة والنقل)-هوفيكس في ميكروفيبيرس بيوبرينتيد في اليوم 0 ويوم 16 وظيفة بيوبرينتينج، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : النمو اللاحق كارديوميوسيتيس على سقالة ميكروفيبروس بيوبرينتيد.
ميكروجرافس fluorescence تظهر الأنوية (أ) ، (ب) ساركوميريك α-أكتينين، (ج) كونيكسين-43، واستعلاء (د) . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : بناء أنسجة عضلة القلب اندوثيلياليزيد.
ميكروجرافس fluorescence تظهر الأنوية (أ) ، (ب) التجارة والنقل-هوفيكس، (ج) واكتين هوفيكس وكارديوميوسيتيس، واستعلاء (د) . اقحم في د يظهر صورة التكبير أقل من أنسجة عضلة القلب اندوثيلياليزيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مجموعة البيانات التكميلية.
ملف عينة ز-مدونة بيوبرينتينج 6 × 6 مم2 شعرية مربعة مع 220 ميكرون التباعد بين ميكروفيبيرس المجاورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بناء رأس الطباعة co-المحوري يمثل خطوة حاسمة نحو بيوبرينتينج موائع جزيئية ناجحة يتيح التنفيذ المتزامن لكلا بيوينك من صلب وعامل كروسلينكينج من الغمد. بينما في هذا البروتوكول أنشئ سبيل مثال رأس طباعة باستخدام إبرة ز 27 الأساسية وابرة ز 18 ك shell، يجوز تمديدها سهولة إلى مجموعة متنوعة من تركيبات باستخدام أحجام مختلفة من الإبر. بيد سيتطلب التغيير في أحجام الإبرة، وتسليم النتائج في التغيير مبلغ التدفق في كل مرحلة من المراحل، التحسين زيادة معدلات تدفق سواء في بيوينك وعامل crosslinking (فردياً للتعديل باستخدام المحاقن مضختين بدلاً من واحدة مزدوجة القناة)، ويحتمل أن تكون أيضا سرعة ترسب تكبدتها في بيوبرينتير.

مجموعة المعلمات (أحجام الإبر ومعدلات التدفق وسرعة الترسب) في البروتوكول الحالي أدى إلى ميكروفيبيرس بيوبرينتيد التي يبلغ قطرها حوالي 120 ميكرومتر فورا بعد الترسيب، الذي سوف يرتفع إلى ما يقرب من 150 ميكرون بعد الموازنة في المتوسط55. أيضا تقريبا يساوي حجم سمك طبقة من بنيات بيوبرينتيد نظراً لوجود لا يوجد مسافة بين الطبقات ميكروفيبيرس. قطر ميكروفيبيرس بيوبرينتيد دالة لكل ثلاثة معلمات54،63؛ حجم الإبرة الأساسية لرأس الطباعة ومعدل التدفق بيوينك هي ارتباطاً إيجابيا بقطر ميكروفيبيرس، بينما حجم الإبرة غمد، معدل تدفق وكيل كروسلينكينج، وسرعة الترسب ارتباطاً سلبيا مع قطر ميكروفيبيرس. السيطرة على حركة رأس الطباعة و/أو المرحلة الآلية التي ستسمح بترسب السقالات ميكروفيبروس من هياكل التعسفي54،55.

وعلاوة على ذلك، قد تتغير صياغة بيوينك صورة بيوبرينتينج، وكذلك. على سبيل المثال، يمكن أن تكون كمية الجينات وجيلما التضمين قليلاً وفقا لتطبيقات محددة، ومن الممكن أن تمزج مواد إضافية في بيوينك، مثل البولي إيثيلين جلايكول-تيتراكريلاتي (بيتا) أن الزيادات وميكانيكا ميكروفيبيرس بيوبرينتيد40. كما يحدد crosslinking الأشعة فوق البنفسجية الخواص الميكانيكية لمركز ميكروفيبيرس بيوبرينتيد، وكذلك يمكن أن تؤثر على سلوك خلايا بطانية مضمن54. وكان الأمثل المعلمات في هذا البروتوكول هوفيكس. غير أنه من المتوقع، لكل نوع من أنواع مختلفة من خلايا بطانية سوف تحتاج إلى أن إعادة الأمثل لتحقيق تشكيل التجويف في ميكروفيبيرس معلمات crosslinking.

أن البذور نوع خلية الثانوية على السرير بيوبرينتيد والأوعية الدموية، من الضروري وضع سقالة على قطعة من سطح الماء، وضمان أن تتم إزالة معظم المتوسطة في المساحة المتداخلة من السقالة. سيسمح هذا تسلل فورا تعليق خلية إلى هيكل ميكروفيبروس مع الحبرية الحرة--الدائمة وتغليف السقالة أثناء البذر، تحقيق الحد الأقصى من عدد الخلايا التي تعلق على السطح ميكروفيبيرس. على الرغم من أن استخدمت بكثافة عالية نسبيا من كارديوميوسيتيس في 5 × 106 خلايا/مل لبناء أنسجة عضلة القلب في البروتوكول الحالي، يمكن ضبطها مثل هذه الكثافة تعسفاً لتطابق أنواع معينة من الأنسجة. من المهم أيضا الحفاظ على بيئة هوميديفيد، التي يمكن أن تتحقق عن طريق ملء الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني محيط السقالة (أي، في الآبار المحيطة بها أو المساحة المحيطة بلوح PDMS)، ضمان أن لا تتبخر كمية صغيرة من المتوسطة للبذر على مدى الفترة من البذر.

وباختصار، قدمنا بروتوكول بيوبرينتينج موائع جزيئية تفصيلية لتلفيق مريحة للأنسجة فاسكولاريزيد. في هذه الاستراتيجية، رأس أول أكسيد الكربون-محوري غمد أساسية يستخدم لتمكين البثق متزامنة من بيوينك الهجين من عامل الأساسية وكروسلينكينج من الغمد. عند قذف المشارك، بيوينك يخضع فورا crosslinking المادية لعنصرها الجينات تشكل سقالة ميكروفيبروس طبقات حسب ما هو مبرمج بحركة بيوبرينتير، بينما يتم بناء كامل مزيد كيميائيا فوتوكروسلينكيد جيلما مكون للسماح للاستقرار على المدى الطويل. خلايا بطانية مغلفة في ميكروفيبيرس أثناء عملية بيوبرينتينج يمكن أن تتكاثر وتهاجر إلى أطراف افتراض هياكل مثل التجويف، تحول السقالة في سرير الأوعية الدموية. قبل البذر نوع خلية الثانوية، يمكن إنشاء بناء أنسجة فاسكولاريزيد في وقت لاحق. هذه الاستراتيجية بيوبرينتينج موائع جزيئية فريدة من نوعها، ويمكن تمديدها مريح لمجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة مثل العضلات الكبد، والهيكل العظمى، والسرطانات إلى جانب عضلة القلب يتضح في البروتوكول الحالي، بالجمع الرشيد بين أنواع الخلايا المطلوب والمصممة خصيصا لأنماط من السقالات ميكروفيبروس بيوبرينتيد. يمكن استخدام بنيات vascularized الأنسجة المنتجة بهذه طريقة لتجديد الأنسجة في الجسم الحي أو لنمذجة الأنسجة في المختبر .

وهناك العديد من القيود المرتبطة باستراتيجية بيوبرينتينج موائع جزيئية الموصوفة في هذا البروتوكول. أولاً، قطر ميكروفيبيرس بيوبرينتيد يقتصر على ميكرومتر مئات قليلة بسبب الحاجز نشر مصفوفة المائية للحل2 كاكل لكفاءة التشعب المكون الجينات في صلب. Crosslinking المادية المفرطة منخفضة الكثافة من شأنه أن يجعل هيكل متعدد الطبقات غير مستقرة. ثانيا، قد تمارس وكيل crosslinking المادية للحل2 كاكل من آثار سلبية على بعض أنواع الخلايا البطانية التي أكثر هشاشة من هوفيكس، مثل الخلايا السلف بطانية. إمكانية استخدام أسلوب بيوبرينتينج لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا غشائي قد تتطلب إجراء تحقيقات إضافية. ثالثا، في حين يمكن أن تشكل خلايا بطانية هياكل مثل التجويف داخل ميكروفيبيرس، النوى من هذه ميكروفيبيرس ليست جوفاء لتمكين نضح. ولذلك، تزال تقدم المواد المغذية والأكسجين أساسا من خلال المساحة المتداخلة في السقالات بيوبرينتيد. تكييف مواد الذبيحة كعنصر فوتوكروسلينكابل في بيوينك64 قد حل هذه المشكلة في الإصدارات المستقبلية من هذه التكنولوجيا. بدلاً من ذلك، بنيات بيوبرينتيد ميكروفيبروس جوفاء هياكل42،43،،من6566،،من6768 قد تستعمل كسرير الأوعية الدموية للتأكد من نضح مباشرة للأنسجة فاسكولاريزيد. آخر، بيوبرينتينج أنسجة السريرية الحجم قد تكون صعبة، التي يرجح أن يمكن معالجتها بدمج تصميم صفت موائع جزيئية رؤوس69 لتحقيق توسع نطاق بيوبرينتينج في إنتاجية عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

الكتاب الاعتراف بالمعهد الوطني للسرطان من "المعاهد الوطنية للصحة الطريق" إلى "الاستقلال جائزة" (K99CA201603).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich A0682 BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) Sigma-Aldrich 410896 98%
HEPES buffer Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 10438026 Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001GFP GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific 12430054 High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system Excelitas Technologies OmniCure S2000 Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in Tissue Engineering. Sci. Am. 300 (5), 64-71 (2009).
  3. Langer, R. Tissue Engineering: Status and Challenges. E-Biomed: J.Regen. Med. 1 (1), 5-6 (2004).
  4. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering Complex Tissues. Sci. Transl. Med. 4 (160), 112 (2012).
  5. Biondi, M., Ungaro, F., Quaglia, F., Netti, P. A. Controlled Drug Delivery in Tissue Engineering. Adv. Drug Del. Rev. 60 (2), 229-242 (2008).
  6. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled Growth Factor Delivery for Tissue Engineering. Adv. Mater. 21 (32-33), 3269-3285 (2009).
  7. Hubbell, J. A. Biomaterials in Tissue Engineering. Nat. Biotechnol. 13 (6), 565-576 (1995).
  8. Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in Biomaterials for Tissue Engineering. Nat. Mater. 8 (6), 457-470 (2009).
  9. Rice, J. J., et al. Engineering the Regenerative Microenvironment with Biomaterials. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 57-71 (2012).
  10. Zhang, Y. S., Xia, Y. Multiple Facets for Extracellular Matrix Mimicking in Regenerative Medicine. Nanomedicine. 10 (5), 689-692 (2015).
  11. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  12. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic Organs-on-Chips. Nat. Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-Chips at the Frontiers of Drug Discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Seeking the Right Context for Evaluating Nanomedicine: From Tissue Models in Petri Dishes to Microfluidic Organs-on-a-Chip. Nanomedicine. 10, 685-688 (2015).
  15. Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., Van Noort, D., Yu, H. Towards a Human-on-Chip: Culturing Multiple Cell Types on a Chip with Compartmentalized Microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
  16. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  17. Sung, J. H., et al. Microfabricated Mammalian Organ Systems and Their Integration into Models of Whole Animals and Humans. Lab Chip. 13 (7), 1201-1212 (2013).
  18. Wikswo, J. P. The Relevance and Potential Roles of Microphysiological Systems in Biology and Medicine. Exp. Biol. Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  19. Yum, K., Hong, S. G., Healy, K. E., Lee, L. P. Physiologically Relevant Organs on Chips. Biotechnol. J. 9 (1), 16-27 (2014).
  20. Nomi, M., Atala, A., Coppi, P. D., Soker, S. Principals of Neovascularization for Tissue Engineering. Mol. Aspects Med. 23 (6), 463-483 (2002).
  21. Jain, R. K., Au, P., Tam, J., Duda, D. G., Fukumura, D. Engineering Vascularized Tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 821-823 (2005).
  22. Rouwkema, J., Rivron, N. C., Van Blitterswijk, C. A. Vascularization in Tissue Engineering. Trends Biotechnol. 26 (8), 434-441 (2008).
  23. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Sci. Transl. Med. 4 (160), 123 (2012).
  24. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
  25. Perets, A., et al. Enhancing the Vascularization of Three-Dimensional Porous Alginate Scaffolds by Incorporating Controlled Release Basic Fibroblast Growth Factor Microspheres. J. Biomed. Mater. Res. A. 65 (4), 489-497 (2003).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining Neovascularization of a Scaffold through Staged Release of Vascular Endothelial Growth Factor-A and Platelet-Derived Growth Factor-BB. Tissue Eng. A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of Adult Mesenchymal Stem Cells on in Vitro Vascular Formation. Tissue Eng. A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  28. Quint, C., et al. Decellularized Tissue-Engineered Blood Vessel as an Arterial Conduit. Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  29. Choi, S. -W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in Biodegradable Inverse Opal Scaffolds with Uniform and Precisely Controlled Pore Sizes. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 145-154 (2013).
  30. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of Three-Dimensional Vascularized Cardiac Tissue with Cell Sheet Engineering. J. Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  31. Zhang, Y. S., et al. 3D Bioprinting for Tissue and Organ Fabrication. Ann. Biomed. Eng. 45 (1), 148-163 (2017).
  32. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv. Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  33. Murphy, S. V., Atala, A. 3d Bioprinting of Tissues and Organs. Nat. Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  34. Miller, J. S., et al. Rapid Casting of Patterned Vascular Networks for Perfusable Engineered Three-Dimensional Tissues. Nat. Mater. 11 (9), 768-774 (2012).
  35. Bertassoni, L. E., et al. Hydrogel Bioprinted Microchannel Networks for Vascularization of Tissue Engineering Constructs. Lab Chip. 14 (13), 2202-2211 (2014).
  36. Kolesky, D. B., et al. 3d Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  37. Lee, V. K., et al. Creating Perfused Functional Vascular Channels Using 3d Bio-Printing Technology. Biomaterials. 35 (28), 8092-8102 (2014).
  38. Zhang, Y. S., et al. Bioprinted Thrombosis-on-a-Chip. Lab Chip. 16, 4097-4105 (2016).
  39. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the Granular Gel Medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  40. Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3d Printing of Shear-Thinning Hydrogels into Self-Healing Hydrogels. Adv. Mater. 27 (34), 5075-5079 (2015).
  41. Hinton, T. J., et al. Three-Dimensional Printing of Complex Biological Structures by Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  42. Jia, W., et al. Direct 3d Bioprinting of Perfusable Vascular Constructs Using a Blend Bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  43. Zhang, Y., et al. In Vitro Study of Directly Bioprinted Perfusable Vasculature Conduits. Biomaterials Science. 3 (1), 134-143 (2015).
  44. Gao, Q., He, Y., Fu, J. -Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial Nozzle-Assisted 3D Bioprinting with Built-in Microchannels for Nutrients Delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  45. Cornock, R., Beirne, S., Thompson, B., Wallace, G. G. Coaxial Additive Manufacture of Biomaterial Composite Scaffolds for Tissue Engineering. Biofabrication. 6 (2), 025002 (2014).
  46. Duan, B., Hockaday, L. A., Kang, K. H., Butcher, J. T. 3D Bioprinting of Heterogeneous Aortic Valve Conduits with Alginate/Gelatin Hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. A. 101 (5), 1255-1264 (2013).
  47. Skardal, A., et al. Photocrosslinkable Hyaluronan-Gelatin Hydrogels for Two-Step Bioprinting. Tissue Eng. A. 16 (8), 2675-2685 (2010).
  48. Li, S., et al. Direct Fabrication of a Hybrid Cell/Hydrogel Construct by a Double-Nozzle Assembling Technology. J. Bioact. Compatible Polym. 24 (3), 249-265 (2009).
  49. Visser, J., et al. Biofabrication of Multi-Material Anatomically Shaped Tissue Constructs. Biofabrication. 5 (3), 035007 (2013).
  50. Boyd, D. A., Adams, A. A., Daniele, M. A., Ligler, F. S. Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape. Journal of visualized experiments: JoVE. (83), e50958 (2014).
  51. Daniele, M. A., Adams, A. A., Naciri, J., North, S. H., Ligler, F. S. Interpenetrating Networks Based on Gelatin Methacrylamide and Peg Formed Using Concurrent Thiol Click Chemistries for Hydrogel Tissue Engineering Scaffolds. Biomaterials. 35 (6), 1845-1856 (2014).
  52. Daniele, M. A., Boyd, D. A., Adams, A. A., Ligler, F. S. Microfluidic Strategies for Design and Assembly of Microfibers and Nanofibers with Tissue Engineering and Regenerative Medicine Applications. Adv. Healthcare Mater. 4 (1), 11-28 (2015).
  53. Daniele, M. A., Radom, K., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfluidic Fabrication of Multiaxial Microvessels Via Hydrodynamic Shaping. RSC Advances. 4 (45), 23440-23446 (2014).
  54. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low Viscosity Bioink. Adv. Mater. 28 (4), 677-684 (2015).
  55. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting 3D Microfibrous Scaffolds for Engineering Endothelialized Myocardium and Heart-on-a-Chip. Biomaterials. 110, 45-59 (2016).
  56. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic Patterning for Fabrication of Contractile Cardiac Organoids. Biomed. Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
  57. Yue, K., et al. Synthesis, Properties, and Biomedical Applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  58. Loessner, D., et al. Functionalization, Preparation and Use of Cell-Laden Gelatin Methacryloyl-Based Hydrogels as Modular Tissue Culture Platforms. Nat. Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  59. Aung, A., Theprungsirikul, J., Lim, H. L., Varghese, S. Chemotaxis-Driven Assembly of Endothelial Barrier in a Tumor-on-a-Chip Platform. Lab Chip. 16, 1886-1898 (2016).
  60. Shin, S. R., et al. A Bioactive Carbon Nanotube-Based Ink for Printing 2d and 3d Flexible Electronics. Adv. Mater. 28 (17), 3280-3289 (2016).
  61. Shin, S. R., et al. Aptamer-Based Microfluidic Electrochemical Biosensor for Monitoring Cell Secreted Cardiac Biomarkers. Anal. Chem. 88, 10019-10027 (2016).
  62. Zhang, Y. S., et al. Google Glass-Directed Monitoring and Control of Microfluidic Biosensors and Actuators. Sci. Rep. 6, 22237 (2016).
  63. Colosi, C., et al. Rapid Prototyping of Chitosan-Coated Alginate Scaffolds through the Use of a 3d Fiber Deposition Technique. J. Mater. Chem. B. 2 (39), 6779-6791 (2014).
  64. Zhu, W., et al. Direct 3D Bioprinting of Prevascularized Tissue Constructs with Complex Microarchitecture. Biomaterials. 124, 106-115 (2017).
  65. Yu, Y., Zhang, Y., Martin, J. A., Ozbolat, I. T. Evaluation of Cell Viability and Functionality in Vessel-Like Bioprintable Cell-Laden Tubular Channels. J. Biomech. Eng. 135 (9), 091011-091011 (2013).
  66. Zhang, Y., Yu, Y., Chen, H., Ozbolat, I. T. Characterization of Printable Cellular Micro-Fluidic Channels for Tissue Engineering. Biofabrication. 5 (2), 025004 (2013).
  67. Zhang, Y., Yu, Y., Ozbolat, I. T. Direct Bioprinting of Vessel-Like Tubular Microfluidic Channels. J. Nanotechnol. Eng. Med. 4 (2), 020902 (2013).
  68. Dolati, F., et al. In Vitro Evaluation of Carbon-Nanotube-Reinforced Bioprintable Vascular Conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  69. Hansen, C. J., et al. High-Throughput Printing Via Microvascular Multinozzle Arrays. Adv. Mater. 25 (1), 96-102 (2013).

Tags

الهندسة الحيوية، 126 قضية، بيوبرينتينج، الطب التجديدي، وهندسة الأنسجة، أورجانويدس، الجهاز على شريحة، والأوعية الدموية، اندوثيلياليزيشن، ميكروفيبيرس
فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen,… More

Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen, A. M. Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids. J. Vis. Exp. (126), e55957, doi:10.3791/55957 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter