Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Sekvens-specifika och selektiv erkännande av dubbelsträngat RNA över enkelsträngat RNA av kemiskt modifierade peptid nukleinsyror

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

Vi rapporterar protokollen för syntesen och rening av peptid nukleinsyra (PNA) oligomerer införliva ändrades rester. De biokemiska och biofysikaliska metoderna för karakterisering av erkännande av RNA duplex av de modifierade PNAs beskrivs.

Abstract

RNAs växer fram som viktiga biomarkörer och terapeutiska mål. Således finns det stor potential i att utveckla kemiska sonder och terapeutiska ligander för erkännande av RNA-sekvens och struktur. Kemiskt modifierade peptid nukleinsyra (PNA) oligomerer har nyligen framtagits som kan känna igen RNA duplex i en sekvens-specifika sätt. PNAs är kemiskt stabila med en neutral peptid-liknande ryggrad. PNAs kan syntetiseras relativt enkelt av den manuella Boc-kemi fasta fas peptid syntes metoden. PNAs renas genom HPLC med omvänd fas, följt av molekylvikt karakterisering av matrix-assisted laser desorption och jonisering-tid för flygning (MALDI-TOF). Icke-denatureringen Polyakrylamidgelen elektrofores (sidan) teknik underlättar bildtagning av triplex-formationen, eftersom noggrant utformade gratis RNA duplex konstruerar och PNA bunden etage ofta visa olika migration priser. Icke-denatureringen sida med etidiumbromid bromid post färgning är ofta en enkel och informativ teknik för att karaktärisera den bindande samhörighet och särdrag av PNA oligomerer. Vanligtvis kan flera RNA hårnålar eller etagevåningar med enda baspar mutationer användas att karakterisera PNA bindande egenskaper, till exempel bindande samhörighet och särdrag. 2-Aminopurine är en isomer av adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescensintensiteten är känslig för närmiljön strukturella förändringar, och är lämplig för övervakning av triplex bildandet med 2-aminopurine återstoden införlivas nära PNA bindningsstället. 2-Aminopurine fluorescens titrering kan också användas för att bekräfta bindande selektivitet modifierade PNAs mot riktade dubbelsträngat RNA (dsRNAs) över enkelsträngat RNA (ssRNAs). UV-absorbans-upptäckt termiska smälttemperatur experiment tillåta mätning av termisk stabilitet PNA-RNA duplex och PNA· RNA2 etage. Här beskriver vi syntesen och rening av PNA oligomerer införliva ändras rester och beskriva biokemiska och biofysikaliska metoder för karakterisering av erkännande av RNA duplex av de modifierade PNAs.

Introduction

RNAs växer fram som viktiga biomarkörer och terapeutiska mål, på grund av de senaste framstegen inom upptäckter av RNASEN roller i förordningen och katalys av olika biologiska processer1,2,3. Traditionellt, har antisense trådar använts för att binda till ssRNAs till Watson-Crick duplex bildandet3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. nyligen, triplex-bilda peptid nukleinsyror (TFPNAs) har utformats för att binda till dsRNAs via Hoogsteen vätebindningen (figur 1)3,28,29. dsRNA regioner är närvarande i flesta traditionella antisense-riktade RNASEN, inklusive pre-mRNA och mRNA, före eller pri-MicroRNA3, och många andra icke-kodande RNAs1,26,27. Inriktning dsRNAs genom Trippel helix formation med hjälp av TFPNAs kan vara fördelaktigt på grund av dess struktur särart och är av stor potential för användning i att återställa normala funktioner av RNASEN, som är dysreglerad i sjukdomar, till exempel.

Den nyligen publicerade arbete av Rozners et al., och oss3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, rapporterade ansträngningar på att förbättra selektiva bindningen av modifierade TFPNAs mot dsRNAs med förbättrad affinitet. Vi har utvecklat syntesmetoder för rationellt designade PNA monomerer (figur 2) inklusive thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 och guanidin-modifierad 5-metyl cytosin (Q) monomer31. Genom olika biokemiska och biofysiska karakterisering metoder, har vi visat att relativt kort PNAs (6-10 rester) införliva L och Q rester visar förbättrad erkännande av Watson-Crick G-C och C-G baspar, respektive i dsRNAs. Jämfört med oförändrad PNAs, visar PNAs innehållande L och Q rester dessutom mer selektiv bindning mot dsRNA över ssRNA och dsDNA. De guanidin funktionalitet42 i Q basen gör PNAs ange HeLa celler31.

I vårt laboratorium, vi syntetisera PNAs av manuell Boc-kemi (Boc eller t- Boc står för tert-butyloxycarbony (se figur 2) fasta fasen peptid syntes metod4. Syntesen av PNA monomeren med Boc som den aminen skydda gruppen är bekvämt eftersom gruppen Boc är koalisera mindre skrymmande jämfört med fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amine skydda gruppen, vilket kan vara fördelaktigt under PNA monomer koppling den fast stöd. Boc gruppen är syra-labila och kan lätt avlägsnas med massivt stöd av 20-50% trifluorättiksyra (TFA) i diklormetan (DCM) under PNA syntes. En automatiserad peptid synthesizer kan användas för att syntetisera PNA oligomerer; 3-5-faldigt överskott av PNA monomer behövs dock för en automatiserad peptid synthesizer. Manuell syntes kräver betydligt mindre PNA monomer (2-3-faldigt överskott), med varje koppling enkelt övervakas av den Kaiser test43. Dessutom är många automatiserade syntar inte kompatibla med Boc strategi syntesen av användning av frätande TFA under Boc borttagning steg.

De PNA oligomererna kan renas genom omvänd-fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC) följt av molekylvikt karakterisering av MALDI-TOF (figurerna 3 och 4)30, 31. vi anställa icke-denatureringen sida att övervaka triplex bildandet, på grund av att gratis RNA duplex konstruerar och PNA bunden etage ofta visa olika migration priser (figur 5)30,31 . Ingen märkning behövs om effektiv efter färgning kan uppnås för båda av RNA duplex och PNA· RNA2 triplex band. En relativt liten mängd prov behövs för icke-denatureringen sidan experiment. Lastning (inkubation) buffertar och rinnande buffertar (pH 8,3) kan dock inte samma, vilket resulterar i mätningarna att vara begränsade till de kinetiskt stabila etage, eftersom ett relativt högt pH-värde på 8,3 avsevärt kan destabilisera en triplex.

2-Aminopurine är en isomer av adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescensintensiteten (med ett utsläpp peak på cirka 370 nm) är känslig för närmiljön strukturella förändringar, och är lämplig för övervakning av triplex formation med 2-aminopurine återstoden införlivas nära PNA bindande webbplats () Figur 6) 31. till skillnad från många andra färgämnen som visar fluorescens utsläpp i det synliga området, 2-aminopurine-märkt RNA kan utsättas för rummet ljus utan foto blekning. Till skillnad från sidan experiment där en rinnande buffert pH 8,3 behövs ofta, 2-aminopurine baserat fluorescens titrering tillåter mätning av bindande i en lösning vid angivna pH och därmed kan tillåta mätning och detektering av relativt svaga och kinetiskt instabil bindande vid jämvikt.

UV-absorbans-upptäckt termiska smälttemperatur experiment tillåta mätning av termisk stabilitet duplex (figur 7)31 och triPlex30,32,44,45. Beroende på längd och sekvens sammansättning, smältning av etage kan eller inte kan visa en tydlig övergång. Termodynamiska parametrar kan erhållas om värme- och kylsystem kurvorna överlappar varandra. Korrekt termodynamiska parametrar kan erhållas genom isotermiska titrering calorimetry (ITC)32; dock krävs relativt stora mängder prover generellt för ITC.

Protocol

1. manuell fasta fasen peptid syntes av PNAs använder Boc kemi

Obs: framgång och användarvänlighet önskad PNA oligomer syntesen, alla lösningsmedel och reagenser bör vara vattenfri. Lägg till de lämpliga molekylsiktar (4A, 1-2 mm diameter pellets) och ibland rensa torr kvävgas i flaskor. För syntes av modifierade PNA monomerer, kan rapporterade protokollen i respektive referenser 30 , 31 användas. Omodifierade PNA monomerer kan köpas från kommersiella källor. I varje tvätt steg, lämplig mängd lösningsmedel tillsätts harts, bildar en slurry, innan den dräneras bort

  1. Lastning av första monomeren och tak de överskjutande gratis primära aminesna på kådan
    1. väger 30 mg 4-methylbenzhydrylamine hydroklorid (MBHA·HCl) polystyren harts (kommersiellt tillgängliga; lastning värdet 0,7-1,4 mmol/g; maskstorlek på 100-200), och överföring till en 5 mL fast fas peptid reaktion fartyget utrustat med Avstängningskranen och glas propp.
    2. Blöt kådan i en lämplig mängd DCM för 1 h, så att kådan att svälla och exponera aminesna (HCl salt).
      Obs: Harts pärlor bör alltid vara helt nedsänkt i lösningsmedel i hela syntesen.
    3. Tappa ur DCM genom att tillämpa en skonsam flöde av torr kvävgas över toppen av kolven. Tillsätt 1 mL 50% (v/v) N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) i DCM och lämna det i 15 min. Detta neutraliserar HCl salt bifogas de fria aminesna på kådan.
    4. Upprepa steg 1.1.3. Samtidigt väga 6 µmol av monomer och 6 µmol av (bensotriazol-1-yl-oxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfat (PyBOP), och överför till en 1,5 mL tub. Tillsätt 200 µL av dimetylformamid (DMF) och 12 µmol av DIPEA. Vortex koppling lösningen för 3-5 min.
      Obs: Önskad lastning-värde som används är 0,2 mmol/g. Den första monomeren lagt till är monomeren på C-terminalen av önskad PNA sekvensen. Lastning värdet av den första amino syran kan beräknas genom de pikrinsyra metod 46.
    5. Tappa ur DIPEA från DCM lösning. Tvätta kådan med DCM (x 3), följt av DMF (x 3), och Stäng Avstängningskranen. Lägg till beredda koppling lösningen till harts och skaka försiktigt. Tryck kådan längs de inre väggarna i fartyget i kopplingen lösningen med hjälp av en ren rostfritt stål spatel. Bifoga glaspropp och säkra fartyget i en inkubator shaker för 3 h vid 40 ° C.
      Obs: Alternativt reaktionskärlet kan hållas stadig i rumstemperatur i 6-8 h för att möjliggöra slutförandet av peptiden koppling reaktion.
    6. Bereda tak lösning genom att blanda 240 µmol ättiksyraanhydrid och 360 µmol av DIPEA till 200 µL av DCM. Rinna av koppling lösningen och tvätta kådan med DMF (x 3) och DCM (x 3). Lägg i tak lösning och lämna fartyget för 30 min, ibland skakar fartyget försiktigt. Capping masker överskott gratis primära aminen grupperna på hartser av acetylering.
    7. Upprepa steg 1.1.6. Rinna tak lösningen och tvätta kådan med DCM (x 3).
    8. Bort en liten delmängd av harts pärlor med hjälp av ett tunt kapillärrör och placera dem i 1,5 mL injektionsflaska av glas. Utföra den Kaiser test 43. Tillsätt 15 µL av varje av Kaiser testlösningar i glaset injektionsflaska och värme med hjälp av en värmepistol. Observera färgen på pärlorna efter upphettning. Färgen på pärlorna bör förbli oförändrade, vilket indikerar avsaknaden av gratis amine grupper på kådan.
      Obs: Kaiser testutrustning är kommersiellt tillgängliga eller kan förberedas enligt protokollet rapporterade. Lösning A: ninhydrin i etanol; lösning B: fenol i etanol; lösning C: kaliumcyanid (KCN) i pyridin.
      FÖRSIKTIGHET: KCN är mycket giftigt; rätt skyddskläder bör användas och värme bör utföras i ett väl ventilerat dragskåp, i avsaknad av brandfarliga lösningsmedel eller reagenser.
    9. Upprepa steg 1.1.6 om harts pärlor visar blå eller svagt blå färg.
  2. Avlägsnande av N-terminala skydda amingrupp
    1. dränera lösningsmedlen från reaktionskärlet och lägga till en lösning av 50% (v/v) av trifluorättiksyra (TFA) i DCM, säkerställa att hartser är helt nedsänkt. Lämna fartyget för 15 min, ibland skakar för att underlätta deprotection amine grupper. Upprepa 2 fler cykler.
      Varning: TFA är starkt frätande. Rätt skyddskläder ska användas vid hantering.
    2. Tvätta kådan med DCM (x 3), DMF (x 3) och DCM (x 3). Lägga till en lösning av 5% DIPEA i DCM. Lämna fartyget för 15 min. Detta steg aktiverar de fria aminesna genom att neutralisera de TFA counter anjoner. Upprepa en gång till.
    3. Spola ut DIPEA från DCM lösningen. Tvätta kådan med DCM (x 3). Utför testet Kaiser (steg 1.1.8).
      Obs: Framgångsrika deprotection amine grupper kommer att ge blå missfärgning av pärlor. När deprotection är framgångsrika, efterföljande kopplingen av monomerer av peptid kopplingen kan utföras.
  3. Koppling av efterföljande monomerer
    1. väger 18 µmol av önskas monomer (för Boc-PNA-Q-OH monomeren, 13,2 mg av monomer vägs) och 18 µmol av PyBOP i ett 1,5 mL rör. Tillsätt 200 µL DMF och 36 µmol av DIPEA i 1,5 mL röret. Vortex tills alla fasta föreningar är upplöst.
    2. Tvätta kådan med DMF (x 3). Lägg till koppling lösningen i reaktionskärlet och skaka försiktigt. Tryck kådan längs de inre väggarna i fartyget i kopplingen lösningen med hjälp av en ren rostfritt stål spatel. Bifoga glaspropp och säkra fartyget i en inkubator shaker för 3 h vid 40 ° C.
    3. Avlopp av koppling lösningen och tvätta kådan med DMF (x 3) och DCM (x 3). Utför steg 1.1.8. Om färgen på pärlorna är oförändrad, upprepa steg 1.2.1-1.3.3 tills önskad PNA sekvensen avslutats. Om blå missfärgning av pärlor observeras efter tillkoppling av en monomer, upprepa steg 1.3.1-1.3.3. Om missfärgning kvarstår, utföra den tak igen (steg 1.1.6).
      Obs: Utökad koppling tid (3-12 h) och/eller användning av överskott motsvarande monomer och koppling reagens rekommenderas om det uppstår problem med kopplingen.
    4. När önskad PNA sekvensen är klar, tvätta kådan med DMF (x 3) och DCM (x 3). Helt torrt harts genom att tillämpa ett kontinuerligt flöde av torr kvävgas i 15 min. Detta torrt harts kan delas och används för att fästa lysin och carboxyfluorescein vid N-terminalen av PNA eller fluorescerande etikett t ex cyanin 3 (Cy3).
  4. Fastsättning av lysin eller fluorescerande tagg (Cy3, Cy5, eller carboxyfluorescein) till N-terminalen av PNA
    1. väger 10 mg av harts, pre-lastat med önskad PNA sekvensen. Överför till en 5 mL reaktionskärl. Blötlägg kådan i DCM i 1 h.
    2. För fastsättning av lysin, utför steg 1.2.1-1.3.3, ersätta monomeren med antingen Boc-Lys (Z) - OH eller Fmoc-Lys (Boc) - OH.
    3. För fastsättning av carboxyfluorescein, utför steg 1.2.1-1.3.3, med 10-faldig överskott av 5 (6)-carboxyfluorescein som monomeren, och N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) och hydroxybenzotriazole (HOBt) som koppling reagenserna i DMF. Lämna den koppling reaktionen över natten i inkubatorn shaker vid 40 ° C.
      Obs: Carboxyfluorescein är ljuskänsligt, reaktionskärlet ska täckas med aluminiumfolie.
    4. För fastsättning av Cy3 eller Cy5 dye, etikett av metoden Klicka kemi, utför steg 1.2.1-1.3.3, ersätta monomeren med N-Boc-2-propargyl-L-glycine. Detta functionalizes N-terminalen av PNA med en alkynen grupp. Utföra koppar-katalyseras Klicka reaktionen för att fästa det som innehåller natriumazid Cy3 eller Cy5 fluorescerande färgämne 12 , 47 , 48 , 49
  5. PNA klyvning från fasta stöd, rening, och karakterisering
    Obs: om någon amingrupp är skyddad med den Fmoc skydda gruppen först deprotect gruppen amine genom att behandla med 20% piperdine i DMF lösning för 15 min (2 cyklar). Tvätta kådan noggrant med DMF (x 3) följt av DCM (x 3). Torka kådan genom att tillämpa ett kontinuerligt flöde av torr kvävgas i 15 min.
    1. Överföra 5 mg torrt harts i en liten flaska. Lägg till 10 µL av thioanisole och 4 µL av 1,2-ethanedithiol, att säkerställa att kådan är nedsänkt i reagensen. Lämna röret i rumstemperatur i 5 min.
      Obs: Dessa reagenser fungera som asätare, som fälla reaktiva katjoniska arter som bildas under borttagning av skydda grupper i PNA. Lämpligt rengöringsmedel kan väljas baserat på sidokedjan skydda grupper.
    2. Tillsätt 100 µL av transfettsyror i röret som innehåller harts och asätare. Försiktigt vortex blandningen och följer kort centrifugering. Lämna röret i rumstemperatur i 10 min.
      Varning: TFA är starkt frätande. Rätt skyddskläder ska användas vid hantering.
    3. Tillsätt försiktigt 20 µL av trifluoromethanesulfonic syra (TFMSA) till röret. Skaka försiktigt reaktionsblandningen innan att utsätta för kort centrifugering vid rumstemperatur. Lämna röret stadigt i rumstemperatur i 2 h.
      Varning: TFMSA är starkt frätande. Rätt skyddskläder ska användas vid hantering.
    4. Filter av klyvning cocktail i en 5 mL runda-botten kolv (RBF) med hjälp av ett glas Pasteur-pipett försedd med bomull. Använd en liten mängd TFA för att tvätta kådan.
    5. Rensa den torr kvävgas till insamlade filtratet tills alla flyktiga lösningsmedel är avdunstat. Tillsätt 1 mL kall dietyleter i RBF.
      Obs: Dietyletern kommer att orsaka PNA utfällning.
      1. Skölj RBF med dietyleter eter flera gånger innan du överför den grumliga lösningen i en 1,5 mL tub. Angående röret till centrifugering att tillåta PNA fällningen sedimentera. Dekantera av lösningsmedel och lägga till 300-500 µL av Ånghärdad vatten fällningen. Vortex grundligt för att upplösa PNA.
    6. Rena råa PNA provet via RP-HPLC med water-acetonitrile-0.1% TFA som den mobila fasen. Samla in motsvarande fraktioner, förånga alla lösningsmedel med en vakuum koncentrator innan åter upplösning av renat PNA i Ånghärdad vatten.
    7. Karakterisera renat PNA via MALDI-TOF analys med användning av α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) som matrisen prov kristallisering.
    8. Mät UV absorbansen (260 nm) av PNA vid 65 ° C. beräkna koncentrationen av PNA med ekvationen:
      Equation 1
      Obs: här c är koncentrationen, A är absorbans behandlingen erhålls, ε är koefficienten för utrotning av RNA-sekvensen och l är den optiska ljuspassagelängden av kyvetten (1 cm). utrotning av PNA sekvensen är summeringen hjälp av extinktionskoefficienten för enskilda monomerer 50. Koefficienterna som utrotning av adenin, guanin, cytosin och tymin är 15,4, 7.3, 11,7 och 8,8 mL/µmol·cm, respektive. Extinktionskoefficient av L och Q monomersna används antas vara densamma som av cytosin (C) bas.

2. Icke-denatureringen sida

  1. beredning av krävs buffertlösningar
    1. förbereda inkubation buffert (10 mL) med 116.88 mg NaCl (200 mM), 50 µL av 100 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (0,5 mM), 200 µL 1 M lager HEPES (20 mM), 9,75 m H 2 O; Justera buffert pH 7.5.
    2. Förbered 1 x Tris-Borat-EDTA (TBE) kör buffert (1 L) med 100 mL 10 x Tris-Borat-EDTA vid pH 8,3 och 900 mL H 2 O.
    3. Förbereda 10% Ammonium persulfatoxidation (APS) lösning (300 µL) med 30 mg ammonium persulfatoxidation, och 300 µL H 2 O.
  2. Beredning av 12% Polyakrylamidgelen
    1. Rengör väl bilda kam, gjutning glasplattor och distanser med etanol; de väl bilda kam och distanser är 1 mm tjocka. Ställa in gel församlingen och försegla med gel-tätning band.
    2. För en polyakrylamidgel 22 cm x 16.5 cm x 1 mm dimension, 50 mL gel lösning är tillräcklig. Väg upp 5,7 g av akrylamid och 0.3 g N, N '-methylenebisacrylamide (19:1) och överföring i en 50 mL Centrifugera röret.
      Varning: Akrylamid är cancerframkallande. Andas inte in damm ångor från akrylamid och säkerställa att rätt skyddskläder bärs vid hantering.
    3. Lös fasta föreningar i 50 mL 1 X TBE rinnande buffert genom att placera centrifugröret i 50 ° C vattenbad i 15 min eller tills alla fasta föreningar ha upplösts. Genomföra centrifugering (3000 rpm, 5 min, 25 ° C) för att avlägsna alla luftbubblor i lösningen. Låt lösningen svalna till rumstemperatur.
    4. Lägga till 250 µL 10% APS lösning och 50 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) i gellösningen och blanda försiktigt med hjälp av en spatel. Häll omedelbart lösningen mellan glasplattorna, noga med att inte införa några luftbubblor. Infoga väl bilda kammen och lämna gel inställningen i rumstemperatur i minst 60 min att tillåta polymerisation förekommer, innan de lagras vid 4 ° C tills den ska användas.
  3. Beredning av prover
    1. ta bort erforderliga mängden av RNA hårnål (1 µM) från lagret i en ren 1,5 mL tub. Torr om RNA lösningen med en vakuum koncentrator.
      Obs: Varje prov innehåller 1 µM RNA i 20 µL inkubation buffert. Vanligtvis tillagas 13 prover av RNA för en sida experimentera. RNA för alla prover kan förberedas tillsammans i ett enda rör.
    2. Bort de krävs mängder riktade PNA (med den slutlig koncentrationen på upp till 50 µM) från lager och överföring till separat 1,5 mL rör. Avdunsta vattnet av PNA lösningar med en vakuum koncentrator.
    3. Lägg till 260 µL av inkubering buffert i 1,5 mL tub som innehåller torkad RNA och blanda noggrant för att säkerställa alla RNA är dissinvolverat. Ämne RNA för att knäppa kylning: plats röret till ett värme block (som förvärmts till 95 ° C) för 5 min. omedelbart överföra i ett isbad och låt verka 10 min.
    4. Tillsätt 20 µL av RNA i varje av de 1,5 mL rör som innehåller torkad PNA och blanda noggrant. Utföra glödgning: placera röret som innehåller RNA och PNA blandning till en värme block (som förvärmts till 65 ° C) för 10 min. slå av strömmen av värme block och låt proverna svalna långsamt till rumstemperatur. Inkubera proverna vid 4 ° C över natten.
  4. Körs och bearbetning av gel
    1. ta bort gel-tätning tejpen på undersidan av glasplattan. Montera och säkra glasskivan på vertikala gel stativet med hjälp av plast klämmor.
      Obs: Gelen kör utförs i ett kallt rum vid cirka 4 ° C. All utrustning, prover, och buffertar kyls vid 4 ° C innan du kör gelen.
    2. Fylla reservoaren lägre buffert med 1 x TBE rinnande buffert tills plattan är nedsänkt i ungefär 1-2 cm av kör buffert. Fyll övre buffert reservoaren med kör buffert tills på buffert överstiger toppen av gelen av 1-2 cm. långsamt och försiktigt bort väl bilda kammen, möjliggör löpande bufferten att fylla brunnarna.
    3. Ansluta gel stativet till ett nätaggregat. Förväg Kör gelen för minst 30 min med en konstant spänning på 250 V, som är optimerad för en 22 cm x 16.5 cm x 1 mm gel.
    4. Samtidigt lägga 4 µL (20% av provvolymen) 35% glycerol lösning till varje prov och blanda försiktigt. När före körningen är klar, Ladda 20 µL av varje prov (inklusive en RNA ensam prov plus prover som innehåller RNA och PNA blandning) noga i botten av den väl med en mikropipett och gel lastning tips, se till att inte införa några luftbubblor. Kör gelen vid en konstant spänning på 250 V, liknar före körningen, för 5 h.
    5. Stoppa strömförsörjningen efter 5 h och ta ur glasplattan från stativet. Ta bort kvarvarande gel-tätning tejpen och demontera glasskivan. Försiktigt bort och fördjupa gelen i en behållare fylld med 350 mL avjoniserat vatten. Försiktigt lägga till 35 µL av etidiumbromid (10 mg/mL) och placera behållaren på en plattform shaker (låg hastighet) för 30 min.
      Varning: Etidiumbromid är ett mutagen. Rätt skyddskläder ska användas vid hantering.
    6. Släng etidiumbromid bromid lösningen i en utsedda avfallsbehållare. Skölj gelen med 1,5-2 L destillerat vatten. Skanna gelen med en imager (se Tabell för material) med en grön laser på 532 nm och utsläpp filter set på 610 nm.
  5. Gel analys
    1. kvantifiera gel bandet stödnivåerna användande en fri mjukvaran, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Normalisera bandet stödnivåerna enligt:
      Equation 2
      Obs: här jag duplex max är bandet intensiteten av RNA hårnål ensam utan tillsats av PNA, och jag Triplex max är triplex bandet intensiteten med den högsta koncentrationen av PNA lagt till.
      1. Beräkna andelen triplex bildandet enligt:
        Equation 3
    2. tomt fraktionen av triplex bildandet (Y) mot koncentrationen av PNA lagt till () ΜM). Passar data till ekvationen att erhålla dissociationskonstant (K d):
      Equation 4
      Obs: här R 0 är RNA hårnål koncentrationen (1 µM). Här är Y 0 och B ursprungliga och den maximala ändringen av den triplex fraktionen, respektive. Y är fraktionen av triplex vid varierad PNA koncentration. X är den totala PNA-koncentrationen och K d är dissociationskonstant.

3. 2-Aminopurine fluorescens bindande Assay

  1. beredning av prover (innehållande dsRNA)
    1. ta bort den erforderliga mängden av 2-aminopurine (2AP) märkt dsRNA (1 µM för varje (del) från huvudsakliga lager till en ren 1,5 mL tub. Avdunsta vatten i RNA lösningar med en vakuum koncentrator.
      Obs: Varje prov innehåller 1 µM RNA i 75 µL inkubation buffert. Vanligtvis tillagas 13 prover av RNA. RNA för alla prover kan förberedas tillsammans i ett enda rör.
    2. Bort de krävs mängder riktade PNA för olika koncentrationer från lager och överföring till separat 1,5 mL rör. Avdunsta vattnet av PNA lösningar med en vakuum koncentrator.
    3. Lägg till 975 µL av inkubering buffert i 1,5 mL tub som innehåller torkad RNA och blanda noggrant för att säkerställa alla RNA är upplöst. Centrifugera RNA lösningen kort och underkasta den glödgning: placera röret i ett värme block (som förvärmts till 95 ° C) för 10 min. slå av strömmen av värme block och låt proverna svalna långsamt till rumstemperatur.
    4. Lägga till 75 µL av RNA i varje av de 1,5 mL rör som innehåller torkad PNA och blanda noggrant. Lämna proverna i rumstemperatur i minst 1 h. Inkubera proverna vid 4 ° C över natten.
  2. Beredning av prover (innehållande ssRNA)
    1. ta bort erforderliga mängden av 2AP-märkta ssRNA (1 µM) från lagret i ren 1,5 mL rör. Extrahera de krävs mängder riktade PNA för olika koncentrationer från lager och överföring in i respektive 1,5 mL rören som innehåller ssRNA. Torka RNA och PNA blandningen med en vakuum koncentrator.
    2. Lägga till 75 µL av inkubering buffert i vart och ett av de 1,5 mL rör och blanda väl. Glödgning som omfattas av blandningen: placera röret i ett värme block (som förvärmts till 95 ° C) för 10 min. slå av strömmen och låt proverna långsamt svalna till rumstemperatur. Inkubera proverna vid 4 ° C över natten.
  3. Mätning och analys
    1. använda en fluorescens spektrofotometer för att mäta utsläpp över ett våglängdsområde 330-550 Nm. Använda en magnetisering våglängd av 303 nm.
      Obs: Proverna mäts vid rumstemperatur och varje prov mäts 3 gånger, där Genomsnittligt tas.
    2. Överföra 70 µL av inkubering buffert i den 1 cm fyrkantig kyvetten. Starta mätningen.
    3. Ta bort bufferten från kyvetten. Skölj kyvetten med destillerat vatten och rensa kvävgas torka. Upprepa för alla prover. Subtrahera buffert mätningarna från alla prover.
    4. Rita fluorescensintensiteten (a.u.) mot våglängd (nm). Spela in fluorescensintensiteten på 370 nm för alla prover. Rita fluorescensintensiteten på 370 nm (a.u.) mot motsvarande koncentrationen av PNA lagt till (µM).
    5. Passar data till ekvationen från steg 2.5.2 att erhålla dissociationskonstant (K d): Y = Y 0 + (B / (2R 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), där R 0 är 2AP-märkt dsRNA koncentrationen (1 µM).
      Obs: Här Y 0 och B är den första och högsta förändringen av fluorescensintensiteten på 370 nm, respektive. Y är fluorescensintensiteten på 370 nm vid varierad PNA koncentration. X är den totala PNA-koncentrationen och K d är dissociationskonstant.

4. UV-absorbans-upptäckt termisk smältande experiment

  1. beredning av prover
    Obs: Mät UV absorbansen (260 nm) av RNA vid 95 ° C (för att kontrollera att de RNA sekundära strukturerna störs). Beräkna koncentrationen av RNA med ekvationen:
    Equation 5
    ​ där c är koncentrationen, A är absorbans behandlingen erhålls, ε är extinktionskoefficient av den RNA-sekvensen, och l är den optiska ljuspassagelängden av kyvetten (1 cm). En extinktionskoefficient av RNA beräknas baserat på en närmaste-granne modell med MeltWin 51 , 52. Programpaketet kan tillhandahållas på begäran.
    1. Ta bort den erforderliga mängden av ssRNA (5 µM) från huvudsakliga lager till rena 1,5 mL tuber. Ta bort de nödvändiga mängder riktade PNA (5 µM) från lager och överföring in i respektive 1,5 mL rören som innehåller ssRNA. Torka RNA och PNA blandningen med en vakuum koncentrator.
    2. Lägg till 130 µL av inkubering buffert i vart och ett av de 1,5 mL rör och blanda väl. Glödgning som omfattas av blandningen: placera röret i ett värme block (som förvärmts till 95 ° C) för 10 min. slå av strömmen och låt proverna långsamt svalna till rumstemperatur. Inkubera proverna vid 4 ° C över natten.
  2. Mätning och analys
    1. använda en UV-Vis-spektrofotometer för att mäta absorbansen vid 260 nm med en 8-microcell kyvetten med en väglängd av 1 cm. Mät proverna ' absorbanserna vid ökande temperatur från 15 till 95 ° C, följt av minskande temperatur från 95 till 15 ° C med en ramp hastighet av 0,5 ° C/min.
    2. Överföra 130 μl av provet i varje brunn, att se till att en väl innehåller inkubation bufferten. Starta mätningen. Upprepa som krävs.
    3. Normalisera absorbansvärdena med hög temperaturvärdet normaliserat till enighet och rita av normaliserade absorbansen mot temperatur (° C). Rita den första derivatan av kurvorna. Få smälttemperaturer genom att montera de första derivat kurvorna till en Gaussisk funktion.

Representative Results

HPLC med omvänd fas tillåter rening av PNA oligomerer. Vi kan få ren PNA oligomerer med två rundor av HPLC rening (figur 3). PNAs identitet kan bekräftas genom MALDI-TOF analys (figur 4).

Icke-denatureringen sida är en enkel och informativ teknik för att karaktärisera den bindande samhörighet och särdrag av PNA oligomerer. Vi använder vanligtvis flera RNA hårnålar eller Duplex med enda baspar mutationer för att karakterisera bindande egenskaper (figur 5). De icke-denaturering sida data visas i figur 5 klart tyder på att den Q - och L-modifierade PNA kan känna igen en dsRNA region med ett C-G par (figur 5B, nedre panelen) men inte en utan ett C-G par (figur 5B, top panelen). Detta specifika och förstärkt erkännande är genom T· A-U, L· G-C och Q· C-G PNA· RNA2 bas triple (figur 1A, C, D) bildas. Olika PNAs med enstaka eller flera mutationer kan också användas för att påvisa förbättrad bindande egenskaper en modifierad PNA. Vi har visat att lägga till 2 mM Mg2 + i inkubation bufferten inte påverkar bindningen betydligt31.

Vi har visat genom 2-aminopurine fluorescens titrering som en Q - och L-modifierade PNA binder till en riktad dsRNA region (figur 6A, 6 C, 6 D) men inte ssRNA (figur 6B, 6E, 6F). PNA P3 binder till den 2-aminopurine-märkt dsRNA med ett Kd -värde på 0,8 ± 0,1 µM. Fluorescensintensiteten på 370 nm för de 2-aminopurine-märkt ssRNA förblir relativt konstant med varierad P3 koncentration, som anger bristen på bindningen av PNA P3 till ssRNA.

PNAs innehållande Q rester (P2 och P3) Visa ingen termisk smältande övergångar (figur 7), vilket tyder på ingen bindning till ssRNA. Detta beror på sterisk clash närvarande i Watson-Crick som Q-G par. Jämfört med oförändrad PNA P1, PNAs P4 och P5 innehållande modifierad L rester men inga Q-rester, Visa minskade smälttemperaturen för de motsvarande RNA-PNA duplex på grund av sterisk clash närvarande i Watson-Crick som L-G par. UV-absorbans-upptäckt termiska smälttemperatur data är konsekventa med 2-aminopurine fluorescens titrering data, som också visar att en PNA som innehåller Q och L rester inte binder till ssRNA avsevärt (figur 6B, 6E, 6F). Införliva en Q-base är mer destabiliserande än en L bas, Q bas har en mer betydande sterisk sammandrabbning i bildandet av ett Watson-Crick-liknande Q-G par (figur 1F) jämfört med ett Watson-Crick-liknande L-G par (figur 1E ).

Figure 1
Figur 1 : Kemiska strukturer i stabil bas trippel och instabil baspar strukturer. (A-D) Major-groove PNA· RNA2 bas tripplar av T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) och Q· C-G (D). (E, F) Instabila Watson-Crick som PNA-RNA baspar av L-G (E) och Q-G (F). Bokstaven R representerar socker-fosfat ryggraden i RNA. Vätebindningar indikeras av svarta streckade linjer. Bilden återges från referens31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Kemiska strukturer i PNA monomerer. Fyra PNA monomerer (T, C, L och Q) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Kemisk struktur av en PNA oligomer och rening av RP-HPLC. (A) kemisk struktur av PNA sekvensen P3. (B, C) RP-HPLC data av rå PNA P3 (B) och åter renas PNA P3 (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : MALDI-TOF spektrum av renat PNA P3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : RNA hårnål och PNA sekvenser och bindande karakterisering av icke-denatureringen. (A), RNA hårnålar (rHP1 och rHP2), PNA P3, och en PNA· RNA2 triplex bildas mellan PNA P3 och rHP2. (B) icke-denatureringen sida (12%) resultat för rHP1 och rHP2 bindning till PNA P3. Inkubation bufferten är 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. De laddade RNA hårnålar (rHP1 och rHP2) finns på 1 µM i 20 µL. PNA koncentrationerna i körfält från vänster till höger är 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, och 50 µM. PNA P3 binder inte till rHP1 (övre panelen) men binder till rHP2 (nedre panelen). (C), Kd bestämning för P3 bindning till rHP2. Fraktionen av triplex bildandet (Y) var plottas mot PNA koncentrationen. Siffran är anpassade från referens31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Fluorescens titrering studie av PNA P3 bindandetill 2-aminopurine-märkt RNAs. 2-aminopurine återstoden betecknas som '2' i sekvensen RNA. Inkubation bufferten är 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A), en PNA· RNA2 triplex bildas mellan P3 och en 2-aminopurine-märkt dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) en hypotetisk PNA-RNA duplex bildas mellan P3 och en 2-aminopurine-märkt ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Fluorescens utsläpp spectra för 2-aminopurine-märkt RNA duplex (1 µM) och ssRNA (1 µM), respektive, omväxlande med P3 koncentration vid pH 7,5. Toppen vid omkring 475 nm är på grund av svag fluorescens utsläpp av L basen i PNA. (D, F) Karlsson d på grundval av tomterna av 2-aminopurine fluorescensintensiteten (på 370 nm) av RNA duplex och ssRNA, respektive kontra PNA P3 koncentration. Siffran är anpassade från referens31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Thermal smältande resultat för RNA-PNA duplexrum. Inkubation bufferten är 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Alla prover som innehåller 5 µM enkelsträngat RNA (ssRNA1) och PNA i 130 µL. (A) enkelsträngat RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 och P5) och en hypotetisk PNA-RNA duplex bildas mellan PNA P3 och ssRNA1 i parallella orientering. Sterisk clash är indicerat för Watson-Crick som Q-G och L-G par. (B) smältning kurvor för olika PNAs bindning till ssRNA1. Smälttemperaturer visas för kurvorna med smältande övergångar. Siffran är anpassade från referens31.

Discussion

RNA duplex-bindande PNA oligomerer (t.ex., 10-mers) är medelstora molekyler och därmed kan visa elektroforetiska mobilitet Skift vid bindning till RNAs med en jämförbar eller något större storlek (t.ex., 50-mer eller mindre). Om en RNA är betydligt större än PNA, kanske titrering av PNA i RNA inte fungerar på grund av en begränsad gel rörlighet SKIFT. Således, den stora RNA trunkeras för de icke-denatureringen sida analyserna. Titrering av en stor RNA in en fluorophore-märkt PNA möjliggör övervakning av triplex bildandet av en icke-denatureringen agarosgel med provet laddade mitt gel40.

För ett experiment med titrering av icke-denaturering med en konstant koncentration av RNA använder vi vanligtvis en omärkt RNA-koncentrationen av 1 µM för effektiv post färgning av gratis RNA och triplex band av etidiumbromid. En RNA-koncentrationen så låga som 0,2 µM kan också vara tillräckligt beroende på RNA konstruera31. Koncentrationen av omärkta RNA (0,2 µM) avgör att Kd värdena som kan mätas exakt bör vara om 0,2 µM eller större. Andra färgning färgämnen kan användas för att effektivisera färgning. Alternativt tyder våra opublicerade data på att Cy3 dye-märkt RNAs kan användas i icke-denatureringen sidan experiment för att mäta trånga bindande händelserna.

På grund av att 2-aminopurine är endast måttligt fluorescerande, är 2-aminopurine fluorescens titrering också begränsad till mätningen av bindningen med Kd -värden nära eller över 0,2 µM31. RNA eller PNA kan märkas med en relativt ljus färgämne för att kvantifiera en relativt snäva bindande lösning genom fluorescens titrering, om bindningen resulterar i förändringar i fluorescens signaler53,54, 55.

Strategin med inriktning RNA strukturer av dsRNA-bindande PNAs har testats för ett begränsat antal RNAs. Det är troligt att bindande egenskaper kan variera för dsRNAs med olika sekvenser och baspar kompositioner. Man kan alltid välja purine-rika strand med en duplex för utformningen av TFPNAs. Det är viktigt att förstå hur raka Q· C-G tripplar kan påverka stabiliteten i en triplex. Mer omfattande sekvens-beroende studier tydligt behövs för att förstå sekvens-beroende bindande egenskaper för TFPNAs.

Affinitet för TFPNAs kan förbättras ytterligare genom att öka längden och/eller ytterligare modifiera de baser och ryggrader56,57 i TFPNAs. Dock kan en kontinuerlig duplex region inte ofta bestå av mer än 10 konsekutiva baspar utan störningar av icke-Watson-Crick strukturer. Man kan böja TFPNAs med små molekyler för erkännande av icke-Watson-Crick strukturer intill dsRNA regioner. I princip förväntas ett TFPNA-liten molekyl konjugat ha bättre affinitet och specificitet jämfört med en TFPNA eller liten molekyl ensam. Dock de kemiska och fysikaliska egenskaperna av länkaren för de konjugation58,59,60,61,62,63,64 måste optimeras.

Det faktum att TFPNAs kan selektivt binder till dsRNAs över ssRNAs och dsDNAs tyder på att det är möjligt att utveckla TFPNAs som mycket användbar kemisk sonder och potentiella terapeutiska ligander genom reglering av RNA strukturdynamik och interaktioner med proteiner och metaboliter. Cellernas upptag av TFPNAs kan underlättas genom konjugationen med cell-penetrerande beståndsdelarna som små molekyler, peptider, och nanopartiklar eller komplexbildning med supramolekylär strukturer såsom liposomer5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Funktionalisering av TFPNAs med bioimaging taggar såsom fluorophores och radioisotoper kan ytterligare underlätta upptäckten, imaging och målinrikta funktionella RNA strukturer i levande organismer.

Disclosures

En patentansökan (PAT/179/14/15/PCT) som bygger på det arbete som redovisas här har lämnats in.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av Singapore ministeriet för utbildning (MOE) Tier 1 (RGT3/13 och RG42/15 att G.C.) och MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 och MOE2015-T2-1-028 att G.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3 (2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3 (2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8 (2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139 (2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Tags

Genetik problemet 127 PNA triplex RNA struktur RNA duplex RNA-bindande ligander fasta fasen peptidsyntesen icke-denatureringen på sidan 2-Aminopurine UV termisk smältning molekylär igenkänning affinitet stora groove
Sekvens-specifika och selektiv erkännande av dubbelsträngat RNA över enkelsträngat RNA av kemiskt modifierade peptid nukleinsyror
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen,… More

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter