Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55957
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University
* These authors contributed equally

Summary

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Abstract

הנדסת רקמות vascularized בונה, organoids היה מאתגר מבחינה היסטורית. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על microfluidic bioprinting כדי להפיק לפיגום עם multilayer השזירה הידרוג הסיבים. כדי להשיג חלקים bioprinting, ראש ההדפסה microfluidic הליבה-נדן המכיל ניסוח bioink ללא הפרדות צבע extruded מן הזרם הליבה והפתרון crosslinking נישא על ידי הזרם נדן, היה מתוכנן ולהכניסם אל bioprinter. על ידי מיזוג ג'לטין methacryloyl (GelMA) עם קילוף פלסטיצידיות, רב-סוכר זה עובר מיידי crosslinking יוניים רכוש בחר יונים כלט, ואחריו photocrosslinking משנית של הרכיב GelMA כדי להשיג מייצב קבוע, לפיגום microfibrous יכולה להיות מושגת באמצעות אסטרטגיה זו bioprinting. חשוב לציין, תאי אנדותל אנקפסולציה בתוך הסיבים bioprinted יכולים ליצור את לומן-מבני הדומה את להערכת במרוצת של תרבות במשך 16 ימים. לגרדום endothelialized microfibrous ניתן להשתמש בהמשך כדי לבנות רקמה vascularized דרך זריעה עוקבות של סוג משני תאים לתוך מרחב ביניים של הסיבים כמו מצע כלי הדם. Microfluidic bioprinting מספקת אסטרטגיה כללית בהנדסה נוח של רקמות vascularized-דיוק גבוה.

Introduction

. מטרות הנדסת רקמות כדי ליצור תחליפי רקמה תפקודית זה יכול לשמש כדי להחליף, לשחזר או להגדיל האלה פצוע או חולה גוף האדם1,2,3,4, לעיתים קרובות באמצעות שילוב של סוגי התאים הרצויים, מולקולות ביו5,6ו-9,8,7,biomaterials10 לאחרונה, טכנולוגיות הנדסת רקמות גם יותר ויותר שאומצו ליצירת במבחנה רקמות איברים דגמים המחקים את פונקציות חשובות של מקביליהם ויוו , עבור יישומים כגון פיתוח תרופות, החלפת קונבנציונאלי תא מישורי יתר מפושטת תרבויות11,12,13,14,15,16,17,18,19. בשני המצבים, יכולת לסכם את המיקרו-ארכיטקטורה מורכבת ואת המבנה ההירארכי של רקמות אנושיות הוא קריטי הפעלת פונקציונליות של רקמות מהונדסים10, בפרט, דרכים לשלב רשת כלי הדם לתוך רקמות מהונדסים הביקוש מאז vascularization מציג את אחד האתגרים הגדולים ביותר עד22,2321,20,שדה.

עד כה, מגוון רחב של גישות פותחו בהקשר זה, בניסיון לבנות מבנים כלי דם לתוך רקמות מהונדסים בונה עם דרגות שונות של הצלחה8. לדוגמה, הרכבה עצמית של תאי אנדותל מאפשר לדור של רשתות microvascular24; משלוח של גורמי גדילה אנגיוגנזה המניע מתמשכת כורוידאלית25,26; שימוש ובתאים וסקולרית ומקל pericytes תא אנדותל הצמיחה ואת מכלול24,27; עיצוב מאפיינים לגרדום מאפשר אפנון מדויק של28,vascularization29; תא גליון הטכנולוגיה מאפשרת תמרון נוח של כלי הדם בשכבות30. ובכל זאת, אסטרטגיות אלו לא להעניק את יכולת השליטה של המתבנת המרחבי של להערכת, המוביל לעיתים קרובות הפצה אקראית של כלי דם בתוך מבנה רקמות מהונדסים ובכך הפארמצבטית מוגבלת. במהלך השנים האחרונות התפתחה bioprinting מחלקה של הפעלת טכנולוגיות לקראת הפתרון של אתגר כזה, בשל שלהם צדדיות ללא תחרות של הפקדת רקמות מורכבות דפוסי דיוק גבוה, הפארמצבטית ב32,31,33צורה אוטומטית או חצי אוטומטית. Bioprinting ההקרבה34,35,36,37,38, bioprinting מוטבע-39,-40,-41, מבנה חלול bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 יש כל מה הפגינו את הכדאיות של יצירת רקמות לכלי הדם או vascularized.

לחלופין, אסטרטגיה bioprinting microfluidic לפברק פיגומים microfibrous פותחו לאחרונה, bioink היברידית המורכב alginate ואיפה ג'לטין methacryloyl (GelMA) הועבר דרך הליבה של אביזרים קונצנטריים פתרון סידן כלורי (2CaCl) בוצעה דרך הזרימה נדן החיצוני של54,ראש ההדפסה55. ההבלטה שיתוף של תזרימי שני המותר עבור crosslinking הפיזית המיידית של הרכיב alginate כדי לאפשר היווצרות מיקרופייבר, בעוד photocrosslinking הבאים הבטיחו קבוע ייצוב לגרדום microfibrous רב-שכבתית. ראוי לציין, תאי אנדותל אנקפסולציה בתוך הסיבים bioprinted נמצאו להתרבות ולהעביר לכיוון פריפריה של הסיבים בהנחה מבנים דמויי-לומן, זה ממש מחקה את המיטה וסקולרית54,55. Bioprinted אלו, endothelialized מיטות נימי הדם יכול להיות לאחר מכן מאוכלס עם הצורך סוגי תאים משנית נוספת לבנות רקמות vascularized55. פרוטוקול זה ובכך מספק הליך מפורט של כזה microfluidic bioprinting אסטרטגיה מופעלת על ידי עיצוב קונצנטריים זרבובית, המבטיח נוח פבריקציה נוספת של רקמות vascularized עבור יישומים פוטנציאליים הנדסת רקמות והן תא צורב דוגמנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Cardiomyocytes עכברוש neonatal בשימוש פרוטוקול זה הם בודדו אותנו מהמתרחש חולדות ספראג-Dawley בן יום-2 בעקבות הליך ומבוססת56 אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועד לשימוש בריגהם אנד וימנס.

1. אינסטרומנטציה של Bioprinter

  1. להוסיף מחט בוטה קטנים יותר (למשל, 27 גרם, 1 אינץ ') כמו הליבה לתוך המרכז של מחט בוטה גדול יותר (למשל, 18 גרם, ½ אינץ ') מהנרתיק כדי לבנות את שכבה כפולה, microfluidic קונצנטריים ראש ההדפסה; ודא כי המחט הליבה בולטת במקצת (~ 1 מ מ) יותר מאשר המעטפת החיצונית (איור 1א'). היישור בדרך כלל מותאמת באופן ידני, אבל אם מפרידי כלי הכרחי של הגדלים הראויים יכול להיות במשמורת דחוקה בין המחטים פנימי/חיצוני-הטיפ והן את הצדדים חבית כדי לסייע יישור קונצנטריים. חותם הצומת בין החביות עם דבק אפוקסי ולהסיר קפיציות יישור מהצד עצה כאשר הדבר ישים.
  2. להוסיף עוד מחט (23 גרם) הקנה של המחט המרכזית בכיוון ההפוך.  לאחר מכן ליצור חור בצד של החבית של המחט החיצוני, להוסיף מחבר מתכת של התאמת גודל לתוך החור, ואחריו איטום עם דבק אפוקסי.
  3. לחבר את פתחי הכניסה של ראש ההדפסה אל ערוץ כפול מזרק משאבה להזרקה את bioink ואת הפתרון crosslinking, בנפרד, דרך שני צינורות PVC. הר. המתקן אל ראש bioprinter באמצעות בעל פלסטיק עשוי poly(methyl methacrylate) (PMMA).
    הערה: Bioprinter הבחירה תלויה בזמינות. במקרה שלנו, בדקנו בהצלחה תוכנית התקנה זו על מספר bioprinters זמינים מסחרית. עם זאת, כל bioprinter אשר כולל שלב ממונע x-y-z צריך, בעקרון, לאפשר שילוב של אביזרים microfluidic הזה.

2. Bioprinting המיטה כלי דם Microfibrous

  1. להפוך את bioink בעזרת תערובת של קילוף פלסטיצידיות (4 w/v%, צמיגות נמוכה),57,methacryloyl (GelMA, w/v% 1-2) ג'לטין58photoinitiator Irgacure 2959 (0.2 - 0.5 wt.%) מומס piperazin 2-[4-(2-hydroxyethyl) 25 מ מ- 1-yl] אתאן sulfonic חומצה (מאגר HEPES, pH 7.4) המכילה 10 vol.% עוברי שור סרום (FBS).
  2. להפוך פתרון של 0.3-M CaCl2 HEPES מאגר המכיל 10 vol.% FBS כמו הנוזל המוביל crosslinking.
  3. מיד לפני bioprinting, מביצועם יפתור תאי אנדותל (HUVECs) מן המבחנות באמצעות טיפול על ידי טריפסין w/v% 0.05 למשך 5-10 דקות, resuspend בתאים bioink-ריכוז של 5-10 × 106 תאים/mL.... Pipette התליה לאט 5 עד 10 פעמים כדי להבטיח הפצה הומוגנית.
  4. התחל ההזרקה של הנוזל bioink/crosslinking באמצעות ערוץ כפול מזרק משאבה-זרימה התעריפים של 5 µL/mL. תזרימי מותר לרוץ ללא הרף בעד 1דקות עד קצב לב. לאחר מכן, ליזום את תנועת ראש ההדפסה על-ידי שליטה על bioprinter במהירות התצהיר של 4 מ מ/s (איור 1B). המהירויות הללו עשויים צריך בסדר כוונון עם כל ההתקנה החדשה כדי לוודא bioprinting אופטימלית. תהליך bioprinting מתנהל בדרך כלל בטמפרטורת החדר (21-25 ° C) אבל זו הטמפרטורה עשויה להשתנות. תהליך bioprinting צריך לאפשר מהר יוניים gelation של הרכיב alginate, הפקדת לפיגום microfibrous (איור 1B).
  5. לאחר לגרדום bioprinted, להשיג gelation כימי על ידי נוספת photocrosslinking הרכיב GelMA, כ 5-10 mW/cm2 של אור UV (360-480 ננומטר) עבור 20-30 s (איור 1C).
  6. בעקבות bioprinting crosslinking, לשטוף בעדינות לגרדום בתמיסת באגירה פוספט (PBS) כדי להסיר את עודפי CaCl2. תרבות לגרדום עמוסי HUVECs microfibrous תא אנדותל הצמיחה בינוני (EGM) באינקובטור 37 ° C ו 5 vol.% CO2 עד 16 ימים בינונית השתנה לפחות כל יומיים. נטר את מורפולוגיות של HUVECs תחת מיקרוסקופ במהלך תקופת תרבות.

3. בניית הרקמות Vascularized

  1. ברגע HUVECs להתגורר פריפריה של הסיבים ב לגרדום להקים מבנים דמויי לומן (איור 1D), לאחזר לגרדום, הנח אותו בעדינות על פני משטח הידרופובי (למשל, פרוסת polymethylsiloxane [PDMS]). להשתמש בזהירות להסיר כל המדיום מן המרחב אינטרסטיציאליות של לגרדום בכוח נימי פיסת נייר סינון סטרילי.
  2. מיד להוסיף טיפה (כ 20-40 µL) התליית סוג משני תאים (למשל, cardiomyocytes) בינוני-צפיפות של 1-10 × 106 תאים למ"ל על הגרדום, אשר אמור לחדור את כל החלל אינטרסטיציאליות של לגרדום (איור 1E). דגירה תצורה כזו בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5 vol.% CO2, 95% לחות יחסית) על 0.5 - 2 h כדי לאפשר את התאים לדבוק על הסיבים בודדים. לנטר את גודל droplet על התקופה על מנת להבטיח כי אין התאדות ניכרת נצפית.
  3. יש לשטוף בעדינות פיגומים ע י ניעור באמבט PBS להסיר תאים שאינם מחסידי, ו תרבות הבונה במדיום רלוונטי עד הרקמה vascularized הרצוי הוא נוצר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האסטרטגיה bioprinting microfluidic מאפשר bioprinting ישירה ההבלטה של פיגומים microfibrous באמצעות צמיגות נמוכה bioinks54,55. כפי שמוצג באיור 2א, לפיגום בגודל של 6 × 6 × 6 מ מ3 המכיל > 30 שכבות של הסיבים יכול להיות bioprinted בתוך 10 דקות. Crosslinking יוניים מיידית הרכיב alginate עם CaCl2 מותרת עבור המבנית מעולה במהלך תהליך bioprinting בזמן photocrosslinking הפיזי עוקבות של הרכיב GelMA מובטחת יציבות לטווח ארוך של לגרדום microfibrous bioprinted, כפי שמעידה מבט מלמעלה, מבט צד שמוצג דמויות 2B ו- 2 C. הסיבים מושגת במקרה זה, בתנאים bioprinting שנקבעו בו, היו כ- 100-150 מיקרומטר בקוטר, אשר מעט עלייה נוספות עם נפיחות.

התהליך bioprinting, לרבות ההבלטה microfluidic את bioink, את crosslinking יוניים ו את photocrosslinking, לא השפיעה באופן משמעותי על הכדאיות של HUVECs שעברו אנקפסולציה. התאים לשמר את הכדאיות גבוה יחסית של > 80% לאחר סיום כל ההליכים האלה (איור 2D). כפי שדווח מוקדם יותר54,55, HUVECs יכולת בהדרגה להתרבות ולהעביר בתוך הסיבים התפלגות אקראית בתחילה ביום 0 (איור 2E) כדי פריפריה של הסיבים להניח לומן-מבני-ביום 16 פוסט-bioprinting בתרבות (איור 2F). התנהגות כזו שנצפו את HUVECs היה סביר בשל הנטייה פנימי ממשק מונחה של תאי אנדותל, כמו גם את זמינות גבוהה יותר של חומרים מזינים וחמצן סביב הסיבים מאשר ב-55,שלהם פנים59.

לגרדום microfibrous יכול גם לשמש פלטפורמה עצמאית הנדסת רקמות. כדוגמא רקמת שריר הלב, עכברוש neonatal cardiomyocytes היו נזרע על שטח בין-תאי של לפיגום bioprinted-צפיפות של 5 × 106 תאים למ"ל, תרבותי, של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10 vol.% FBS. המדיום השתנה כל יום ב- 2-3 הימים הראשונים עד cardiomyocytes התחילו להכות, אחרי אשר רק ½ היה בינוני החליפו כל 2-3 ימים55,60,61,62. התאים יכולים לשמור על שלהם ספונטנית ומסונכרן להכות עד 9-28 ימים בהתאם תא המקור, התצורה של פיגומים55. Cardiomyocytes בוגרת על הגרדום הראה גם ביטוי חזק של סמנים ביולוגיים לב פונקציונליים כמו מאויר של תמונות פלורסצנטיות קונאפוקלית איור 3, כולל sarcomeric α-actinin (איור 3ב) connexin-43 (איור 3ג').

שילוב תאי אנדותל ואת סוג משני תא, רקמה vascularized יכול עוד להיבנות. שוב, באמצעות שריר הלב כדוגמה, לאחר המיטה וסקולרית נוצרה ב לפיגום microfibrous bioprinted אחרי בערך 16 ימים של תרבות, עכברוש neonatal cardiomyocytes היו לאחר מכן נזרע לתוך מרחב ביניים של לגרדום. לאחר culturing ההבשלה במדיום משותף מורכב של אמצעי אחסון 1:1 מנה של EGM:DMDM, רקמת שריר הלב endothelialized יכול להיווצר מפגין מכות ספונטנית ולא סינכרוני55. תמונות פלורסצנטיות קונאפוקלית מטוס יחיד באיור 4 נוסף חשף דו קיום של סוגי תאים, עם HUVECs בעיקר נוכח לגבולות של הסיבים (איור 4B) וגם את cardiomyocytes המקיפים את הקירות החיצוניים של הסיבים (איור 4C).

Figure 1
איור 1 : בונה האסטרטגיה Bioprinting Microfluidic ליצירת רקמות Vascularized.
(א) העיצוב של ראש ההדפסה קואקסיאליים לשחול שותף את bioink ללא הפרדות צבע, CaCl2הליבה-נדן. (B-E) שרטוט המציג את ההליך פבריקציה נוספת של רקמה vascularized לבנות. דמות זו שונתה באישור הפניה למעורר55. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : Bioprinting המיטה כלי דם Microfibrous.
(א) צילום מציג לפיגום 30-שכבה microfibrous bioprinted. (B, C) נופים העליון ואת הצד של micrographs מציג לפיגום bioprinted. (ד) יכולת הקיום של HUVECs שהצפיפות לפיגום microfibrous bioprinted. ירוק ואדום עולה תאים מתים וחיים, בהתאמה. (E, F) קרינה פלואורסצנטית micrographs מציג הארגון של חלבון fuorescent ירוק (GFP)-HUVECs של הסיבים bioprinted ביום 0 ו-16 יום פוסט bioprinting, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הצמיחה עוקבות של Cardiomyocytes על הגרדום Microfibrous Bioprinted.
קרינה פלואורסצנטית micrographs מציג גרעינים (א) , (B) sarcomeric α-actinin, (ג) connexin-43 ו- superimposition (D) . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : בניית רקמות שריר הלב Endothelialized.
קרינה פלואורסצנטית micrographs מציג גרעינים (א) , (B) GFP-HUVECs, (ג) f-אקטין של HUVECs, cardiomyocytes וגם superimposition (D) . שיבוץ ברה מציג תמונה התחתונה-הגדלה של רקמת שריר הלב endothelialized. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלים Dataset.
מדגם G-code קובץ עבור bioprinting × 6 מרובע-סריג 6 של מ מ2 , עם 220 מיקרומטר המרווח בין הסיבים סמוכים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בניית ראש ההדפסה co-צירית מייצג צעד קריטי לקראת bioprinting microfluidic מוצלח כדי לאפשר משלוח בו זמנית של שתי bioink הליבה והסוכנת crosslinking מהנדן. בעוד פרוטוקול זה ראש ההדפסה דוגמה נוצר באמצעות מחט 27G וגם הליבה של מחט 18 גרם כמו המעטפת, זה ברצון יורחב למגוון רחב של שילובים באמצעות מחטים בגדלים שונים. עם זאת, שינוי גודל מחט, אשר תוצאות השינוי בכמות הזרימה יועבר. בתוך כל שלב, ידרוש אופטימיזציה נוספת של המחירים זרימה של הן את bioink, הסוכן crosslinking (בשליטה באמצעות שתי משאבות מזרק במקום ערוץ כפול), וגם פוטנציאל המהירות התצהיר שנגרמו bioprinter.

השילוב של הפרמטרים (מחט גדלים, המחירים זרימה, ומהירות התצהיר) בפרוטוקול הנוכחי הובילה הסיבים bioprinted בקוטר של-120 מיקרומטר מיד לאחר התצהיר, אשר להתנפח מיקרומטר 150 בערך לאחר equilibration ב בינוני55. גודל כזה גם בערך שווה ערך בעובי שכבה של המבנה bioprinted היה רווח בין השכבות של הסיבים. הקוטר של הסיבים bioprinted היא פונקציה של כל שלושת הפרמטרים54,63; הגודל של המחט הליבה של ראש ההדפסה ואת קצב הזרימה של bioink נמצאים בקורלציה חיובית עם הקוטר של הסיבים, ואילו הגודל של המחט נדן, קצב הזרימה של הסוכן crosslinking ומהירות התצהיר נמצאים בקורלציה שלילית בקוטר של הסיבים. השליטה בתנועת את ראש ההדפסה ו/או השלב ממונע תאפשר בתצהיר של פיגומים microfibrous של מבנים שרירותי54,55.

יתר על כן, ניסוח של bioink עשויה לשנות את הפרופיל של bioprinting כמו גם. לדוגמה, הסכום של קילוף פלסטיצידיות GelMA יכול להיות מאופנן מעט על פי יישומים ספציפיים, ניתן להשתלב בחומרים נוספים bioink, כגון פוליאתילן גליקול-tetraacrylate (PEGTA) המגבירה את המכניקה של הסיבים bioprinted40. Crosslinking UV קובע גם התכונות המכאניות של מרכז הסיבים bioprinted, אשר יכולים להשפיע עוד יותר את אופן הפעולה של תאי אנדותל מוטבע54. הפרמטרים דיווחו פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור HUVECs. עם זאת, הוא צפוי כי לכל סוג שונה של תאי אנדותל הפרמטרים crosslinking יהיה צורך מחדש ממוטבת כדי להשיג לומן-צורה הסיבים.

כדי להפיץ את סוג התא משנית אל המיטה כלי דם bioprinted, יש צורך למקם לגרדום על גבי פיסת משטח הידרופובי ולהבטיח כי רוב בינוני במרחב אינטרסטיציאליות של לגרדום מוסר. פעולה זו תאפשר חדירה מיידית של התליה תא לתוך המבנה microfibrous של droplet שעמד חופשי, לבצע לגרדום במהלך זריעה, הגדלת מספר התאים מחוברים אל פני השטח של הסיבים. למרות צפיפות גבוהה יחסית של cardiomyocytes ב 5 × 106 תאים למ"ל ששימשה לבניית רקמת שריר הלב בפרוטוקול הנוכחי, צפיפות כזו יהיה מכוון באופן שרירותי כדי להתאים את סוגי רקמות ספציפיות. חשוב גם לשמור על סביבה humidified, אשר יכול להתממש באמצעות מילוי במים סטריליים או PBS בקרבת לגרדום (קרי, הבארות שמסביב או השטח שסביב השולחן הזה PDMS), ולהבטיח כי כמות קטנה של בינוני על זריעת לא להתאדות במשך התקופה של זריעה.

לסיכום, סיפקנו פרוטוקול מפורט של microfluidic bioprinting להרכבת נוח רקמות vascularized. באסטרטגיה זו, אביזרים co-צירית הליבה-נדן משמש כדי לאפשר טבעים בו זמנית bioink היברידית של הסוכן crosslinking והליבה מהנדן. בעת שיתוף שחול, bioink מיד עובר crosslinking הפיזי שלו הרכיב alginate ויוצרים לפיגום microfibrous בשכבות כפי מתוכנתים על ידי התנועה של bioprinter, בעוד הבונה כולה היא יותר מבחינה כימית photocrosslinked עבור הרכיב GelMA לאפשר יציבות לטווח ארוך. תאי אנדותל במארז הסיבים במהלך תהליך bioprinting יכולים להתרבות, להגר פריפריה בהנחה מבנים דמויי-לומן, הופכת לגרדום מיטה כלי הדם. על ידי זריעה סוג משני תאים, מבנה רקמות vascularized ניתן לאחר מכן להפיק. אסטרטגיה זו bioprinting microfluidic הוא ייחודי, ניתן להרחיב בנוחות את מגוון סוגי רקמות כגון הכבד, השלד שריר ולאחר סרטן חוץ שריר הלב מאויר בפרוטוקול הנוכחי, על ידי שילוב רציונלי של סוגי התאים הרצויים תוכנן במיוחד דפוסים של פיגומים microfibrous bioprinted. בונה רקמות vascularized מיוצר עם השיטה עשוי לשמש עבור התחדשות רקמות בתוך vivo או במבחנה רקמות דוגמנות.

קיימות מספר מגבלות המשויך האסטרטגיה bioprinting microfluidic המתוארות פרוטוקול זה. ראשית, הקוטר של הסיבים bioprinted הוא מוגבל כמה מאות מיקרומטר בשל מחסום דיפוזיה של המטריקס הידרוג עבור הפתרון2 CaCl ביעילות crosslink הרכיב alginate הליבה. צפיפות crosslinking פיזי נמוך מדי יגרום את מבנה רב שכבתי לא יציב. שנית, לנצל הסוכן crosslinking הפיזי של פתרון2 CaCl השפעות שליליות על סוגים מסוימים של תאי אנדותל זה שבירות יותר HUVECs, כגון תאי אנדותל קדמון. הכדאיות של שימוש bioprinting השיטה עבור מגוון רחב יותר של סוגי תאים אנדותל עשויים לדרוש חקירות נוספות. שלישית, בעוד תאי אנדותל יכול ליצור מבנים דמויי-לומן בתוך הסיבים, הליבות של הסיבים האלה אינן חלולות כדי לאפשר זלוף. לכן, חומרים מזינים וחמצן ניתנים עדיין בעיקר דרך החלל interstitial פיגומים bioprinted. ההסתגלות של חומרים ההקרבה כרכיב photocrosslinkable של bioink64 עשויה לפתור בעיה זו בגירסאות עתידיות של הטכנולוגיה. לחלופין, בונה bioprinted microfibrous הולו מבנים42,43,65,66,67,68 יכולה לשמש המיטה כלי הדם כדי להבטיח זלוף ישירה של הרקמה vascularized. האחרון bioprinting של רקמות קליניים בגודל עדיין ייתכן מאתגר, אשר ככל הנראה ניתן לטפל על ידי שילוב העיצוב של microfluidic ערוכים printheads69 כדי להשיג bioprinting מורחב-סולם-תפוקה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

המחברים להכיר המכון הלאומי לסרטן של מוסדות לאומיים של בריאות מסלול העצמאות פרס (K99CA201603).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich A0682 BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) Sigma-Aldrich 410896 98%
HEPES buffer Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 10438026 Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001GFP GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific 12430054 High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system Excelitas Technologies OmniCure S2000 Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in Tissue Engineering. Sci. Am. 300 (5), 64-71 (2009).
  3. Langer, R. Tissue Engineering: Status and Challenges. E-Biomed: J.Regen. Med. 1 (1), 5-6 (2004).
  4. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering Complex Tissues. Sci. Transl. Med. 4 (160), 112 (2012).
  5. Biondi, M., Ungaro, F., Quaglia, F., Netti, P. A. Controlled Drug Delivery in Tissue Engineering. Adv. Drug Del. Rev. 60 (2), 229-242 (2008).
  6. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled Growth Factor Delivery for Tissue Engineering. Adv. Mater. 21 (32-33), 3269-3285 (2009).
  7. Hubbell, J. A. Biomaterials in Tissue Engineering. Nat. Biotechnol. 13 (6), 565-576 (1995).
  8. Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in Biomaterials for Tissue Engineering. Nat. Mater. 8 (6), 457-470 (2009).
  9. Rice, J. J., et al. Engineering the Regenerative Microenvironment with Biomaterials. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 57-71 (2012).
  10. Zhang, Y. S., Xia, Y. Multiple Facets for Extracellular Matrix Mimicking in Regenerative Medicine. Nanomedicine. 10 (5), 689-692 (2015).
  11. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  12. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic Organs-on-Chips. Nat. Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-Chips at the Frontiers of Drug Discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Seeking the Right Context for Evaluating Nanomedicine: From Tissue Models in Petri Dishes to Microfluidic Organs-on-a-Chip. Nanomedicine. 10, 685-688 (2015).
  15. Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., Van Noort, D., Yu, H. Towards a Human-on-Chip: Culturing Multiple Cell Types on a Chip with Compartmentalized Microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
  16. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  17. Sung, J. H., et al. Microfabricated Mammalian Organ Systems and Their Integration into Models of Whole Animals and Humans. Lab Chip. 13 (7), 1201-1212 (2013).
  18. Wikswo, J. P. The Relevance and Potential Roles of Microphysiological Systems in Biology and Medicine. Exp. Biol. Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  19. Yum, K., Hong, S. G., Healy, K. E., Lee, L. P. Physiologically Relevant Organs on Chips. Biotechnol. J. 9 (1), 16-27 (2014).
  20. Nomi, M., Atala, A., Coppi, P. D., Soker, S. Principals of Neovascularization for Tissue Engineering. Mol. Aspects Med. 23 (6), 463-483 (2002).
  21. Jain, R. K., Au, P., Tam, J., Duda, D. G., Fukumura, D. Engineering Vascularized Tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 821-823 (2005).
  22. Rouwkema, J., Rivron, N. C., Van Blitterswijk, C. A. Vascularization in Tissue Engineering. Trends Biotechnol. 26 (8), 434-441 (2008).
  23. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Sci. Transl. Med. 4 (160), 123 (2012).
  24. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
  25. Perets, A., et al. Enhancing the Vascularization of Three-Dimensional Porous Alginate Scaffolds by Incorporating Controlled Release Basic Fibroblast Growth Factor Microspheres. J. Biomed. Mater. Res. A. 65 (4), 489-497 (2003).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining Neovascularization of a Scaffold through Staged Release of Vascular Endothelial Growth Factor-A and Platelet-Derived Growth Factor-BB. Tissue Eng. A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of Adult Mesenchymal Stem Cells on in Vitro Vascular Formation. Tissue Eng. A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  28. Quint, C., et al. Decellularized Tissue-Engineered Blood Vessel as an Arterial Conduit. Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  29. Choi, S. -W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in Biodegradable Inverse Opal Scaffolds with Uniform and Precisely Controlled Pore Sizes. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 145-154 (2013).
  30. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of Three-Dimensional Vascularized Cardiac Tissue with Cell Sheet Engineering. J. Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  31. Zhang, Y. S., et al. 3D Bioprinting for Tissue and Organ Fabrication. Ann. Biomed. Eng. 45 (1), 148-163 (2017).
  32. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv. Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  33. Murphy, S. V., Atala, A. 3d Bioprinting of Tissues and Organs. Nat. Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  34. Miller, J. S., et al. Rapid Casting of Patterned Vascular Networks for Perfusable Engineered Three-Dimensional Tissues. Nat. Mater. 11 (9), 768-774 (2012).
  35. Bertassoni, L. E., et al. Hydrogel Bioprinted Microchannel Networks for Vascularization of Tissue Engineering Constructs. Lab Chip. 14 (13), 2202-2211 (2014).
  36. Kolesky, D. B., et al. 3d Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  37. Lee, V. K., et al. Creating Perfused Functional Vascular Channels Using 3d Bio-Printing Technology. Biomaterials. 35 (28), 8092-8102 (2014).
  38. Zhang, Y. S., et al. Bioprinted Thrombosis-on-a-Chip. Lab Chip. 16, 4097-4105 (2016).
  39. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the Granular Gel Medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  40. Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3d Printing of Shear-Thinning Hydrogels into Self-Healing Hydrogels. Adv. Mater. 27 (34), 5075-5079 (2015).
  41. Hinton, T. J., et al. Three-Dimensional Printing of Complex Biological Structures by Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  42. Jia, W., et al. Direct 3d Bioprinting of Perfusable Vascular Constructs Using a Blend Bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  43. Zhang, Y., et al. In Vitro Study of Directly Bioprinted Perfusable Vasculature Conduits. Biomaterials Science. 3 (1), 134-143 (2015).
  44. Gao, Q., He, Y., Fu, J. -Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial Nozzle-Assisted 3D Bioprinting with Built-in Microchannels for Nutrients Delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  45. Cornock, R., Beirne, S., Thompson, B., Wallace, G. G. Coaxial Additive Manufacture of Biomaterial Composite Scaffolds for Tissue Engineering. Biofabrication. 6 (2), 025002 (2014).
  46. Duan, B., Hockaday, L. A., Kang, K. H., Butcher, J. T. 3D Bioprinting of Heterogeneous Aortic Valve Conduits with Alginate/Gelatin Hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. A. 101 (5), 1255-1264 (2013).
  47. Skardal, A., et al. Photocrosslinkable Hyaluronan-Gelatin Hydrogels for Two-Step Bioprinting. Tissue Eng. A. 16 (8), 2675-2685 (2010).
  48. Li, S., et al. Direct Fabrication of a Hybrid Cell/Hydrogel Construct by a Double-Nozzle Assembling Technology. J. Bioact. Compatible Polym. 24 (3), 249-265 (2009).
  49. Visser, J., et al. Biofabrication of Multi-Material Anatomically Shaped Tissue Constructs. Biofabrication. 5 (3), 035007 (2013).
  50. Boyd, D. A., Adams, A. A., Daniele, M. A., Ligler, F. S. Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape. Journal of visualized experiments: JoVE. (83), e50958 (2014).
  51. Daniele, M. A., Adams, A. A., Naciri, J., North, S. H., Ligler, F. S. Interpenetrating Networks Based on Gelatin Methacrylamide and Peg Formed Using Concurrent Thiol Click Chemistries for Hydrogel Tissue Engineering Scaffolds. Biomaterials. 35 (6), 1845-1856 (2014).
  52. Daniele, M. A., Boyd, D. A., Adams, A. A., Ligler, F. S. Microfluidic Strategies for Design and Assembly of Microfibers and Nanofibers with Tissue Engineering and Regenerative Medicine Applications. Adv. Healthcare Mater. 4 (1), 11-28 (2015).
  53. Daniele, M. A., Radom, K., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfluidic Fabrication of Multiaxial Microvessels Via Hydrodynamic Shaping. RSC Advances. 4 (45), 23440-23446 (2014).
  54. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low Viscosity Bioink. Adv. Mater. 28 (4), 677-684 (2015).
  55. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting 3D Microfibrous Scaffolds for Engineering Endothelialized Myocardium and Heart-on-a-Chip. Biomaterials. 110, 45-59 (2016).
  56. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic Patterning for Fabrication of Contractile Cardiac Organoids. Biomed. Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
  57. Yue, K., et al. Synthesis, Properties, and Biomedical Applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  58. Loessner, D., et al. Functionalization, Preparation and Use of Cell-Laden Gelatin Methacryloyl-Based Hydrogels as Modular Tissue Culture Platforms. Nat. Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  59. Aung, A., Theprungsirikul, J., Lim, H. L., Varghese, S. Chemotaxis-Driven Assembly of Endothelial Barrier in a Tumor-on-a-Chip Platform. Lab Chip. 16, 1886-1898 (2016).
  60. Shin, S. R., et al. A Bioactive Carbon Nanotube-Based Ink for Printing 2d and 3d Flexible Electronics. Adv. Mater. 28 (17), 3280-3289 (2016).
  61. Shin, S. R., et al. Aptamer-Based Microfluidic Electrochemical Biosensor for Monitoring Cell Secreted Cardiac Biomarkers. Anal. Chem. 88, 10019-10027 (2016).
  62. Zhang, Y. S., et al. Google Glass-Directed Monitoring and Control of Microfluidic Biosensors and Actuators. Sci. Rep. 6, 22237 (2016).
  63. Colosi, C., et al. Rapid Prototyping of Chitosan-Coated Alginate Scaffolds through the Use of a 3d Fiber Deposition Technique. J. Mater. Chem. B. 2 (39), 6779-6791 (2014).
  64. Zhu, W., et al. Direct 3D Bioprinting of Prevascularized Tissue Constructs with Complex Microarchitecture. Biomaterials. 124, 106-115 (2017).
  65. Yu, Y., Zhang, Y., Martin, J. A., Ozbolat, I. T. Evaluation of Cell Viability and Functionality in Vessel-Like Bioprintable Cell-Laden Tubular Channels. J. Biomech. Eng. 135 (9), 091011-091011 (2013).
  66. Zhang, Y., Yu, Y., Chen, H., Ozbolat, I. T. Characterization of Printable Cellular Micro-Fluidic Channels for Tissue Engineering. Biofabrication. 5 (2), 025004 (2013).
  67. Zhang, Y., Yu, Y., Ozbolat, I. T. Direct Bioprinting of Vessel-Like Tubular Microfluidic Channels. J. Nanotechnol. Eng. Med. 4 (2), 020902 (2013).
  68. Dolati, F., et al. In Vitro Evaluation of Carbon-Nanotube-Reinforced Bioprintable Vascular Conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  69. Hansen, C. J., et al. High-Throughput Printing Via Microvascular Multinozzle Arrays. Adv. Mater. 25 (1), 96-102 (2013).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 126 Bioprinting התרופה משובי הנדסת רקמות organoids עוגב על שבב vascularization endothelialization הסיבים
Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen,… More

Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen, A. M. Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids. J. Vis. Exp. (126), e55957, doi:10.3791/55957 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter