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Bioengineering

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55957
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University
* These authors contributed equally

Summary

Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.

Abstract

Vaskularisierte Gewebe-Engineering konstruiert und Organellen wurde historisch schwierig. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode basiert auf mikrofluidische Bioprinting um ein Gerüst mit mehrschichtigen interlacing Hydrogel Mikrofasern zu generieren. Um glatt zu erreichen war Bioprinting, ein Kern-Mantel mikrofluidischen Druckkopf enthält eine zusammengesetzte Bioink Formulierung aus den Kernfluss und die Vernetzung Lösung durchgeführt durch die Scheide-Fluss, extrudiert entworfen und auf die Bioprinter ausgestattet. Durch das Mischen Gelatine Methacryloyl (GelMA) mit Alginat, ein Polysaccharid, das momentane ionische Vernetzung in Anwesenheit von erfährt wählen Sie zweiwertige Ionen, gefolgt von einer sekundären Photocrosslinking der GelMA Komponente zur dauerhaften Stabilisierung zu erreichen, ein Microfibrous Gerüst konnte mit dieser Strategie der Bioprinting abgerufen werden. Wichtig ist, können die Endothelzellen gekapselt im Inneren der Bioprinted Mikrofasern die Lumen-ähnliche Strukturen wie das Gefäßsystem im Laufe der Kultur für 16 Tage bilden. Das endothelialized Microfibrous Gerüst kann als vaskuläre Bett weiterverwendet werden, um eine vaskularisierte Gewebe durch anschließende Aussaat des sekundären Zelltyps in den interstitiellen Raum der die Mikrofasern zu konstruieren. Mikrofluidische Bioprinting bietet eine allgemeine Strategie bequem Engineering vaskularisierte Gewebe bei High Fidelity.

Introduction

Tissue engineering Ziele Funktionsgewebe Ersatzstoffe zu generieren, die verwendet werden können, um zu ersetzen, wiederherstellen oder ergänzen diese verletzten oder erkrankten in den menschlichen Körper1,2,3,4, oft durch eine Kombination der gewünschten Zelltypen, bioaktive Moleküle5,6und Biomaterialien7,8,9,10. Vor kurzem haben Gewebe-engineering-Technologien auch zunehmend angenommen, um in-vitro- Gewebe und Organ Modelle generieren, die wichtigen Funktionen von ihren Kollegen in Vivo für Anwendungen wie die Medikamentenentwicklung, Ersatz von konventionellen vereinfachenden planar Zelle Kulturen11,12,13,14,15,16,17,18,19zu imitieren. In beiden Situationen die Fähigkeit, komplexe Mikroarchitektur und hierarchische Struktur der menschlichen Gewebe rekapitulieren ist entscheidend in die Lage versetzen Funktionalität der technischen Gewebe10, und Möglichkeiten, um den technischen Geweben eine vaskuläre Netzwerk integrieren sind insbesondere der Nachfrage da Vaskularisierung eine der größten Herausforderungen auf dem Feld20,21,22,23 stellt.

Bis heute eine Vielzahl von Ansätzen wurden entwickelt in diesem Zusammenhang in einem Versuch, Blutgefäß Strukturen in veränderter Gewebe Konstrukte mit unterschiedlichem Erfolg8zu bauen. Beispielsweise können Selbstmontage von Endothelzellen zur Erzeugung von mikrovaskulären Netze24; Lieferung von angiogene Wachstumsfaktoren induziert nachhaltige Neovaskularisation25,26; Verwenden von vaskulären Vorläuferzellen und Perizyten erleichtert endothelial Zelle Wachstum und Montage24,27; Gestaltung von Gerüst Eigenschaften ermöglicht präzise Modulation der Vaskularisierung28,29; und Blatt-Zelltechnologie ermöglicht die bequeme Manipulation von vaskulären Schichtung30. Dennoch diese Strategien nicht die Fähigkeit zur Steuerung der räumlichen Strukturierung des Gefäßsystems, führt häufig zu zufälligen Verteilung der Blutgefäße innerhalb ein veränderter Gewebe Konstrukt und damit begrenzte Reproduzierbarkeit verleihen. In den letzten Jahren hat eine Klasse von Basistechnologien zur Lösung so eine Herausforderung, durch ihre unvergleichliche Vielseitigkeit der Hinterlegung komplexe Gewebe Muster am High Fidelity und Reproduzierbarkeit in eine automatisierte oder halbautomatisierte Weise31,32,33Bioprinting entwickelt. Opfer Bioprinting34,35,36,37,38, eingebettete Bioprinting39,40,41und hohlen Struktur Bioprinting/Biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 haben alle bewiesen die Machbarkeit Gefäß- oder vaskularisierte Gewebe zu erzeugen.

Alternativ eine mikrofluidischen Bioprinting Strategie, Microfibrous Gerüste zu fabrizieren vor kurzem entwickelt worden, wo ein Hybrid-Bioink bestehend aus Alginat und Gelatine Methacryloyl (GelMA) wurde durch den Kern einer konzentrischen Druckkopf und einen Kalzium-Chlorid (CaCl2) Lösung geliefert erfolgte durch den Außenmantel Fluss der Druckkopf54,55. Die Co-Extrusion der zwei Ströme durfte für sofortige physikalische Vernetzung der Alginat Komponente Mikrofaser Bildung zu ermöglichen, während spätere Photocrosslinking dauerhafte Stabilisierung der mehrschichtigen Microfibrous Gerüst gewährleistet. Der Hinweis fanden sich Endothelzellen gekapselt innerhalb der Bioprinted-Mikrofasern zu vermehren und migrieren zu den Peripherien der Mikrofasern vorausgesetzt Lumen-ähnliche Strukturen, die die vaskuläre Bett54,55nachgeahmt. Diese Bioprinted endothelialized vaskuläre Betten konnte anschließend gefüllt mit gewünschten weiterführenden Zelltypen, vaskularisierte Gewebe55weiter zu bauen. Dieses Protokoll bietet somit ein detailliertes Verfahren einer solchen mikrofluidische Bioprinting Strategie durch die konzentrische Düse Design, sorgt für bequeme Herstellung von vaskularisierte Gewebe für potenzielle Anwendungen in der Gewebetechnik und organoide Modellierung ermöglicht.

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Protocol

Der neonatalen Ratte Herzzellen in diesem Protokoll verwendeten wurden isoliert von 2 Tage alten Sprague-Dawley Ratten nach einem etablierten Verfahren56 durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Brigham and Women es Hospital genehmigt.

1. Instrumente der Bioprinter

  1. Legen Sie eine kleinere stumpfe Nadel (z.B., 27 G, 1 Zoll) als Kern in der Mitte einer größeren stumpfen Nadel (z.B., 18 G, ½ Zoll) als die Hülle, die Dual-Layer-, konzentrische mikrofluidischen Druckkopf zu konstruieren; Stellen Sie sicher, dass die Kern-Nadel leicht hervorstehenden ist (~ 1 mm) länger als die äußere Hülle (Abb. 1A). Die Ausrichtung ist in der Regel manuell eingestellt, aber können wenn notwendig Abstandhalter der richtige Größen zeitlich zwischen der inneren/äußeren Nadeln auf die Spitze und die Lauf-Seiten gerne konzentrische Ausrichtung eingeklemmt werden. Versiegeln der Kreuzung der Fässer mit Epoxy-Kleber und die Ausrichtung Abstandhalter aus der Spitze Seite ggf. entfernen.
  2. Setzen Sie eine andere Nadel (23G) in den Lauf der zentralen Nadel in umgekehrter Richtung.  Dann erzeugen ein Loch seitlich auf dem Lauf der äußere Nadel und legen Sie einen Metallstecker der passenden Größe in das Loch, gefolgt von Versiegelung mit Epoxy-Kleber.
  3. Verbinden Sie die Eingänge des Druckkopfes auf eine Zweikanal-Spritzenpumpe für die Injektion der Bioink und der Vernetzung-Lösung individuell, durch zwei PVC-Rohre. Montieren Sie den Extruder auf den Kopf des einen Bioprinter mit einer Kunststoff-Halter von Poly(methyl methacrylate) (PMMA) gemacht.
    Hinweis: Bioprinter Auswahl richtet sich nach Verfügbarkeit. In unserem Fall haben wir dieses Setup auf mehreren im Handel erhältlichen Bioprinters erfolgreich getestet. Jedoch sollte jede Bioprinter, die einem X-y-Z motorisierten Stadium verfügt über im Prinzip Integration von diesem mikrofluidischen Druckkopf machen.

(2) Bioprinting Microfibrous vaskulären Bettes

  1. Machen die Bioink mit einer Mischung aus Alginat (4 w/v%, niedrige Viskosität), Gelatine Methacryloyl (GelMA, 1-2 w/v%)57,58und Photoinitiator Irgacure 2959 (0,2 - 0,5 wt.%) aufgelöst in 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) Piperazin-1-Yl] Ethan Sulfonsäure (HEPES-Puffer, pH 7.4) mit 10 vol.% fetalen bovine Serum (FBS).
  2. Machen Sie eine Lösung von 0,3 M CaCl2 in HEPES-Puffer mit 10 vol.% FBS als Trägerflüssigkeit Vernetzung.
  3. Unmittelbar vor Bioprinting menschliche Nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) aus den Kolben mit Behandlung von 0,05 w/v% Trypsin für ca. 5-10 min zu distanzieren und Aufschwemmen der Zellen in der Bioink in einer Konzentration von 5-10 × 106 Zellen/mL. Pipette die Suspension langsam 5 bis 10 Mal um homogene Verteilung zu gewährleisten.
  4. Starten Sie die Injektion von Bioink/Vernetzung Flüssigkeit mit einem Zweikanal-Spritzenpumpe an die gleiche Volumenströme von 5 µL/mL. Die Ströme können dürfen kontinuierlich für bis zu 1 min laufen lassen, bis sie stabilisieren. Anschließend starten Sie die Bewegung des Druckkopfes durch die Kontrolle der Bioprinter Abscheidung Geschwindigkeiten von ca. 4 mm/s (Abbildung 1B). Diese Geschwindigkeiten können feine müssen tuning mit jeder neuen Setup, um optimale Bioprinting zu gewährleisten. Der Bioprinting-Prozess erfolgt in der Regel bei Raumtemperatur (21-25 ° C), aber diese Temperatur kann verändert werden. Der Bioprinting Prozess sollte schnell Ionischen Gelierung der Alginat-Komponente und Ablagerung von ein Microfibrous Gerüst (Abbildung 1B) ermöglichen.
  5. Nachdem das Gerüst Bioprinted ist, erreichen Sie chemische Gelierung durch weitere Photocrosslinking der GelMA Komponente, auf etwa 5 bis 10 mW/cm2 von UV-Licht (360-480 nm) für 20-30 s (Abbildung 1C).
  6. Spülen Sie nach der Bioprinting und Vernetzung sanft das Gerüst mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die überschüssige CaCl2zu entfernen. Kultur das Mediumwechsel beladenen Microfibrous Gerüst in Endothelzellen Wachstumsmedium (EGM) in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 vol.% CO2 für bis zu um 16 Tage mit Medium verändert mindestens alle 2 Tage. Überwachen Sie die Morphologien Mediumwechsel unter dem Mikroskop während der Kulturdauer.

3. bauen die vaskularisierte Gewebe

  1. Sobald die Mediumwechsel auf den Peripherien von Mikrofasern in das Gerüst, um die Lumen-ähnliche Strukturen (Abbildung 1-D) bilden migriert haben, rufen Sie das Gerüst und legen Sie sie vorsichtig auf die Oberfläche einer hydrophoben Oberfläche (z.B. eine Platte aus Polymethylsiloxane [PDMS]). Verwenden Sie ein Stück des sterilen Filterpapiers, entfernen Sie vorsichtig das Medium aus dem interstitiellen Raum des Gerüstes mit Kapillare Kraft.
  2. Sofort Tropfen Sie einen (ca. 20-40 µL) Aussetzung der sekundären Zelltyp (z.B. Herzzellen) im Medium bei einer Dichte von 1-10 × 106 Zellen/mL auf das Gerüst, das die gesamte Zwischenraum des Gerüstes (Abbildung 1E) infiltrieren sollte. Inkubieren Sie eine solche Konfiguration in einem Inkubator (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95 % Relative Luftfeuchtigkeit) für 0,5 - 2 h damit die Zellen auf die einzelnen Mikrofasern halten. Überwachen Sie die Tropfengröße im Zeitraum um sicherzustellen, dass keine spürbaren Verdunstung beobachtet wird.
  3. Vorsichtig Waschen der Gerüste durch Schütteln in einem PBS-Bad, nicht-anhaftende Zellen und Kultur das Konstrukt im jeweiligen Medium zu entfernen, bis das gewünschte vaskularisierte Gewebe gebildet wird.

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Representative Results

Mikrofluidische Bioprinting Strategie ermöglicht Direktextrusion Bioprinting Microfibrous Gerüste mit dünnflüssigen Bioinks54,55. Wie in Abbildung 2A, ein Gerüst mit einer Größe von 6 × 6 × 6 mm mit3 > 30 Schichten aus Mikrofasern Bioprinted innerhalb von 10 min werden könnte. Die sofortige ionische Vernetzung der Alginat-Komponente mit CaCl2 erlaubt für hervorragende Standsicherheit während des Bioprinting Prozesses während der nachfolgenden physischen Photocrosslinking der GelMA Komponente gewährleistet langfristigen Stabilität des Gerüstes Bioprinted Microfibrous, wie in Draufsicht und Seitenansicht gezeigt in den Figuren 2 b und 2 Cangegeben. Die Mikrofasern erreicht in diesem Fall den Bioprinting Bedingungen in das Protokoll angegeben wurden ca. 100-150 µm im Durchmesser, die leicht Anstieg Überstunden mit Schwellung würde.

Bioprinting Prozesses, einschließlich der mikrofluidischen Extrusion von der Bioink, die ionische Vernetzung und die Photocrosslinking hatten nicht wesentlichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der gekapselten Mediumwechsel. Die Zellen konnte halten eine relativ hohe Tragfähigkeit des > 80 % nach Abschluss all dieser Verfahren (Abb. 2D). Wie berichtet früher54,55könnte die Mediumwechsel allmählich vermehren und migrieren in die Mikrofasern aus der anfänglich zufällige Verteilung am Tag 0 (Abb. 2E) an den Peripherien der Mikrofasern, Lumen-ähnliche Strukturen am Tag 16 Post-Bioprinting in der Kultur (Abbildung 2F) zu übernehmen. Solches Verhalten für die Mediumwechsel beobachtet wurde wahrscheinlich durch die innere Schnittstelle-gesteuerte Tendenz der Endothelzellen sowie die höhere Verfügbarkeit von Nährstoffen und Sauerstoff, die rund um die Mikrofasern als ihre Innenräume55,59.

Das Microfibrous Gerüst kann auch als eine eigenständige Plattform für das Tissue Engineering fungieren. Beispiel von Herzmuskel-Gewebe, waren neonatalen Ratte Kardiomyozyten auf den interstitiellen Raum leski Bioprinted bei einer Dichte von 5 × 106 Zellen/mL entkernt und kultiviert in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 vol.% FBS ergänzt. Das Medium wurde jeden Tag in den ersten 2-3 Tagen bis die Kardiomyozyten fingen, nach denen ausgetauscht nur ½ war Medium alle 2-3 Tage55,60,61,62geändert. Die Zellen konnten ihre spontane und synchronisierte schlagen für bis zu 9-28 Tage je nach Zelle Quelle und Konfiguration der Gerüste55pflegen. Die Reife Kardiomyozyten auf dem Schafott zeigte auch starken Ausdruck funktionelle kardiale Biomarker wie in die konfokale Fluoreszenzbilder dargestellt in Abbildung 3, einschließlich zugeschrieben α-Actinin (Abb. 3B) und Connexin-43 (Abb. 3C).

Kombination der Endothelzellen und der sekundären Zelltyp, konnte eine vaskularisierte Gewebe weiter konstruiert werden. Wiederum wurden mit Myokard als Vorbild, nach das vaskuläre Bett in einem Bioprinted Microfibrous Gerüst nach etwa 16 Tagen Kultur gebildet hat, neonatalen Ratte Kardiomyozyten anschließend in den interstitiellen Raum des Gerüstes ausgesät. Nach Kultivierung und Reifung in ein gemeinsames Medium der 1:1-Volume Ration der EGM:DMDM besteht, könnte eine endothelialized Herzmuskelgewebe ausstellenden spontan und synchron schlagen55gebildet werden. Single-Flugzeug konfokale Fluoreszenzbilder in Abbildung 4 weiter offenbart Koexistenz von Zelltypen, die mit der Mediumwechsel hauptsächlich vorhanden in den Grenzen von Mikrofasern (Abbildung 4B) und die Herzmuskelzellen, die rund um die Außenaufnahmen von Mikrofasern (Abb. 4C).

Figure 1
Abbildung 1 : Mikrofluidische Bioprinting Strategie zur Erzeugung von vaskularisierte Gewebe konstruiert.
(A) Das Design von der Kern-Mantel Koaxial Druckkopf für Co-Extrusion von zusammengesetzten Bioink und CaCl2. (B-E) Diagramme zeigen die Herstellung Verfahren vaskularisierte Gewebe zu konstruieren. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Ref.55geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Bioprinting Microfibrous vaskuläre Bett.
(A) Foto zeigt ein Bioprinted 30-Schicht Microfibrous Gerüst. (B, C) Oberen und seitlichen Blick auf Mikrographen zeigt ein Bioprinted Gerüst. (D) Lebensfähigkeit der Mediumwechsel beladen in einem Bioprinted-Microfibrous-Gerüst. Grün und Rot zeigen jeweils lebenden und tote Zellen. (E, F) Fluoreszenz Mikrographen zeigt die Organisation der grünen Fuorescent Protein (GFP)-Mediumwechsel in die Bioprinted-Mikrofasern am Tag 0 und Tag 16 post Bioprinting, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Anschließende Wachstum von Kardiomyozyten auf dem Schafott Bioprinted Microfibrous.
Fluoreszenz Mikrographen zeigen (A) Kerne, (B) zugeschrieben α-Actinin, (C) Connexin-43 und (D) Überlagerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Bau des Endothelialized Herzmuskelgewebe.
Fluoreszenz Mikrographen zeigen (A) Kerne, GFP-Mediumwechsel (B) , (C) f-Aktin sowohl Mediumwechsel Kardiomyozyten und Überlagerung (D) . In D sehen Sie eine niedrigere Vergrößerung Bild des endothelialized Herzmuskelgewebe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Dataset.
Ein Beispiel G-Code-Datei für Bioprinting ein 6 × 6 mm2 quadratische Gitter mit 220 µm-Abstand zwischen angrenzenden Mikrofasern.

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Discussion

Bau der co-axial Druckkopf ist einen entscheidender Schritt in Richtung erfolgreiche mikrofluidische Bioprinting, um gleichzeitige Lieferung sowohl die Bioink aus dem Kern und der Vernetzungsmittel aus der Scheide zu ermöglichen. Während in diesem Protokoll mit einer 27G Nadel als Kern und einer 18G-Nadel als Shell ein Beispiel Druckkopf erstellt wurde, kann es leicht zu einer Vielzahl von Kombinationen mit verschiedenen Größen der Nadeln verlängert werden. Die Veränderung in der Nadel-Größen, die Ergebnisse in die Veränderung der Strömung in den einzelnen Phasen geliefert, benötigen jedoch weitere Optimierung der Durchflussmengen sowohl die Bioink der Vernetzungsmittel (individuell einstellbar mit zwei Spritzenpumpen statt eines Zweikanal-) und möglicherweise auch die Ablagerung Geschwindigkeit durch die Bioprinter entstehen.

Die Kombination der Parameter (Nadeldicken, Durchflussmengen und Ablagerung Geschwindigkeit) in das aktuelle Protokoll führte zu die Bioprinted Mikrofasern mit einem Durchmesser von etwa 120 µm unmittelbar nach der Ablagerung, die bis etwa 150 µm nach Gleichgewichtherstellung im mittleren55anschwollen. Dieser Größe entspricht auch etwa die Schichtdicke der Bioprinted Konstrukte, da gab es keinen Raum zwischen den Schichten die Mikrofasern. Der Durchmesser des Bioprinted Mikrofasern ist eine Funktion von allen drei Parameter54,63; die Größe der Kern Nadel des Druckkopfes und der Volumenstrom des Bioink sind positiv korreliert mit dem Durchmesser von Mikrofasern, während die Größe der Scheide Nadel, die Durchflussmenge der Vernetzungsmittel und die Ablagerung Geschwindigkeit sind negativ korreliert mit dem Durchmesser der Mikrofasern. Ablagerung von Microfibrous Gerüste von beliebigen Strukturen54,55würde die Kontrolle über die Bewegung der Druckkopf und/oder der motorisierten Bühne ermöglichen.

Darüber hinaus kann die Formulierung der Bioink das Profil der Bioprinting auch ändern. Zum Beispiel die Menge an Alginat und GelMA kann je nach spezifischen Anwendungen leicht moduliert werden, und es ist möglich, zusätzliche Materialien verschmelzen die Bioink, wie z. B. Polyethylenglykol-Tetraacrylate (PEGTA), die die Mechanik der Bioprinted Mikrofasern40erhöht. Die UV-Vernetzung bestimmt auch die mechanischen Eigenschaften von der Mitte des Bioprinted Mikrofasern, die das Verhalten der eingebetteten Endothelzellen54weiter beeinflussen können. Die Parameter, die in diesem Protokoll berichtet auf Mediumwechsel optimiert wurde. Allerdings wird davon ausgegangen, dass für jede andere Art von Endothelzellen die Vernetzung-Parameter neu optimierte Lumen Bildung in die Mikrofasern zu erreichen sein müssen.

Um eine sekundäre Zelle Art auf dem Bioprinted Kreislauf Bett Samen, ist es notwendig, das Gerüst auf ein Stück der hydrophoben Oberfläche legen und sicherstellen, dass die meisten Mittel in den interstitiellen Raum des Gerüsts entfernt ist. Dies ermöglicht sofortige Infiltration der Zellsuspension in die Microfibrous Struktur mit den Tröpfchen freistehende und Verkapselung das Gerüst im Laufe der Aussaat, Maximierung der Anzahl der Zellen auf der Oberfläche der Mikrofasern. Obwohl eine relativ hohe Dichte von Herzmuskelzellen bei 5 × 106 Zellen/mL für den Bau von Herzmuskelgewebe in das aktuelle Protokoll verwendet wurde, kann so Dichte willkürlich abgestimmt werden, um spezifische Gewebetypen zu entsprechen. Es ist auch wichtig, eine feuchte Umgebung beizubehalten, die realisiert werden kann, durch das Ausfüllen von sterilen Wassers oder PBS in der Nähe von dem Gerüst (d. h. in die umliegenden Brunnen oder der Raum umgibt die PDMS-Platte), um sicherzustellen, dass die geringe Menge des Mediums für die Aussaat im Zeitraum der Aussaat nicht verdunstet.

Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir ein detailliertes Protokoll der mikrofluidischen Bioprinting für bequeme Herstellung von vaskularisierte Gewebe bereitgestellt. Bei dieser Strategie wird ein Kern-Mantel-co-axial-Druckkopf verwendet, um gleichzeitige Extrusion von einem Hybrid-Bioink vom Kern und Vernetzung-Agent aus der Scheide zu ermöglichen. Auf Co-Extrusion die Bioink sofort erfährt physikalische Vernetzung für die Alginat-Komponente bildet eine geschichtete Microfibrous Gerüst, wie durch die Bewegung der Bioprinter programmiert, während das gesamte Konstrukt ist weiter chemisch Photocrosslinked für die GelMA Komponente um langfristige Stabilität zu ermöglichen. Endothelzellen, die während des Bioprinting Prozesses in die Mikrofasern gekapselt können vermehren und migrieren zu den Peripherien vorausgesetzt Lumen-ähnliche Strukturen, das Gerüst in einem Kreislauf Bett verwandeln. Durch impfen eine sekundäre Zelle Art, kann ein Konstrukt vaskularisierte Gewebe anschließend generiert werden. Diese mikrofluidische Bioprinting Strategie ist einzigartig und kann auf eine Vielzahl von Gewebearten wie Leber, skelettartigen Muskel bequem verlängert werden, und Krebserkrankungen neben der Herzmuskel in das aktuelle Protokoll, durch rationale Kombination der gewünschten Zelle Arten dargestellt und speziell Muster Bioprinted Microfibrous Gerüste. Die vaskularisierte Gewebe Konstrukte, die mit einem solchen Verfahren können für Geweberegeneration in Vivo oder in Vitro Gewebe Modellierung verwendet werden.

Es gibt mehrere Einschränkungen verbunden mit der in diesem Protokoll beschriebenen mikrofluidische Bioprinting-Strategie. Erstens ist der Durchmesser des Bioprinted Mikrofasern beschränkt sich auf wenige hundert Mikrometer durch die Diffusionsbarriere der Hydrogelmatrix für das CaCl2 Lösung effizient vernetzen die Alginat-Komponente im Kern. Übermäßig niedrige physische Vernetzung Dichte würde den mehrschichtigen Aufbau instabil machen. Zweitens kann die physische Vernetzungsmittel CaCl2 -Lösung negativ auf bestimmte Endothelzellen auszuüben, die empfindlicher als Mediumwechsel, wie z. B. die endotheliale Vorläuferzellen sind. Die Machbarkeit der Verwendung solch einer Bioprinting-Methode für eine breitere Palette von Endothelzellen Typen erfordern weitere Untersuchungen. Drittens, während der endothelialen Zellen Lumen-artige Strukturen innerhalb der Mikrofasern bilden können, sind die Kerne dieser Mikrofasern nicht hohl Perfusion zu ermöglichen. Daher sind Nährstoffe und Sauerstoff noch vor allem durch den interstitiellen Raum in der Bioprinted-Gerüste zur Verfügung gestellt. Die Anpassung der Opfer Materialien als Photocrosslinkable Komponente des Bioink64 kann dieses Problem in zukünftigen Versionen der Technologie lösen. Alternativ baut Bioprinted hohlen Microfibrous Strukturen42,43,65,66,67,68 als vaskuläre Bett verwendet werden können, um direkte Perfusion der vaskularisierte Gewebe zu gewährleisten. Schließlich kann Bioprinting klinische mittlere Gewebe noch schwierig sein, kann wahrscheinlich angesprochen werden durch die Integration von Design der angeordneten mikrofluidischen Druckköpfe69 erweitert-Skala Bioprinting bei hohem Durchsatz zu erreichen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen des National Cancer Institute von der nationalen Institute der Gesundheit Weg zur Unabhängigkeit Award (K99CA201603).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich A0682 BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) Sigma-Aldrich 410896 98%
HEPES buffer Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 10438026 Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001GFP GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific 12430054 High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system Excelitas Technologies OmniCure S2000 Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

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Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen
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Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen,… More

Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen, A. M. Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids. J. Vis. Exp. (126), e55957, doi:10.3791/55957 (2017).

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