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Genetics

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

Wir berichten über die Protokolle für die Synthese und Reinigung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände. Die biochemischen und biophysikalischen Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs werden beschrieben.

Abstract

RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele. So gibt es großes Potenzial bei der Entwicklung von chemischen Sonden und therapeutische Liganden für die Anerkennung der RNA-Sequenz und Struktur. Chemisch verändert Peptide Nucleic Acid (PNA) Oligomere vor kurzem entwickelt worden sind, die RNA-Maisonetten in einer Sequenz-spezifische Weise erkennen können. PNAs sind chemisch stabil mit einem neutralen Peptid-ähnliche-Backbone. PNAs können relativ leicht durch das manuelle Boc-Chemie Festphasen-Peptid-Synthese-Verfahren synthetisiert werden. PNAs sind durch Reverse-Phase-HPLC, gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-Zeit des Fluges (MALDI-TOF) gereinigt. Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Technik erleichtert die Bildgebung der triplex-Formation, da sorgfältig entworfen, freie RNA duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration raten. Non-Denaturierung Seite mit Interkalation Bromid Post Färbung ist oft eine einfache und informative Technik zur Charakterisierung der verbindlichen Affinitäten und Besonderheiten der PNA Oligomere. In der Regel mehrere RNA Haarnadeln oder Maisonetten mit einzigen Basenpaar Mutationen lässt sich PNA Bindeeigenschaften wie verbindliche Affinitäten und Besonderheiten charakterisieren. 2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); die 2-Aminopurine Fluoreszenz-Intensität ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung und eignet sich für die Überwachung der triplex Bildung mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA-Bindungsstelle aufgenommen. 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration kann auch verwendet werden, um die verbindliche Selektivität der modifizierten PNAs zur gezielten doppelsträngigen RNAs (DsRNAs) über einzelsträngigen RNAs (SsRNAs) zu bestätigen. UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität des PNA-RNA Maisonetten und PNA· RNA-2 -Triplexen. Hier beschreiben wir die Synthese und Reinigung von PNA Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände und biochemische und biophysikalische Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs beschreiben.

Introduction

RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele, durch die jüngsten Fortschritte in der Entdeckungen der RNAs Rollen in der Verordnung und Katalyse von diversen biologischen Prozessen1,2,3. Traditionell wurden antisense Stränge zur Bindung an SsRNAs durch Watson-Crick duplex Bildung3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. vor kurzem Triplex-bildende Peptid-Nukleinsäuren (TFPNAs) wurden entwickelt, um DsRNAs über Hoogsteen Wasserstoffbindung (Abbildung 1)3,28,29binden. DsRNA Regionen befinden sich in den meisten der traditionellen Antisense-gezielte RNAs, einschließlich Pre-mRNAs und mRNAs, Pre oder Pri-MiRNAs3und viele andere nicht-kodierende RNAs1,26,27. DsRNAs durch Dreifachhelix Bildung mit TFPNAs Targeting kann aufgrund seiner Struktur Besonderheit vorteilhaft sein und ist mit großem Potenzial für den Einsatz bei der Wiederherstellung der normalen Funktionen der RNAs, die Dysregulated in Krankheiten, zum Beispiel.

Die kürzlich veröffentlichten Arbeiten von Rozners Et Al., und uns3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, berichtet die Bemühungen zur Verbesserung der die selektive Bindung von modifizierten TFPNAs in Richtung DsRNAs mit verstärkten Affinität. Wir haben Synthesemethoden für rational gestalteten PNA Monomere (Abbildung 2) einschließlich Thio-Pseudoisocytosine (L) Monomer30 und Guanidin-modifizierten 5-Methyl Cytosin (Q) Monomer31entwickelt. Durch verschiedene biochemische und biophysikalische Charakterisierungsmethoden haben wir gezeigt, dass relativ kurzen PNAs (6-10 Rückstände) Einbeziehung L und Q Rückstände verbesserte Erkennung von Watson-Crick-G-C- und C-G Basenpaaren, bzw. in DsRNAs zeigen. Darüber hinaus zeigen im Vergleich zu unveränderten PNAs, PNAs, die L und Q Rückstände enthalten mehr selektive Bindung in Richtung DsRNA SsRNA und DsDNA. Die Guanidin-Funktionalität-42 in der Q-Base ermöglicht PNAs HeLa Zellen31eingeben.

In unserem Labor zu synthetisieren wir PNAs durch manuellen Boc-Chemie (Boc oder t- Boc steht für Tert-Butyloxycarbony (siehe Abbildung 2) Festphasen-Peptid-Synthese Methode4. Die Synthese von PNA Monomer mit Boc als das Amin Gruppe zu schützen ist praktisch, da die Boc Group sterisch weniger sperrig im Vergleich zu Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin Schutz-Gruppe, die während der Kopplung ist auf PNA-Monomer kann vorteilhaft sein die solide Unterstützung. Die Boc Group ist Säure-labil und kann leicht auf die solide Unterstützung von 20-50 % Trifluoroacetic Säure (TFA) in Dichlormethan (DCM) während der PNA Synthese entfernt. Ein automatisierte Peptid-Synthesizer einsetzbar, PNA Oligomere zu synthetisieren; Allerdings braucht man 3-5-fach Übermaß an PNA Monomer für eine automatisierte Peptid-Synthesizer. Manuelle Synthese erfordert deutlich weniger PNA Monomer (2-3-Fach Selbstbehalt), mit jede Kupplung leicht von der Kaiser-Test43überwacht. Darüber hinaus sind viele automatisierte Synthesizer während der Boc-Schritt Entfernung nicht kompatibel mit der Boc-Strategie-Synthese durch den Einsatz von ätzenden TFA.

Die PNA-Oligomere können durch Reverse-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von MALDI-TOF gereinigt werden (Abbildungen 3 und 4)30, 31. beschäftigen wir nicht Denaturierung Seite triplex Bildung zu überwachen, dass freie RNA-Duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration Rate (Abbildung 5)30,31 . Keine Kennzeichnung ist erforderlich, wenn Post-effiziente Färbung für beide RNA duplex und PNA· erreicht werden kann RNS2 triplex Bands. Eine relativ kleine Menge der Probe ist für nicht-Denaturierung Seite Experimente erforderlich. Jedoch die Belastung (Inkubation) Puffer und die laufenden Puffer (pH 8,3) dasselbe, was in den Messungen wird beschränkt auf die kinetisch stabilen Triplexen, weil ein relativ hoher pH-Wert von 8,3 deutlich ein Triplex destabilisieren kann möglicherweise nicht.

2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); der 2-Aminopurine Fluoreszenzintensität (mit einer Emission Peak bei etwa 370 nm) ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung, und ist geeignet für die Überwachung der triplex Formation mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA Website (verbindlich aufgenommen Abbildung 6) 31. im Gegensatz zu vielen anderen Farbstoffen, die Fluoreszenzemission im sichtbaren Bereich zeigen, 2 Aminopurine beschriftet RNA kann ausgesetzt werden Raumlicht ohne Foto bleichen. Im Gegensatz zu Seite Experiment, in dem ein laufende Puffer pH 8,3 ist oft notwendig, 2-Aminopurine basierte Fluoreszenz Titration ermöglicht die Messung der Bindung in einer Lösung bei einem bestimmten pH-Wert, und so gestatten die Messung und Erfassung von relativ schwach und kinetisch instabil Bindung im Gleichgewicht.

UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität von Maisonetten (Abbildung 7)31 und triplexe30,32,44,45. Je nach Länge und Sequenz das Schmelzen des Triplexen kann oder kann nicht zeigen einen deutlichen Übergang. Thermodynamischen Parameter können erhalten werden, wenn die Heiz- und Kurven überlappen. Exakte thermodynamische Parameter erhalten Sie durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC)32; relativ große Mengen an Proben sind jedoch in der Regel erforderlich für ITC.

Protocol

1. manuelle Festphasen-Peptid Synthese von PNAs verwenden Boc Chemie

Hinweis: für den Erfolg und die Leichtigkeit der gewünschten PNA Oligomer Synthese, die Lösungsmittel und Reagenzien sollten wasserfrei sein. Fügen Sie die entsprechenden Molekularsiebe (4A, 1-2 mm Durchmesser Pellets) und gelegentlich leeren Sie trockenem Stickstoffgas in Flaschen. Für die Synthese von modifizierten PNA Monomere können die gemeldeten Protokolle im jeweiligen Referenzen 30 , 31 verwendet werden. Unveränderte PNA Monomere können von kommerziellen Quellen erworben werden. In jedem der Waschschritte, wird die entsprechende Menge des Lösungsmittels das Harz, bilden eine Gülle, bevor es weg abgelassen wird hinzugefügt

  1. Laden der ersten Monomer und verschließen die überschüssige freie primäre Amine auf das Harz
    1. wiegen 30 mg 4-Methylbenzhydrylamine-Hydrochlorid (MBHA·HCl) Polystyrol Harz (im Handel erhältlich; laden Wert 0,7-1,4 Mmol/g; Maschenweite 100-200), und die Übertragung auf eine 5 mL Festphasen-Peptid-Reaktionsgefäß mit Absperrhahn und Glas Stopper ausgestattet.
    2. Einweichen das Harz in einer entsprechenden Menge an DCM für 1 h, so dass das Harz zu Schwellen und entlarven die Amine (HCl-Salz).
      Hinweis: Harzkügelchen sollten immer vollständig untergetaucht werden im Lösungsmittel während der Synthese.
    3. Abfluss aus der DCM durch die Anwendung eines sanften Strom von trockenem Stickstoffgas oberhalb des Kolbens. Fügen Sie 1 mL von 50 % (V/V), N, N-Diisopropylethylamine (DIPEA) in DCM und lassen Sie es für 15 Minuten. Dies neutralisiert die HCl-Salz an die freien Amine auf dem Harz befestigt.
    4. Wiederholen Schritt 1.1.3. Unterdessen wiegen Sie 6 µmol Monomer und 6 µmol (Benzotriazol-1-Yl-oxy) Tripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate (PyBOP), und übertragen Sie in ein 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 200 µL Dimethylformamid (DMF) und 12 µmol DIPEA. Wirbel die Kupplung Lösung für ca. 3-5 min.
      Hinweis: Gewünschte laden verwendete Wert ist 0,2 Mmol/g. Die ersten Monomer hinzugefügt ist das Monomer auf die C-terminale der gewünschten PNA-Sequenz. Der Laden-Wert der ersten Aminosäure kann durch die Pikrinsäure Methode 46 berechnet werden.
    5. Abfluss aus der DIPEA von DCM Lösung. Waschen Sie das Harz mit DCM (x 3), gefolgt von DMF (x 3), und schließen Sie den Absperrhahn. Das Harz die vorbereitete Kupplung-Lösung hinzu und schütteln Sie sie leicht. Schieben Sie das Harz an den inneren Wänden des Schiffes in die Kupplung-Lösung mit dem Einsatz von einem sauberen Edelstahl-Spatel. Befestigen Sie den Glasstopfen und sichern das Schiff in einen Inkubator Shaker für 3 h bei 40 ° c
      Hinweis: Alternativ der Reaktionsbehälter gehalten werden kann stabil bei Raumtemperatur für ca. 6-8 h ermöglicht die Fertigstellung des Peptids Koppelung Reaktion.
    6. Bereiten die Deckelung Lösung durch Mischen von 240 µmol von Essigsäureanhydrid und 360 µmol von DIPEA in 200 µL des DCM. Die Kupplung Lösung ablaufen Sie und waschen Sie das Harz mit DMF (x 3) und DCM (x 3). Fügen Sie in die Deckelung Lösung und lassen Sie das Schiff für 30 min, gelegentlich schütteln das Schiff sanft. Deckelung die überschüssige freie primäres Amin Gruppen auf die Harze durch Acetylierung Masken.
    7. Wiederholen Schritt 1.1.6. Die Deckelung Lösung abtropfen und waschen Sie das Harz mit DCM (x 3).
    8. Eine kleine aliquoten Harz Perlen mit einer dünnen Kapillarrohr zu entfernen und legen Sie sie in ein kleines Glas-Fläschchen 1,5 mL. Führen Sie die Kaiser-Test- 43. Fügen Sie 15 µL der einzelnen Kaiser Testlösungen in das Glas Fläschchen und mit einer Heißluftpistole erhitzen. Beobachten Sie die Farbe der Perlen nach dem erhitzen. Die Farbe der Perlen sollten unverändert, unter Angabe des Mangels an freien Amin Gruppen auf das Harz.
      Hinweis: Der Kaiser-Test-Kit ist im Handel erhältlich oder kann nach dem gemeldeten Protokoll vorbereitet werden. Lösung A: Ninhydrin in Ethanol; Lösung B: Phenol in Ethanol; Lösung C: Kaliumcyanid (KCN) in Pyridin.
      Achtung: KCN ist hochgiftig; geeignete Schutzkleidung getragen werden sollte und Heizung sollten in einem gut gelüfteten Abzug bei fehlender brennbare Lösungsmittel oder Reagenzien durchgeführt werden.
    9. Wiederholen Sie Schritt 1.1.6 Wenn die Harzkügelchen blauen oder schwachen blauen Farbe anzuzeigen.
  2. Entfernung der N-terminalen Schutzgruppe Amin
    1. der Lösungsmittel aus den Reaktionsbehälter entleeren und fügen Sie eine Lösung von 50 % (V/V) des Trifluoroacetic Säure (TFA) in DCM, um sicherzustellen, dass die Harze vollständig untergetaucht sind. Verlassen Sie das Schiff für 15 min, gelegentlich schütteln, um die Deprotection Amin Gruppen zu erleichtern. 2 weitere Zyklen wiederholen.
      Achtung: TFA ist stark ätzend. Angemessene Schutzkleidung sollte beim Umgang mit getragen werden.
    2. Waschen des Harzes mit DCM (x 3), DMF (x 3) und DCM (x 3). Fügen Sie eine Lösung von 5 % DIPEA in DCM. Verlassen Sie das Schiff für 15 Minuten. Dieser Schritt aktiviert die freien Amine durch die Neutralisierung der TFA-Zähler-Anionen. Wiederholen Sie noch einmal.
    3. Spülen Sie die DIPEA aus der DCM-Lösung. Waschen Sie das Harz mit DCM (x 3). Führen Sie den Kaiser-Test (Schritt 1.1.8).
      Hinweis: Erfolgreiche Deprotection Amin Gruppen erbringt blaue Verfärbung der Perlen. Sobald Deprotection erfolgreich ist, kann spätere Kopplung von Monomeren durch Peptid Kopplung durchgeführt werden.
  3. Kopplung der nachfolgenden Monomere
    1. wiegen 18 µmol des gewünschten Monomer (für das Boc-PNA-Q-OH Monomer, 13,2 mg Monomer gewogen) und 18 µmol von PyBOP in einem 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 200 µL des DMF und 36 µmol von DIPEA in der 1,5 mL Tube. Wirbel, bis alle feste Bestandteile aufgelöst haben.
    2. Waschen des Harzes mit DMF (x 3). Fügen Sie die Kupplung-Lösung in den Reaktionsbehälter und schütteln Sie sie leicht. Schieben Sie das Harz an den inneren Wänden des Schiffes in die Kupplung-Lösung mit dem Einsatz von einem sauberen Edelstahl-Spatel. Befestigen Sie den Glasstopfen und sichern das Schiff in einen Inkubator Shaker für 3 h bei 40 ° c
    3. Abfluss aus der Kupplung-Lösung und Waschen des Harzes mit DMF (x 3) und DCM (x 3). Führen Sie Schritt 1.1.8. Wenn die Farbe der Perlen bleibt unverändert, wiederholen Sie Schritte 1.2.1-1.3.3, bis die gewünschte PNA-Sequenz abgeschlossen ist. Wenn blaue Verfärbung der Perlen nach der Paarung von einem Monomer beobachtet wird, wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.3. Wenn Verfärbung weiterhin besteht, führen Sie die Begrenzung wieder (Schritt 1.1.6).
      Hinweis: Erweiterte Kupplung Zeit (3-12 h) und/oder die Nutzung der überschüssigen Äquivalent von Monomer und Kupplung Reagenzien sind zu empfehlen bei mit Kupplung Problemen.
    4. Nach Abschluss die gewünschte PNA Reihenfolge Waschen des Harzes mit DMF (x 3) und DCM (x 3). Trocknen Sie vollständig das Harz durch einen kontinuierlichen Fluss von trockenem Stickstoffgas für 15 Minuten anwenden. Dieses trockene Harz aufgeteilt und Lysin oder fluoreszierende Tag wie z. B. Cyanin 3 (Cy3) und Carboxyfluorescein am N-Terminus der PNA befestigt werden kann.
  4. Anlage von Lysin oder Leuchtstoff-Tag (Cy3, Cy5, oder Carboxyfluorescein) an den N-Terminus von PNA
    1. wiegen 10 mg des Harzes, vorab mit der gewünschten PNA Reihenfolge geladen. In einem 5 mL Reaktionsgefäß übertragen. Genießen Sie das Harz in DCM für 1 h.
    2. Für die Befestigung von Lysin, führen Sie Schritte 1.2.1-1.3.3, ersetzt das Monomer mit entweder Boc-Lys (Z) - OH oder Fmoc-Lys (Boc) - OH.
    3. Für die Befestigung der Carboxyfluorescein, führen Sie Schritte 1.2.1-1.3.3, mit 10-divisibel Überschuss an 5 6-Carboxyfluorescein als das Monomer und N, N '-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) und Hydroxybenzotriazole (HOBt) als die Koppelung Reagenzien in DMF. Lassen Sie die Kupplung Reaktion über Nacht in den Inkubator Shaker bei 40 ° c
      Hinweis: Da Carboxyfluorescein lichtempfindlich ist, der Reaktionsbehälter sollten abgedeckt werden mit Aluminiumfolie.
    4. Für die Befestigung der Cy3 oder Cy5 Farbstoff, Label von der Click-Chemie-Methode, führen Sie Schritte 1.2.1-1.3.3, das Monomer durch N-Boc-2-propargyl-L-glycine zu ersetzen. Das functionalizes der N-Terminus der PNA mit einer Gruppe von Alkinen. Führen Sie die Kupfer-katalysierte Klick Reaktion um die Azid-haltigen Cy3 anzuhängen oder Cy5 fluoreszierenden Farbstoff 12 , 47 , 48 , 49
  5. PNA Spaltung von solide Unterstützung, Reinigung und Charakterisierung
    Hinweis: Wenn Amingruppe mit der Fmoc Gruppe Schutz geschützt ist, zuerst deprotect der Amingruppe durch die Behandlung mit 20 % Piperdine in DMF Lösung für 15 min. (2 Zyklen). Das Harz mit DMF (x 3) gefolgt von DCM (x 3) gründlich zu waschen. Trocknen Sie das Harz vollständig durch die Anwendung eines kontinuierlichen Fluss von trockenem Stickstoffgas für 15 min.
    1. Übertragen 5 mg trocken Harz in ein kleines Fläschchen. Fügen Sie 10 µL des Thioanisole und 4 µL 1,2-Ethanedithiol, um sicherzustellen, dass das Harz in die Reagenzien untergetaucht ist. Lassen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 5 min.
      Hinweis: Diese Reagenzien fungieren als Radikalfänger, die reaktive kationischen Spezies zu fangen, die bei der Demontage der Gruppen in der PNA zu schützen gebildet werden. Geeignete Radikalfänger können anhand der Seitenkette schützen Gruppen gewählt werden.
    2. Hinzufügen 100 µL von TFA in das Rohr mit dem Harz und Radikalfänger. Sanft Wirbel die Mischung und je nach kurzen Zentrifugation. Lassen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 10 min.
      Achtung: TFA ist stark ätzend. Angemessene Schutzkleidung sollte beim Umgang mit getragen werden.
    3. Hat das Rohr sorgfältig 20 µL der Trifluoromethanesulfonic Säure (TFMSA) hinzufügen. Schütteln Sie sanft das Reaktionsgemisch vor kurzen Zentrifugation bei Raumtemperatur zu unterwerfen. Lassen die Röhre stabil bei Raumtemperatur für 2 h
      Achtung: TFMSA ist stark ätzend. Angemessene Schutzkleidung sollte beim Umgang mit getragen werden.
    4. Filter aus der Spaltung cocktail in einer 5 mL Rundboden Kolben (RBF) mit dem Einsatz eines Glases Pasteur Pipette mit Baumwolle ausgestattet. Verwenden Sie eine kleine Menge von TFA das Harz zu waschen.
    5. Bereinigen trockenem Stickstoffgas, das gesammelte Filtrat bis alle flüchtigen Lösungsmittel verdunstet sind. Fügen Sie 1 mL kalte Diethylether in der RBF.
      Hinweis: Die Diethylether bewirkt die PNA ausgefällt.
      1. Spülen die RBF mit der Diethyl Ether mehrmals vor der Übertragung der trüben Lösung in einem 1,5 mL-Tube. Thema das Röhrchen Zentrifugation erlauben den PNA Niederschlag zu begleichen. Dekantieren Sie der Lösungsmittel und der Niederschlag fügen Sie 300-500 µL autoklaviert Wasser hinzu. Wirbel die PNA gründlich aufzulösen.
    6. Reinigen die grobe PNA-Probe über RP-HPLC mit water-acetonitrile-0.1% TFA als der mobilen Phase. Die entsprechenden Anteile zu sammeln, alle Lösungsmittel mit einem Vakuum Konzentrator bevor wieder auflösen der gereinigten PNA im Autoklaven Wasser verdampfen.
    7. Charakterisieren die gereinigte PNA über MALDI-TOF-Analyse mit dem Einsatz von α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA) als Kristallisation Probenmatrix.
    8. Messen die UV-Absorption (260 nm) der PNA bei 65 ° C. berechnen die Konzentration der PNA mit der Gleichung:
      Equation 1
      Hinweis: Hier ist c die Konzentration, A ist die Extinktion Lesung erhalten ε ist vom Aussterben bedroht-Koeffizient der RNA-Sequenz und l ist die optische Weglänge von der Küvette (1 cm). die vom Aussterben bedroht-Koeffizient der PNA-Sequenz ist die Summierung des Aussterbens Koeffizienten der einzelnen Monomere 50. Die vom Aussterben bedroht-Koeffizienten von Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin sind 15,4, 7.3, 11,7 und 8,8 mL/µmol·cm, beziehungsweise. Die vom Aussterben bedroht-Koeffizient der L und Q Monomere verwendet wird angenommen, dass identisch mit der base Cytosin (C).

2. Non-Denaturierung Seite

  1. Vorbereitung der erforderlichen Pufferlösungen
    1. bereiten Inkubation Puffer (10 mL) mit 116,88 mg NaCl (200 mM), 50 µL 100 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (0,5 mM), 200 µL 1 M Lager HEPES (20 mM), 9,75 m H 2 O; Stellen Sie Puffer pH 7,5.
    2. Vorbereiten 1 x Tris-Borat-EDTA (TBE) laufenden Puffer (1 L) mit 100 mL 10 x Tris-Borat-EDTA bei pH 8,3 und 900 mL H 2 O.
    3. Vorbereitung 10 % Ammonium Bleichen (APS) Lösung (300 µL) Verwendung von 30 mg Ammonium Bleichen, und 300 µL H 2 O.
  2. Vorbereitung von 12 % Polyacrylamid-Gel
    1. Reinigen gut umformen Kamm, Casting Glasplatten und Spacer mit Ethanol; gut umformen Kamm und Abstandhalter sind 1 mm dick. Richten Sie die Gel-Versammlung und mit Gel-Versiegelung Klebeband abdichten.
    2. Für ein Polyacrylamid-Gel von 22 x 16,5 cm x 1 mm Maß, 50 mL Gel-Lösung ist ausreichend. Wiegen Sie 5,7 g Acrylamid und 0,3 g N, N '-Methylenebisacrylamide (19:1) und Überführung in eine Zentrifuge 50 mL tube.
      Achtung: Acrylamid ist krebserregend. Einatmen von Staub Dämpfe von Acrylamid zu vermeiden und sicherzustellen, dass angemessene Schutzkleidung getragen wird, beim Umgang mit.
    3. Lösen sich feste Verbindungen in 50 mL 1 X TBE laufenden Puffer indem man die Zentrifugenröhrchen in ein Wasserbad von 50 ° C für 15 Minuten oder bis alle feste Bestandteile aufgelöst haben. Führen Sie durch Zentrifugation (3.000 u/min, 5 min, 25 ° C), um alle Luftblasen innerhalb der Lösung zu entfernen. Die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    4. 250 µL 10 % APS-Lösung und 50 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) in die Gel-Lösung hinzufügen und vorsichtig mit einem Spatel mischen. Gießen Sie sofort die Lösung zwischen den Glasplatten, sicherstellen, dass keine Luftblasen nicht einzuführen. Legen Sie die gut umformen Kamm und lassen das Gel-Setup bei Raumtemperatur für mindestens 60 min. erlauben Polymerisation auftreten vor der Lagerung bei 4 ° C bis zum Gebrauch,.
  3. Vorbereitung der Proben
    1. benötigte Menge an RNA Haarnadel (1 µM) aus dem Hauptlager in ein sauberes 1,5 mL Röhrchen zu entfernen. Trocknen der RNA-Lösung mit einem Vakuum Konzentrator.
      Hinweis: Jede Probe enthält 1 µM RNA in 20 µL Inkubation Puffer. In der Regel sind 13 Proben von RNA vorbereitet, für eine Seite experimentieren. Die RNA für alle Proben bereiteten gemeinsam in einer einzigen Röhre.
    2. Entfernen die erforderlichen Mengen an gezielte PNA (mit die Endkonzentration von bis zu 50 µM) vom Hauptlager und Transfer in separate 1,5 mL Röhrchen. Verdunstet das Wasser von den PNA-Lösungen mit einem Vakuum Konzentrator.
    3. Fügen Sie 260 µL Puffer Inkubation in 1,5 mL Tube mit RNA und Mischung gründlich, um sicherzustellen, dass alle RNA Diss ist getrocknetOlved. Vorbehaltlich die RNA um Kühlung zu fangen: Ort die Röhre in einem Heizblock (bis 95 ° C vorgewärmt) für 5 min. sofort übertragen in ein Eisbad und lassen für 10 min.
    4. Fügen Sie 20 µL RNA in jeweils 1,5 mL Röhrchen mit PNA und Mischung gründlich getrocknet. Führen Sie glühen: Legen Sie das Rohr mit RNA-PNA-Gemisch in einem Heizblock (vorgeheizt auf 65 ° C) für 10 min. Turn Ausschalten der Heizblock und ließ die Proben kühl langsam auf Raumtemperatur. Die Proben bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
  4. Laufen und Verarbeitung von Gel
    1. Entfernen Sie das Gel-Versiegelung-Klebeband auf der Unterseite der Glasplatte. Befestigen und sichern die Glasplatte auf dem vertikalen Gel-Ständer mit Kunststoffhalterungen.
      Hinweis: Das Gel läuft in einem kalten Raum bei ca. 4 ° c erfolgt Ausrüstung, Proben und Puffer sind bei 4 ° C gekühlt, vor dem Ausführen der Gel.
    2. Den unteren Puffer Tank mit 1 X TBE laufenden Puffer füllen, bis die Platte in ca. 1-2 cm der laufenden Puffer untergetaucht ist. Füllen Sie das obere Puffer mit Puffer ausgeführt, bis der Puffer oben auf das Gel von 1-2 cm. langsam überschreitet und entfernen Sie vorsichtig die gut umformen Kamm, so dass die laufenden Puffer um den Brunnen zu füllen.
    3. Gel Stand an ein Netzteil anschließen. Pre-führen Sie das Gel für mindestens 30 min mit einer konstanten Spannung von 250 V, die für ein 22 x 16,5 cm x 1 mm Gel optimiert ist.
    4. Unterdessen jedes der Beispiele 4 µL (20 % der Stichprobe) 35 % Glycerin-Lösung hinzufügen und vorsichtig mischen. Nach Abschluss der Vorlauf laden 20 µL jeder Probe (einschließlich einer RNA allein Probe plus Proben mit RNA-PNA-Gemisch) vorsichtig in den unteren Teil der nun mit einer Mikropipette und gel laden Tipps, sicherstellen, dass keine Luftblasen nicht einzuführen. Führen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung von 250 V, ähnlich wie der Vorlauf für 5 h
    5. Die Stromversorgung zu stoppen, nach 5 h und die Glasplatte vom Stand zu entfernen. Entfernen Sie das restliche Gel-Versiegelung-Band und zerlegen Sie die Glasplatte zu. Sanft zu entfernen und das Gel in einen Behälter gefüllt mit 350 mL entionisiertem Wasser tauchen. Sorgfältig hinzufügen 35 µL Interkalation Bromid (10 mg/mL) und stellen Sie den Behälter auf eine Plattform Shaker (niedrige Geschwindigkeit) für 30 min.
      Achtung: Interkalation Bromid ist ein Mutagen. Angemessene Schutzkleidung sollte beim Umgang mit getragen werden.
    6. Die Interkalation-Bromid-Lösung in einen dafür vorgesehenen Abfallbehälter zu entsorgen. Spülen Sie das Gel mit 1,5-2 L destilliertes Wasser. Scannen Sie das Gel mit einem Imager (siehe Tabelle der Materialien) mit einem grünen Laser 532 nm und die Emission filter festgelegt bei 610 nm.
  5. Gel Analyse
    1. quantifizieren die Gel-Band-Intensitäten mit einer kostenlosen Software, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Die Band Intensitäten nach zu normalisieren:
      Equation 2
      Hinweis: hier ich duplex Max ist die Band Intensität der RNA Haarnadel allein ohne den Zusatz von PNA und ich Triplex Max ist die Intensität der triplex-Band mit der höchsten Konzentration von PNA hinzugefügt.
      1. Berechnen den Bruchteil der triplex Formation:
        Equation 3
    2. Handlung der Bruchteil der triplex Bildung (Y) gegen die Konzentration der PNA hinzugefügt () ΜM). Passen die Daten auf die Gleichung, die Dissoziationskonstante (K d) zu erhalten:
      Equation 4
      Hinweis: hier R 0 ist die RNA-Haarnadel-Konzentration (1 µM). Hier sind Y 0 B die Anfangs- und die maximale Änderung der triplex-Fraktion bzw.. Y ist der Anteil von Triplex mit abwechslungsreichen PNA-Konzentration. X ist die Gesamtkonzentration von PNA und K d ist die Dissoziationskonstante.

3. 2-Aminopurine Fluoreszenz Bindung Assay

  1. Vorbereitung der Proben (DsRNA)
    1. Entfernen Sie die benötigte Menge an 2-Aminopurine (2AP) mit der Bezeichnung DsRNA (1 µM für jeden Strang) aus dem Hauptlager in eine saubere 1,5 mL-Tube. Verdunsten von Wasser in den RNA-Lösungen mit einem Vakuum Konzentrator.
      Hinweis: Jede Probe enthält 1 µM RNA in 75 µL Inkubation Puffer. In der Regel sind 13 Proben von RNA vorbereitet. RNA für alle Proben bereiteten gemeinsam in einer einzigen Röhre.
    2. Entfernen Sie die geforderten Mengen der gezielten PNA für verschiedene Konzentrationen vom Hauptlager und Transfer in separate 1,5 mL Röhrchen. Verdunstet das Wasser von den PNA-Lösungen mit einem Vakuum Konzentrator.
    3. Hinzufügen 975 µL Puffer Inkubation in 1,5 mL Tube mit getrockneten RNA und Mischung gründlich, um sicherzustellen, dass alle RNA aufgelöst wird. Die RNA-Lösung kurz Zentrifugieren und unterziehen es glühen: Legen Sie das Rohr in einem Heizblock (bis 95 ° C vorgewärmt) für 10 min. Turn Ausschalten der Heizblock und ließ die Proben kühl langsam auf Raumtemperatur.
    4. Fügen Sie 75 µL RNA in jeweils 1,5 mL Röhrchen mit PNA und Mischung gründlich getrocknet. Lassen Sie den Proben bei Raumtemperatur für mindestens 1 h Inkubation die Proben bei 4 ° C über Nacht.
  2. Vorbereitung der Proben (SsRNA)
    1. benötigte Menge an 2AP beschriftet SsRNA (1 µM) aus dem Hauptlager in sauberen 1,5 mL Röhrchen zu entfernen. Extrahieren Sie die geforderten Mengen von gezielten PNA für verschiedene Konzentrationen vom Hauptlager und Transfer in die jeweiligen 1,5 mL-Röhrchen, die den SsRNA enthalten. Trocknen Sie die RNA-PNA-Mischung mit einem Vakuum Konzentrator.
    2. Fügen Sie 75 µL der Inkubation in jedes der Rohre 1,5 mL Puffer und gründlich mischen. Unterziehen Sie die Mischung zu glühen: Legen Sie das Rohr in einem Heizblock (bis 95 ° C vorgewärmt) für 10 min. Drehen Sie die Macht und die Proben langsam auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Proben bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
  3. Messung und Analyse
    1. verwenden ein Fluoreszenz-Spektralphotometer, um die Emission in einem Wellenlängenbereich von 330-550 nm zu messen. Verwenden eine Anregung Wellenlänge von 303 nm.
      Hinweis: Die Proben bei Raumtemperatur gemessen werden und jede Probe wird 3 Mal gemessen, in denen ist der Durchschnitt ermittelt.
    2. Transfer 70 µL der Inkubation Puffer in die 1 cm quadratisch Küvette. Starten Sie die Messung.
    3. Entfernen Sie den Puffer aus der Küvette. Die Küvette mit destilliertem Wasser spülen und Säuberung Stickstoffgas zu trocknen. Wiederholen Sie für alle Proben. Subtrahieren Sie die Puffer-Messungen von allen Proben.
    4. Plotten der Fluoreszenzintensität (AE) gegen die Wellenlänge (nm). Aufzeichnen der Fluoreszenzintensität 370 nm für alle Proben. Plot der Fluoreszenzintensität 370 nm (AE) gegen die entsprechende Konzentration der PNA hinzugefügt (µM).
    5. Passen die Daten auf die Gleichung aus Schritt 2.5.2 Dissoziationskonstante (K d) zu erhalten: Y = Y 0 + (B / (2R 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), wobei R 0 2AP beschriftet DsRNA-Konzentration (1 µM) ist.
      Hinweis: Hier Y 0 und B sind die aus- und maximale Änderung der Fluoreszenzintensität 370 nm, beziehungsweise. Y ist die Fluoreszenzintensität auf 370 nm bei abwechslungsreichen PNA-Konzentration. X ist die Gesamtkonzentration von PNA und K d ist die Dissoziationskonstante.

4. UV-Absorption-erkannt thermische schmelzen Experimente

  1. Vorbereitung der Proben
    Hinweis: Messen Sie die UV-Absorption (260 nm) der RNA bei 95 ° C (um sicherzustellen, dass die RNA-Sekundärstrukturen gestört). Berechnen Sie die Konzentration der RNA mit der Gleichung:
    Equation 5
    ​ wobei c die Konzentration, A ist die Extinktion Lesung gewonnen, ε ist der Koeffizient vom Aussterben bedroht die RNA-Sequenz und l ist die optische Weglänge von der Küvette (1 cm). Die vom Aussterben bedroht-Koeffizient der RNA errechnet sich ein nächster-Nachbar-Modell mit MeltWin 51 , 52. Das Programmpaket kann auf Anfrage bereitgestellt werden.
    1. Entfernen Sie die benötigte Menge an SsRNA (5 µM) aus dem Hauptlager in sauberen 1,5 mL Röhrchen. Entfernen Sie die geforderten Mengen von gezielten PNA (5 µM) vom Hauptlager und Transfer in die jeweiligen 1,5 mL-Röhrchen, die den SsRNA enthalten. Trocknen Sie die RNA-PNA-Mischung mit einem Vakuum Konzentrator.
    2. Fügen Sie 130 µL der Inkubation in jedes der Rohre 1,5 mL Puffer und gründlich mischen. Unterziehen Sie die Mischung zu glühen: Legen Sie das Rohr in einem Heizblock (bis 95 ° C vorgewärmt) für 10 min. Drehen Sie die Macht und die Proben langsam auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Proben bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
  2. Messung und Analyse
    1. Verwendung eines UV-Vis Spektralphotometer zur Messung der Absorption bei 260 nm mit einer 8-Microcell-Küvette mit einer Weglänge von 1 cm. Messen Sie die Proben ' Absorptionswerte bei steigender Temperatur von 15 bis 95 ° C, gefolgt von abnehmender Temperatur von 95 bis 15 ° C mit einer Rampe Rate von 0,5 ° C/min.
    2. Transfer 130 µL der Probe in jede des Brunnens, um sicherzustellen, dass man gut die Inkubation Puffer enthält. Starten Sie die Messung. Je nach Bedarf wiederholen.
    3. Normalisieren die Extinktion-Werte mit der hohen Temperatur normalisierte Einheit lesen und zeichnen die normalisierten Extinktion gegen Temperatur (° C) zu lesen. Plotten Sie die erste Ableitung der Kurven. Die Schmelztemperaturen durch den Einbau der ersten derivativen Kurven einer Gaußschen Funktion erhalten.

Representative Results

Reverse-Phase-HPLC ermöglicht die Reinigung von PNA Oligomere. Wir erhalten reine PNA Oligomere mit zwei Runden der HPLC-Reinigung (Abbildung 3). Die Identität des PNAs kann durch MALDI-TOF-Analyse (Abbildung 4) bestätigt werden.

Non-Denaturierung Seite ist eine einfache und informative Technik zur Charakterisierung der verbindlichen Affinitäten und Besonderheiten der PNA Oligomere. Wir verwenden in der Regel mehrere RNA Haarnadeln oder Maisonetten mit einzigen Basenpaar Mutationen Bindeeigenschaften (Abbildung 5) zu charakterisieren. Die nicht Denaturierung Seitendaten in Abbildung 5 dargestellten vorschlagen deutlich, dass die Q - und L-modifizierte PNA eine DsRNA-Region mit einem C-G-paar (Abbildung 5B, Bodenplatte) erkennen kann aber keiner ohne ein C-G-paar (Abbildung 5B, top Panel). Diese besondere und verbesserte Anerkennung ist durch die T· A-U, L· G-C und an C-G PNA· RNS2 base Triple (Abbildung 1A, C, D) Bildung. Verschiedene PNAs mit einzelnen oder mehreren Mutationen können auch verwendet werden, die verbesserten Bindungseigenschaften von einem modifizierten PNA zu demonstrieren. Wir haben gezeigt, dass 2 mM Mg2 + in der Inkubation Puffer hinzufügen die Bindung nicht beeinflusst erheblich31.

Wir haben 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration zeigen, die eine Q und L geändert PNA an eine gezielte DsRNA Region (Abbildung 6A, 6 C, 6D) aber nicht SsRNA (Abbildung 6B, 6E, 6F bindet). PNA P3 bindet an die 2-Aminopurine-Label DsRNA mit einem K-d -Wert von 0,8 ± 0,1 µM. Die Fluoreszenzintensität auf 370 nm für die 2-Aminopurine-Label SsRNA bleibt relativ konstant mit abwechslungsreichen P3-Konzentration, zeigt den Mangel an Bindung von PNA P3 an der SsRNA.

PNAs mit Q Rückstände (P2 und P3) zeigen keine thermische Übergänge (Abbildung 7), schlägt keine Bindung an die SsRNA schmelzen. Dies ist aufgrund der sterischen Zusammenstoß in Watson-Crick wie Q-G paar vorhanden. Im Vergleich zu unveränderten PNA P1, PNAs P4 und P5 mit geändert L Rückstände aber keine Q-Rückstände, Show sank Schmelztemperaturen für die entsprechenden RNA-PNA-Maisonetten aufgrund der sterischen Zusammenstoß in Watson-Crick wie L-G paar vorhanden. Die UV-Absorption-erkannt schmelzenden Temperaturdaten sind konsistent mit den 2-Aminopurine Fluoreszenz-Titration-Daten, die auch zeigen, dass ein PNA mit Q und L Rückstände nicht merklich zu SsRNA bindet (Abbildung 6B, 6E, 6F). Einbindung der Q-Base ist mehr als eine L-Basis, destabilisierenden, wie eine Q-Base einen bedeutenderen sterischen Zusammenstoß bei der Bildung der Watson-Crick-wie Q-G zwei (Abbildung 1F hat) im Vergleich zu ein paar Watson-Crick-wie L-G (Abbildung 1E ).

Figure 1
Abbildung 1 : Chemische Strukturen der stabilen Basis Dreibett- und instabilen Basenpaar Strukturen. (A-D) Major-Nut PNA· RNS2 base verdreifacht sich der T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) und an C-G (D). (E, F) Instabile Watson-Crick wie PNA-RNA Basenpaare des L-G (E) und Q-G (F). Der Buchstabe R steht das Zucker-Phosphat-Rückgrat der RNA. Wasserstoffbrücken sind durch schwarz gestrichelte Linien angezeigt. Die Figur ist aus Referenz31abgebildet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Chemische Strukturen von PNA Monomere. Vier PNA Monomere (T, C, L und Q) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Chemische Struktur von einem PNA Oligomer und Reinigung mittels RP-HPLC. (A) chemische Struktur der PNA Sequenz P3. (B, C) RP-HPLC-Daten von Rohöl PNA P3 (B) und wieder gereinigt PNA P3 (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : MALDI-TOF-Spektrum der gereinigten PNA P3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : RNA-Haarnadel und PNA-Sequenzen und verbindliche Charakterisierung nicht Denaturierung seitenweise. (A) RNA Haarnadeln (rHP1 und rHP2), PNA P3 und eine PNA· RNS2 triplex zwischen PNA P3 und rHP2 gebildet. (B) nicht-Denaturierung Seite (12 %) ergibt sich für rHP1 und rHP2 Bindung an PNA P3. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. Die geladenen RNA Haarnadeln (rHP1 und rHP2) sind bei 1 µM in 20 µL. Die PNA-Konzentrationen in Bahnen von links nach rechts sind 0, 0,2, 0,4, 1, 1,6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, und 50 µM. PNA P3 bindet nicht an rHP1 (Oberseite) aber bindet an rHP2 (Bodenplatte). (C) Kd Bestimmung für P3 Bindung an rHP2. Der Anteil der triplex Bildung (Y) war gegen die PNA-Konzentration aufgetragen. Die Figur ist aus Referenz31angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Fluoreszenz Titration Studie der PNA P3 Bindungzu 2 Aminopurine beschriftet RNAs. Der 2-Aminopurine Rückstand wird als "2" in der RNA-Sequenz bezeichnet. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) eine PNA· RNS2 triplex zwischen P3 und eine 2-Aminopurine-Label DsRNA (dsRNA2-2AP) gebildet. (B) ein hypothetisches PNA-RNA Maisonette zwischen P3 und eine 2-Aminopurine-mit der Bezeichnung SsRNA (ssRNA2-2AP) gebildet. (C, E) Fluoreszenz-Emissionsspektren für die 2-Aminopurine-Label RNA duplex (1 µM) und SsRNA (1 µM), abwechslungsreich, bzw. mit P3-Konzentration bei pH 7,5. Der Peak bei etwa 475 nm ist durch die schwache Fluoreszenzemission von der L-Basis in der PNA. (D, F) K d Bestimmung basiert auf den Grundstücken der Fluoreszenzintensität 2-Aminopurine (370 nm) des RNA-Duplex und SsRNA, bzw. im Vergleich zu PNA P3 Konzentration. Die Figur ist aus Referenz31angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Thermische schmelzen Ergebnisse für RNA-PNA Maisonetten. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Alle Proben enthalten 5 µM einsträngige RNA (ssRNA1) und PNA in 130 µL. (A) Single-Stranded RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 und P5) und eine hypothetische PNA-RNA-Maisonette zwischen PNA P3 und ssRNA1 in einer parallelen Ausrichtung gebildet. Die sterische Zusammenstoß ist für die Watson-Crick wie Q-G und L-G-Paare angegeben. (B) Melting Kurven für verschiedene PNAs Bindung an ssRNA1. Die Schmelztemperaturen werden für die Kurven mit schmelzender Übergänge angezeigt. Die Figur ist aus Referenz31angepasst.

Discussion

RNA Duplex-Bindung PNA Oligomere (z.B. 10-Mers) sind Moleküle, die mittlere und somit können zeigen elektrophoretische Mobilität Verschiebung auf verbindliche RNAs mit einer vergleichbar oder etwas größeren Größe (z. B., 50-Mer oder kleiner). Wenn eine RNA deutlich größer als die PNA ist, Titration von PNA in RNA funktioniert möglicherweise nicht aufgrund einer begrenzten Gel-Mobilität-Verschiebung. So kann die großen RNA für die nicht-Denaturierung Seite Assays abgeschnitten werden. Titration von eine große RNA in einem Fluorophore beschriftet PNA ermöglicht die Überwachung der triplex Bildung durch ein nicht denaturierenden Agarosegel mit der Probe in der Mitte der Gel40geladen.

Für eine Titration Experiment nicht Denaturierung seitenweise mit konstanter Gesamtkonzentration von RNS verwenden wir in der Regel eine unbeschriftete RNA-Konzentration von 1 µM für effiziente Post Färbung freie RNA und triplex Bands durch Interkalation Bromid. Eine RNA-Konzentration so niedrig wie 0,2 µM kann auch abhängig von der RNA Konstrukt31ausreichen. Die Konzentration der unbeschrifteten RNA (0,2 µM) bestimmt, dass die K-d -Werte, die genau gemessen werden können über 0,2 µM oder größer sein sollte. Andere Färbung Farbstoffe können verwendet werden, um die Färbung Effizienz zu erhöhen. Alternativ zufolge unsere unveröffentlichten Daten Cy3 Farbstoff-markierten RNAs in nicht Denaturierung Seite Experimente verwendet werden können, um die feste Bindung Ereignisse zu messen.

Die 2-Aminopurine nur mäßig Leuchtstoff ist, ist 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration auch beschränkt sich auf die Messung der Bindung mit K-d -Werte nahe oder über 0,2 µM31. Die RNA oder PNA kann mit einem relativ hellen Farbstoff zur Quantifizierung eine relativ enge Bindung in Lösung durch Fluoreszenz Titration, wenn die Bindung ergibt sich Änderungen in der Fluoreszenz Signale53,54, beschriftet werden 55.

Die Strategie des Zielens RNA-Strukturen durch DsRNA-Bindung PNAs wurde für eine begrenzte Anzahl von RNAs getestet. Es ist wahrscheinlich, dass bindende Eigenschaften für DsRNAs mit verschiedenen Sequenzen und Basenpaar Kompositionen variieren kann. Man kann immer die Purin-reiche Strang eines Duplex für die Gestaltung der TFPNAs wählen. Es ist wichtig zu verstehen, wie in Folge an C-G-Tripel können die Stabilität der ein Triplex beeinträchtigen. Umfangreichere Studien der reihenfolgeabhängigen sind klar zu verstehen, die reihenfolgeabhängigen Bindungseigenschaften des TFPNAs erforderlich.

Die Bindungsaffinität des TFPNAs kann durch Erhöhung der Länge und/oder weitere Basen und Backbones56,57 des TFPNAs ändern weiter gesteigert werden. Allerdings kann eine kontinuierliche duplex Region nicht oft von mehr als 10 aufeinanderfolgenden Basenpaaren ohne Störung durch nicht-Watson-Crick-Strukturen bestehen. Man kann TFPNAs mit kleinen Molekülen für die Anerkennung von nicht-Watson-Crick-Strukturen an DsRNA Regionen angrenzenden konjugieren. Im Prinzip soll ein TFPNA kleines Molekül Konjugat Bindungsaffinität und Spezifität im Vergleich zu einer TFPNA oder kleines Molekül allein verbessert haben. Jedoch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Linkers für die Konjugation58,59,60,61,62,63,64 muss optimiert werden.

Die Tatsache, dass TFPNAs selektiv, um DsRNAs über SsRNAs binden können und DsDNAs deutet darauf hin, dass es möglich ist, TFPNAs zu entwickeln, als sehr nützlich chemische Sonden und mögliche therapeutische Liganden durch die Regulierung der RNA Strukturdynamik und Interaktionen mit Proteinen und Metaboliten. Zelluläre Aufnahme von TFPNAs kann erleichtert werden, durch die Konjugation mit Zelle eindringen Moieties wie kleinen Molekülen, Peptiden, und Nanopartikel oder Komplexierung mit supramolekularen Strukturen wie Liposomen5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Weiter kann Funktionalisierung von TFPNAs mit Bioimaging Tags wie Fluorophore und Radioisotopen die Erkennung, imaging und Ausrichtung der funktionalen RNA-Strukturen in lebenden Organismen erleichtern.

Disclosures

Eine Patentanmeldung (PAT/179/14/15/PCT) basiert auf der Arbeit hier berichtet wurde eingereicht.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Singapore Ministry of Education (MOE) Stufe 1 (RGT3/13 und RG42/15, g.c.) und MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 und MOE2015-T2-1-028, g.c.) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3 (2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3 (2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8 (2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139 (2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

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Genetik Ausgabe 127 PNA triplex RNA-Struktur RNA Duplex RNA-bindende Liganden Festphasen-Peptidsynthese Denaturierung-Seite 2-Aminopurine UV thermische schmelzen molekulare Erkennung Bindungsaffinität große Nut
Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren
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Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).

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