Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Simuleras Bioprinting för Engineering vaskulariserad vävnad och Organoids

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55957
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University
* These authors contributed equally

Summary

Vi tillhandahåller en generaliserad protokoll baserat på en mikroflödessystem bioprinting strategi för ingenjörsvetenskap en microfibrous vaskulär säng, där en sekundär celltyp kunde vara ytterligare seedade i interstitiell utrymme av denna microfibrous struktur att generera vaskulariserad vävnad och organoids.

Abstract

Engineering vaskulariserad vävnad konstruerar och organoids har varit historiskt utmanande. Här beskriver vi en ny metod baserad på mikroflödessystem bioprinting att generera en byggnadsställning med multilayer sammanflätning hydrogel mikrofibrer. För att uppnå jämn bioprinting, en core-slida mikroflödessystem skrivhuvudet som innehåller en sammansatt bioink formulering extruderade från core flödet och crosslinking lösningen bärs av slida flödet, ritades och monteras på bioprinter. Genom att blanda gelatin methacryloyl (GelMA) med alginat, en polysackarid som genomgår momentana Joniska crosslinking i närvaro av Välj tvåvärda joner, följt av en sekundär photocrosslinking av komponenten GelMA att uppnå permanent stabilisering, en microfibrous byggnadsställning kunde erhållas med hjälp av denna bioprinting strategi. Ännu viktigare, kan endotelceller inkapslade inuti den bioprinted mikrofibrer bilda lumen-liknande strukturer som liknar vaskulatur under loppet av kultur för 16 dagar. Endothelialized microfibrous ställningen kan användas ytterligare en vaskulär Bed för att konstruera en vaskulariserad vävnad genom efterföljande sådd av sekundär celltyp in i interstitiell utrymme av mikrofibrer. Simuleras bioprinting ger en generaliserad strategi i bekväm konstruktion av vaskulariserad vävnad på HiFi.

Introduction

Tissue engineering mål att generera fungerande vävnad substitut som kan användas för att ersätta, återställa eller öka de skadade eller sjuka människokroppen1,2,3,4, ofta genom en kombination av önskade celltyper, bioaktiva molekyler5,6och biomaterial7,8,9,10. Mer nyligen, tissue engineering teknik har också alltmer antagits för att generera in vitro- vävnads- och modeller som efterliknar de viktiga funktionerna i sina i vivo motsvarigheter, för applikationer såsom läkemedelsutveckling, som ersättning för konventionella alltför förenklade planar cell kulturer11,12,13,14,15,16,17,18,19. I båda situationerna, förmågan att sammanfatta de komplexa mikroarkitektur och hierarkiska strukturen i de mänskliga vävnaderna är avgörande för att aktivera funktionen den bakåtkompilerade vävnader10och sätt att integrera en vaskulär nätverk i bakåtkompilerade vävnader är särskilt efterfrågan eftersom vaskularisering presenterar en av de största utmaningarna för den fält20,21,22,23.

Hittills har en mängd metoder har utvecklats i detta avseende i ett försök att bygga blodkärl strukturer i bakåtkompilerade vävnad konstruktioner med varierande grader av framgång8. Till exempel möjliggör självmontering av endotelceller generering av mikrovaskulära nätverk24; leverans av angiogena tillväxtfaktorer inducerar ihållande kärlnybildning25,26. använda av vaskulär stamceller och pericyter underlättar endotelcellstillväxt och montering24,27. utforma byggnadsställning egenskaper möjliggör exakt modulering av vaskularisering28,29; och cell ark teknik möjliggör bekväm manipulation av vaskulär skiktning30. Dock ger dessa strategier inte möjlighet att styra det rumsliga mönstringen av kärlsystemet, ofta leder till slumpmässiga fördelningen av blodkärl inom en konstruerad vävnad konstruera och därmed begränsad reproducerbarhet. Under de senaste åren har bioprinting vuxit fram som en klass av möjliggörande teknik mot lösningen av en utmaning, på grund av deras oöverträffade mångsidigheten hos insättning komplex vävnad mönster på HiFi och reproducerbarhet i ett automatiskt eller halvautomatiskt sätt31,32,33. Uppoffrande bioprinting34,35,36,37,38, inbäddade bioprinting39,40,41och ihåliga struktur bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 har alla visat möjligheten att generera vaskulär eller vaskulariserad vävnad.

Alternativt, en mikroflödessystem bioprinting strategi att fabricera microfibrous ställningar har utvecklats nyligen, där en hybrid bioink består av alginat och gelatin methacryloyl (GelMA) levererades genom kärnan i en koncentrisk skrivhuvudet och en kalciumklorid (CaCl2) lösning Bars genom yttre skidan flödet av skrivhuvudet54,55. Den co-extrudering av två flöden tillåtet för omedelbar fysisk crosslinking av komponenten alginat att möjliggöra bildandet av microfiber, medan efterföljande photocrosslinking säkerställt permanent stabilisering av multi-layer microfibrous ställningen. Notera konstaterades endotelceller inkapslade i den bioprinted mikrofibrer att föröka sig och migrera mot periferin av den mikrofibrer förutsatt att lumen-liknande strukturer som härmade den vaskulära säng54,55. Dessa bioprinted, endothelialized kärlbäddar kunde därefter fyllas med önskas sekundär celltyper att ytterligare bygga vaskulariserad vävnad55. Detta protokoll ger således ett detaljerat förfarande av sådan en mikroflödessystem bioprinting strategi som koncentriskt munstycke design, vilket garanterar bekväm tillverkning av vaskulariserad vävnad för potentiella tillämpningar inom både vävnadsteknik och organoid modellering aktiverad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Neonatal råtta hjärtmuskelcellerna används i detta protokoll var isolerade från 2 dagar gamla Sprague-Dawley-råttor efter en väletablerad förfarande56 godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén vid Brigham and Women's Hospital.

1. instrumentering av Bioprinter

  1. Infoga en mindre trubbig nål (t.ex., 27 G, 1 tum) som kärnan i centrum av en större trubbig nål (t.ex., 18 G, ½ tum) som slidan att konstruera den dual layer, koncentriska mikroflödessystem skrivhuvudet; Kontrollera att core nålen sticker ut något (~ 1 mm) längre än det yttre skalet (figur 1A). Justering anpassas brukar manuellt, men om nödvändigt distanser i rätt storlekar temporally kan vara inklämt mellan inre/yttre nålar både spetsen och fat sidorna att hjälpa koncentriska justering. Försegla korsningen av fat med epoxi lim och ta bort distanserna justering från tip sida när det är tillämpligt.
  2. Infoga en annan nål (23G) i trumman av centrala nålen i motsatt riktning.  Sedan generera ett hål på sidan av trumman av yttre nålen och infoga en metall kontakt matchande storlek i hålet, följt av tätning med epoxi lim.
  3. Ansluta vikar av skrivhuvudet till en tvåkanalig sprutpumpen för injektion av bioink och crosslinking lösningen, individuellt, via två PVC-rör. Montera extrudern på huvudet av en bioprinter med hjälp av en plast hållare av poly(methyl methacrylate) (PMMA).
    Obs: Bioprinter valet beror på tillgänglighet. I vårt fall, har vi framgångsrikt testat denna setup på flera kommersiellt tillgängliga bioprinters. Någon bioprinter som har ett x-y-z motoriserad stadium bör dock i princip möjliggör integration av denna mikroflödessystem skrivhuvudet.

2. Bioprinting Microfibrous vaskulär sängen

  1. Göra den bioink med en blandning av alginat (4 w/v%, låg viskositet) och gelatin methacryloyl (GelMA, 1-2 w/v%)57,58photoinitiator Irgacure 2959 (0,2 - 0,5 wt.%) upplöst i 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] etan sulfonsyra (HEPES buffert, pH 7,4) innehållande 10 vol.% fetalt bovint serum (FBS).
  2. Gör en lösning av 0,3-M CaCl2 i HEPES buffert innehållande 10 vol.% FBS som crosslinking bärare vätskan.
  3. Omedelbart före bioprinting, separera mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) från kolvar med behandling av 0,05 w/v% trypsin för 5-10 min och resuspendera cellerna i bioink med en koncentration på 5-10 × 106 celler/mL. Pipettera suspensionen långsamt 5 till 10 gånger så homogen fördelning.
  4. Starta injektionen av bioink/crosslinking vätska med hjälp av en dual-channel sprutpumpen på samma flödesområde 5 µL/mL. Flödena kan tillåtas att kontinuerligt köra för upp till 1 min tills de stabiliseras. Därefter inleda rörelsen av skrivhuvudet genom att kontrollera bioprinter med nedfall hastighet ca 4 mm/s (figur 1B). Dessa hastigheter kan behöver fine tuning med varje ny setup för att säkerställa optimal bioprinting. Processen bioprinting utförs vanligen vid rumstemperatur (21-25 ° C) men denna temperatur kan ändras. Bioprinting processen bör möjliggöra snabbt Joniska gelation av komponenten alginat och nedfall av en microfibrous byggnadsställning (figur 1B).
  5. Efter ställningen är bioprinted, uppnå kemiska gelation genom ytterligare photocrosslinking GelMA komponenten, på cirka 5-10 mW/cm2 av UV-ljus (360-480 nm) för 20-30 s (figur 1C).
  6. Efter den bioprinting och crosslinking, skölj försiktigt på schavotten med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att ta bort den överskjutande CaCl2. Kultur HUVECs-lastad microfibrous ställningen i endotelceller odlingsmedium (EGM) i en inkubator vid 37 ° C och 5 vol.% CO2 upp till 16 dagar med medium ändrats minst varannan dag. Övervaka morfologier av HUVECs i Mikroskop under perioden kultur.

3. konstruera simblåsa vävnader

  1. När HUVECs har migrerat till periferin av mikrofibrer i ställningen att bilda lumen-liknande strukturer (figur 1D), Hämta ställningen och försiktigt placera den på ytan av en hydrofoba yta (t.ex., en platta av polymethylsiloxane [PDMS]). Använd sterila filter papper att ta försiktigt bort alla medium från interstitiell utrymme av ställningen med kapillär kraft.
  2. Tillsätt omedelbart en droppe (ca 20-40 µL) av suspension med en sekundär celltyp (t.ex., hjärtmuskelceller) i medium med en täthet på 1-10 × 106 celler/mL ovanpå schavotten, som ska infiltrera hela interstitiell utrymme av ställningen (figur 1E). Inkubera i en sådan konfiguration i en inkubator (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95% relativ fuktighet) för 0,5 - 2 h att låta cellerna att fästa på den individuella mikrofibrer. Övervaka droppstorlek under perioden ska säkerställa att ingen märkbar avdunstning följs.
  3. Försiktigt tvätta ställningar genom skakning i ett PBS bad att ta bort alla icke-anhängare celler och kultur konstruktionen i relevanta medium tills önskad vaskulariserad vävnad bildas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strategin mikroflödessystem bioprinting möjliggör direkt extrudering bioprinting av microfibrous ställningar med låg viskositet bioinks54,55. Som illustreras i figur 2A, en byggnadsställning med en storlek på 6 × 6 × 6 mm3 innehållande > 30 lager av mikrofibrer kan vara bioprinted inom 10 min. Den omedelbara Joniska crosslinking av komponenten alginat med CaCl2 tillåtna för utmärkt strukturell integritet under bioprinting processen medan den efterföljande fysiska photocrosslinking av komponenten GelMA säkerställs långsiktig stabilitet av bioprinted microfibrous ställningen, vilket anges i ovanifrån och sidoutsikt visas i siffror 2B och 2 C. De mikrofibrer som uppnåtts i det här fallet på bioprinting villkor som anges i protokollet, var cirka 100-150 µm i diameter, som skulle något ökad övertid med svullnad.

Bioprinting processen, inklusive mikroflödessystem extrudering av bioink, den joniska crosslinking och photocrosslinking, påverkade inte påtagligt lönsamheten för de inkapslade HUVECs. Cellerna kan upprätthålla en relativt hög bärkraft > 80% efter slutförandet av alla dessa förfaranden (figur 2D). Som rapporterats tidigare54,55, kunde HUVECs gradvis föröka och vandrar i mikrofibrer från initialt slumpmässiga fördelningen på dag 0 (figur 2E) till periferin av mikrofibrer att anta lumen-liknande strukturer på dag 16 post-bioprinting i kultur (figur 2F). Sådan en beteende observerats för HUVECs var sannolikt på grund av inneboende gränssnitt-driven tendensen av endotelceller samt den högre tillgängligheten av näringsämnen och syre runt i mikrofibrer än i deras interiörer55,59.

Microfibrous ställningen kan också fungera som en fristående plattform för vävnadsteknik. Med hjärtmuskeln vävnad som exempel, var neonatal råtta hjärtmuskelcellerna seedade på interstitiell utrymme av en bioprinted byggnadsställning vid en densitet av 5 × 106 celler/mL, och odlade i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10 vol.% FBS. Medium bytte varje dag under de första 2-3 dagarna tills hjärtmuskelcellerna började slå, varefter endast ½ mediet var utbytt varje 2-3 dagar55,60,61,62. Cellerna kan behålla sin spontana och synkroniserade slog upp till 9-28 dagar beroende på cell källa och konfiguration av ställningar55. Mogen hjärtmuskelcellerna på schavotten visade också starkt uttryck av funktionella hjärt biomarkörer som illustrerade i confocal fluorescens bilder i figur 3, inklusive sarcomeric α-actinin (figur 3B) och connexin-43 (figur 3C).

Kombinera endotelceller och den sekundära celltypen, kunde en vaskulariserad vävnad byggas ytterligare. Igen, med med hjärtmuskeln som exempel, när vaskulär sängen har bildats i en bioprinted microfibrous byggnadsställning efter ungefär 16 dagar av kultur, neonatal råtta hjärtmuskelcellerna seedade därefter in i interstitiell utrymme av ställningen. Efter odling och mognad i ett vanligt medium består av 1:1 volym ranson av EGM:DMDM, kunde en endothelialized hjärtinfarkt vävnad bildas uppvisar spontana och synkron stryk55. Singel-plane confocal fluorescens bilder i figur 4 ytterligare avslöjade samexistens av både celltyper, med HUVECs som främst förekommer i gränserna för mikrofibrer (figur 4B) och hjärtmuskelcellerna kring exteriörer av mikrofibrer (figur 4C).

Figure 1
Figur 1 : Mikroflödessystem Bioprinting strategin för att generera vaskulariserad vävnad tankeskapelser.
(A) Utformningen av core-slida koaxial skrivhuvudet för co-extrudering av den sammansatta bioink och CaCl2. (B-E) Scheman visar fabrication tillvägagångssättet av en vaskulariserad vävnad konstruera. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Ref.55. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Bioprinting Microfibrous vaskulär sängen.
(A) fotografera visar en bioprinted 30-layer microfibrous byggnadsställning. (B, C) Topp och sida över micrographs visar en bioprinted byggnadsställning. (D) lönsamheten av HUVECs lastad i en bioprinted microfibrous byggnadsställning. Grönt och rött anger levande och döda celler, respektive. (E, F) Fluorescens micrographs visar organisationen av gröna installeras protein (GFP)-HUVECs i den bioprinted mikrofibrer på dag 0 och dag 16 efter bioprinting, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Efterföljande tillväxten av hjärtmuskelceller på Bioprinted Microfibrous schavotten.
Fluorescens micrographs visar (A) atomkärnor, (B) sarcomeric α-actinin, (C) connexin-43 och (D) överlagring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Konstruktion av Endothelialized hjärtinfarkt vävnad.
Fluorescens micrographs visar (A) kärnor, (B) GFP-HUVECs, (C) f-aktin av både HUVECs och hjärtmuskelceller och (D) överlagring. Infälld i D visar en lägre förstoring bild av endothelialized hjärtinfarkt vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Extra datamängd.
Ett prov G-kod fil för bioprinting en 6 × 6 mm2 fyrkantiga galler med 220 µm avståndet mellan intilliggande mikrofibrer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Byggandet av co-axial skrivhuvudet utgör ett kritiskt steg mot framgångsrika mikroflödessystem bioprinting för samtidig leverans av både bioink från kärnan och crosslinking agent från slidan. Medan detta protokoll skapades ett exempel skrivhuvudet med en 27G nål som kärnan och en 18G nål som skalet, kan det lätt förlängas till en mängd olika kombinationer med hjälp av nålar i olika storlekar. Ändring i nål längder, vilket resulterar i förändring av mängden flöde levereras i varje fas, kommer dock kräva ytterligare optimering av flödesområde både bioink och den crosslinking agenten (individuellt justerbara med två sprutpumpar i stället för en dual-channel) och potentiellt även nedfall hastigheten ådragit sig bioprinter.

Kombinationen av parametrarna (nål storlekar, flöden och nedfall hastighet) i det nuvarande protokollet ledde till den bioprinted mikrofibrer med en diameter på cirka 120 µm omedelbart efter nedfall, som skulle svälla till ungefär 150 µm efter Jämviktstiden i medium55. Sådan storlek är också ungefär lika med Lagrartjockleken av bioprinted konstruktioner eftersom det inte fanns något utrymme mellan skikten av mikrofibrer. Diametern på den bioprinted mikrofibrer är en funktion av alla tre parametrar54,63. storleken på core nålen på skrivhuvudet och flödet av bioink är positivt korrelerade med diametern på mikrofibrer, medan storleken på skidan nålen, flödet av crosslinking agent och nedfall hastigheten är negativt korrelerade med diametern på mikrofibrer. Kontrollen över rörelsen av skrivhuvudet eller motoriserad scenen skulle möjliggöra deponering av microfibrous ställningar av godtyckliga strukturer54,55.

Dessutom kan utformningen av bioink ändra bioprinting samt profil. Exempelvis mängden alginat och GelMA kan lätt anpassas till specifika applikationer, och det är möjligt att blanda ytterligare material till bioink, såsom polyetylenglykol-tetraacrylate (PEGTA) som ökar bioprinted mikrofibrer40mekanik. Den UV crosslinking bestämmer också de mekaniska egenskaperna av centrera av den bioprinted mikrofibrer, vilket ytterligare kan påverka beteendet hos den inbäddade endotelceller54. De parametrar som redovisas i detta protokoll var optimerad för HUVECs. Det förväntas dock att, för varje typ av endotelceller crosslinking parametrar kommer att behöva vara åter optimerad att uppnå lumen-formationen i mikrofibrer.

För att seeda en sekundär celltyp på bioprinted vaskulär sängen, är det nödvändigt att placera ställningen på en bit av hydrofoba yta och att de flesta medium i interstitiell utrymme av ställningen tas bort. Detta gör att omedelbar infiltration av cellsuspensionen i microfibrous struktur med droplet fri-stående och kapsla in ställningen under sådd, maximera antalet celler fäst på ytan av mikrofibrer. Även om en relativt hög täthet av hjärtmuskelceller på 5 × 106 celler/mL användes för att konstruera hjärtinfarkt vävnaden i det nuvarande protokollet, kan så densitet vara godtyckligt avstämda för att matcha vissa vävnadstyper. Det är också viktigt att upprätthålla en fuktig miljö, som kan förverkligas genom att fylla sterilt vatten eller PBS i närheten av ställningen (dvs. i omgivande brunnar eller i utrymmet kring PDMS plattan), säkerställa att den lilla mängden medium för sådd inte avdunstar under perioden för sådd.

Sammanfattningsvis har vi tillhandahållit ett detaljerat protokoll av mikrofabricerade bioprinting för bekväm tillverkning av vaskulariserad vävnad. I denna strategi används en core-slida co-axial skrivhuvudet för att aktivera samtidig extrudering av en hybrid bioink från kärna och crosslinking agent från slidan. Vid co-extrudering, bioink genomgår omedelbart fysiska crosslinking för dess alginat komponent som utgör en skiktad microfibrous byggnadsställning som programmeras av rörelsen av bioprinter, medan den hela konstruktionen är ytterligare kemiskt photocrosslinked för komponenten GelMA att möjliggöra långsiktig stabilitet. Endotelceller inkapslade i mikrofibrer under processen bioprinting kan föröka och migrera till de periferier förutsatt att lumen-liknande strukturer, förvandlas en vaskulär säng schavotten. Genom sådd en sekundär celltyp, kan en vaskulariserad vävnad bygga genereras därefter. Här simuleras bioprinting strategi är unikt och bekvämt kan förlängas till en mängd olika vävnadstyper såsom lever, Skelett muskel och cancerformer förutom myokardiet illustreras i det nuvarande protokollet, rationell kombination av önskade celltyper och specialdesignat mönster av de bioprinted microfibrous ställningar. Vaskulariserad vävnad konstruktioner produceras med en sådan metod kan användas för vävnadsregeneration i vivo eller in vitro- vävnad modellering.

Det finns flera begränsningar som är associerad med mikroflödessystem bioprinting strategin beskrivs i detta protokoll. Först, diametern på den bioprinted mikrofibrer är begränsat till några hundra mikrometrar på grund av till diffusionsspärr matrisens hydrogel CaCl2 lösning för att effektivt crosslink komponenten alginat i kärnan. Alltför låg fysisk crosslinking densitet skulle göra skiktade strukturen instabil. För det andra kan den fysiska crosslinking agenten CaCl2 lösning utöva negativa effekter på vissa typer av endotelceller som bräckligare än HUVECs, såsom de endothelial stamceller. Möjligheten att använda sådan bioprinting metod för ett bredare utbud av endotelceller typer kan kräva ytterligare undersökningar. För det tredje, medan de endothelial cellerna kan bilda lumen-liknande strukturer inom mikrofibrer, kärnar ur av dessa mikrofibrer är inte ihåliga att aktivera perfusion. Därför, näringsämnen och syre finns fortfarande främst genom interstitiell utrymme i de bioprinted ställningar. Anpassning av uppoffrande material som komponenten photocrosslinkable av bioink64 kan lösa detta problem i framtida versioner av tekniken. Alternativt bioprinted ihåliga microfibrous strukturer42,43,65,66,67,68 kan användas som vaskulär sängen för att säkerställa direkta perfusion av vaskulariserad vävnad konstruktioner. Senast, bioprinting av kliniska och medelstora vävnader kan fortfarande vara utmanande, som sannolikt kan åtgärdas genom att införliva design klädd mikroflödessystem skrivhuvuden69 att uppnå utökad skala bioprinting med högt dataflöde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Författarna erkänner National Cancer Institute av nationella institut för hälsa-vägen till självständighet Award (K99CA201603).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich A0682 BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) Sigma-Aldrich 410896 98%
HEPES buffer Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 10438026 Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001GFP GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific 12430054 High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system Excelitas Technologies OmniCure S2000 Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in Tissue Engineering. Sci. Am. 300 (5), 64-71 (2009).
  3. Langer, R. Tissue Engineering: Status and Challenges. E-Biomed: J.Regen. Med. 1 (1), 5-6 (2004).
  4. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering Complex Tissues. Sci. Transl. Med. 4 (160), 112 (2012).
  5. Biondi, M., Ungaro, F., Quaglia, F., Netti, P. A. Controlled Drug Delivery in Tissue Engineering. Adv. Drug Del. Rev. 60 (2), 229-242 (2008).
  6. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled Growth Factor Delivery for Tissue Engineering. Adv. Mater. 21 (32-33), 3269-3285 (2009).
  7. Hubbell, J. A. Biomaterials in Tissue Engineering. Nat. Biotechnol. 13 (6), 565-576 (1995).
  8. Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in Biomaterials for Tissue Engineering. Nat. Mater. 8 (6), 457-470 (2009).
  9. Rice, J. J., et al. Engineering the Regenerative Microenvironment with Biomaterials. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 57-71 (2012).
  10. Zhang, Y. S., Xia, Y. Multiple Facets for Extracellular Matrix Mimicking in Regenerative Medicine. Nanomedicine. 10 (5), 689-692 (2015).
  11. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  12. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic Organs-on-Chips. Nat. Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-Chips at the Frontiers of Drug Discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Seeking the Right Context for Evaluating Nanomedicine: From Tissue Models in Petri Dishes to Microfluidic Organs-on-a-Chip. Nanomedicine. 10, 685-688 (2015).
  15. Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., Van Noort, D., Yu, H. Towards a Human-on-Chip: Culturing Multiple Cell Types on a Chip with Compartmentalized Microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
  16. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  17. Sung, J. H., et al. Microfabricated Mammalian Organ Systems and Their Integration into Models of Whole Animals and Humans. Lab Chip. 13 (7), 1201-1212 (2013).
  18. Wikswo, J. P. The Relevance and Potential Roles of Microphysiological Systems in Biology and Medicine. Exp. Biol. Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  19. Yum, K., Hong, S. G., Healy, K. E., Lee, L. P. Physiologically Relevant Organs on Chips. Biotechnol. J. 9 (1), 16-27 (2014).
  20. Nomi, M., Atala, A., Coppi, P. D., Soker, S. Principals of Neovascularization for Tissue Engineering. Mol. Aspects Med. 23 (6), 463-483 (2002).
  21. Jain, R. K., Au, P., Tam, J., Duda, D. G., Fukumura, D. Engineering Vascularized Tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 821-823 (2005).
  22. Rouwkema, J., Rivron, N. C., Van Blitterswijk, C. A. Vascularization in Tissue Engineering. Trends Biotechnol. 26 (8), 434-441 (2008).
  23. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Sci. Transl. Med. 4 (160), 123 (2012).
  24. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
  25. Perets, A., et al. Enhancing the Vascularization of Three-Dimensional Porous Alginate Scaffolds by Incorporating Controlled Release Basic Fibroblast Growth Factor Microspheres. J. Biomed. Mater. Res. A. 65 (4), 489-497 (2003).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining Neovascularization of a Scaffold through Staged Release of Vascular Endothelial Growth Factor-A and Platelet-Derived Growth Factor-BB. Tissue Eng. A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of Adult Mesenchymal Stem Cells on in Vitro Vascular Formation. Tissue Eng. A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  28. Quint, C., et al. Decellularized Tissue-Engineered Blood Vessel as an Arterial Conduit. Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  29. Choi, S. -W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in Biodegradable Inverse Opal Scaffolds with Uniform and Precisely Controlled Pore Sizes. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 145-154 (2013).
  30. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of Three-Dimensional Vascularized Cardiac Tissue with Cell Sheet Engineering. J. Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  31. Zhang, Y. S., et al. 3D Bioprinting for Tissue and Organ Fabrication. Ann. Biomed. Eng. 45 (1), 148-163 (2017).
  32. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv. Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  33. Murphy, S. V., Atala, A. 3d Bioprinting of Tissues and Organs. Nat. Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  34. Miller, J. S., et al. Rapid Casting of Patterned Vascular Networks for Perfusable Engineered Three-Dimensional Tissues. Nat. Mater. 11 (9), 768-774 (2012).
  35. Bertassoni, L. E., et al. Hydrogel Bioprinted Microchannel Networks for Vascularization of Tissue Engineering Constructs. Lab Chip. 14 (13), 2202-2211 (2014).
  36. Kolesky, D. B., et al. 3d Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  37. Lee, V. K., et al. Creating Perfused Functional Vascular Channels Using 3d Bio-Printing Technology. Biomaterials. 35 (28), 8092-8102 (2014).
  38. Zhang, Y. S., et al. Bioprinted Thrombosis-on-a-Chip. Lab Chip. 16, 4097-4105 (2016).
  39. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the Granular Gel Medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  40. Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3d Printing of Shear-Thinning Hydrogels into Self-Healing Hydrogels. Adv. Mater. 27 (34), 5075-5079 (2015).
  41. Hinton, T. J., et al. Three-Dimensional Printing of Complex Biological Structures by Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  42. Jia, W., et al. Direct 3d Bioprinting of Perfusable Vascular Constructs Using a Blend Bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  43. Zhang, Y., et al. In Vitro Study of Directly Bioprinted Perfusable Vasculature Conduits. Biomaterials Science. 3 (1), 134-143 (2015).
  44. Gao, Q., He, Y., Fu, J. -Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial Nozzle-Assisted 3D Bioprinting with Built-in Microchannels for Nutrients Delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  45. Cornock, R., Beirne, S., Thompson, B., Wallace, G. G. Coaxial Additive Manufacture of Biomaterial Composite Scaffolds for Tissue Engineering. Biofabrication. 6 (2), 025002 (2014).
  46. Duan, B., Hockaday, L. A., Kang, K. H., Butcher, J. T. 3D Bioprinting of Heterogeneous Aortic Valve Conduits with Alginate/Gelatin Hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. A. 101 (5), 1255-1264 (2013).
  47. Skardal, A., et al. Photocrosslinkable Hyaluronan-Gelatin Hydrogels for Two-Step Bioprinting. Tissue Eng. A. 16 (8), 2675-2685 (2010).
  48. Li, S., et al. Direct Fabrication of a Hybrid Cell/Hydrogel Construct by a Double-Nozzle Assembling Technology. J. Bioact. Compatible Polym. 24 (3), 249-265 (2009).
  49. Visser, J., et al. Biofabrication of Multi-Material Anatomically Shaped Tissue Constructs. Biofabrication. 5 (3), 035007 (2013).
  50. Boyd, D. A., Adams, A. A., Daniele, M. A., Ligler, F. S. Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape. Journal of visualized experiments: JoVE. (83), e50958 (2014).
  51. Daniele, M. A., Adams, A. A., Naciri, J., North, S. H., Ligler, F. S. Interpenetrating Networks Based on Gelatin Methacrylamide and Peg Formed Using Concurrent Thiol Click Chemistries for Hydrogel Tissue Engineering Scaffolds. Biomaterials. 35 (6), 1845-1856 (2014).
  52. Daniele, M. A., Boyd, D. A., Adams, A. A., Ligler, F. S. Microfluidic Strategies for Design and Assembly of Microfibers and Nanofibers with Tissue Engineering and Regenerative Medicine Applications. Adv. Healthcare Mater. 4 (1), 11-28 (2015).
  53. Daniele, M. A., Radom, K., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfluidic Fabrication of Multiaxial Microvessels Via Hydrodynamic Shaping. RSC Advances. 4 (45), 23440-23446 (2014).
  54. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low Viscosity Bioink. Adv. Mater. 28 (4), 677-684 (2015).
  55. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting 3D Microfibrous Scaffolds for Engineering Endothelialized Myocardium and Heart-on-a-Chip. Biomaterials. 110, 45-59 (2016).
  56. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic Patterning for Fabrication of Contractile Cardiac Organoids. Biomed. Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
  57. Yue, K., et al. Synthesis, Properties, and Biomedical Applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  58. Loessner, D., et al. Functionalization, Preparation and Use of Cell-Laden Gelatin Methacryloyl-Based Hydrogels as Modular Tissue Culture Platforms. Nat. Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  59. Aung, A., Theprungsirikul, J., Lim, H. L., Varghese, S. Chemotaxis-Driven Assembly of Endothelial Barrier in a Tumor-on-a-Chip Platform. Lab Chip. 16, 1886-1898 (2016).
  60. Shin, S. R., et al. A Bioactive Carbon Nanotube-Based Ink for Printing 2d and 3d Flexible Electronics. Adv. Mater. 28 (17), 3280-3289 (2016).
  61. Shin, S. R., et al. Aptamer-Based Microfluidic Electrochemical Biosensor for Monitoring Cell Secreted Cardiac Biomarkers. Anal. Chem. 88, 10019-10027 (2016).
  62. Zhang, Y. S., et al. Google Glass-Directed Monitoring and Control of Microfluidic Biosensors and Actuators. Sci. Rep. 6, 22237 (2016).
  63. Colosi, C., et al. Rapid Prototyping of Chitosan-Coated Alginate Scaffolds through the Use of a 3d Fiber Deposition Technique. J. Mater. Chem. B. 2 (39), 6779-6791 (2014).
  64. Zhu, W., et al. Direct 3D Bioprinting of Prevascularized Tissue Constructs with Complex Microarchitecture. Biomaterials. 124, 106-115 (2017).
  65. Yu, Y., Zhang, Y., Martin, J. A., Ozbolat, I. T. Evaluation of Cell Viability and Functionality in Vessel-Like Bioprintable Cell-Laden Tubular Channels. J. Biomech. Eng. 135 (9), 091011-091011 (2013).
  66. Zhang, Y., Yu, Y., Chen, H., Ozbolat, I. T. Characterization of Printable Cellular Micro-Fluidic Channels for Tissue Engineering. Biofabrication. 5 (2), 025004 (2013).
  67. Zhang, Y., Yu, Y., Ozbolat, I. T. Direct Bioprinting of Vessel-Like Tubular Microfluidic Channels. J. Nanotechnol. Eng. Med. 4 (2), 020902 (2013).
  68. Dolati, F., et al. In Vitro Evaluation of Carbon-Nanotube-Reinforced Bioprintable Vascular Conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  69. Hansen, C. J., et al. High-Throughput Printing Via Microvascular Multinozzle Arrays. Adv. Mater. 25 (1), 96-102 (2013).

Tags

Bioteknik fråga 126 Bioprinting tissue engineering regenerativ medicin organoids orgel-on-chip vaskularisering endothelialization mikrofibrer
Simuleras Bioprinting för Engineering vaskulariserad vävnad och Organoids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen,… More

Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen, A. M. Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids. J. Vis. Exp. (126), e55957, doi:10.3791/55957 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter