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Genetics

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

今回は合成のためのプロトコル、ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーを組み込むの精製変更残基。PNAs の変更によって RNA 二重鎖の認識の特性の生化学的および生物物理学的方法を説明します。

Abstract

Rna の重要なバイオ マーカーおよび治療上のターゲットとして浮上しています。従って、化学プローブや RNA 配列および構造の認識のため治療上の配位子の開発に大きな可能性があります。化学修飾ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーが最近開発されているシーケンス固有の方法で RNA 二重鎖を認識することができます。PNAs は中立的なペプチドのようなバックボーンを持つ化学的に安定しています。PNAs は、その手動 Boc 化学固相ペプチド合成法によるは簡単に比較的合成することができます。PNAs、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-時間飛行 (MALDI-TOF) の分子量特性によって続いて逆相 HPLC により精製しました。非変化のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) 法を容易に三重鎖形成のイメージングを慎重に設計無料 RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているのでショー別の移行率。エチジウム ブロマイド ポスト染色と非変性のページはしばしば結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるための簡単で有益な技術です。通常、複数の RNA のヘアピン構造または単一塩基変異は、PNA のバインディング プロパティ、親和性と特異性のバインドなどの特性評価に使用できます。による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度はローカル構造的な環境変化に敏感な三重鎖形成による 2-アミノプリンの残基の PNA 結合部位付近の監視に適しています。による 2-アミノプリンの蛍光滴定は、一本鎖 Rna (ssRNAs) をバインディング ターゲットの二本鎖 Rna (二本) へ変更された PNAs 性を確認する使用できます。UV 吸光度検出熱溶融実験許可 PNA RNA 二重鎖と PNA· の熱安定性の測定RNA2おしゃれ。ここで合成について述べる、PNA オリゴマーを組み込むの精製残基を変更変更 PNAs によって RNA 二重鎖の認識の生化学的および生物物理学的法を記述します。

Introduction

Rna の重要なバイオ マーカーおよび調節における Rna の役割の発見と多様な生物学的プロセス1,2,3の触媒の最近の進歩のための治療上のターゲットとして浮上しています。伝統的に、アンチセンス鎖はワトソン Crick 二重形成3,4,5,6,7,8、を ssRNAs にバインドに使用されています。9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 最近、三重鎖形成性ペプチド核酸 (TFPNAs) は、接合 (図 1)3,28,29Hoogsteen 水素経由で二本にバインドする設計されています。dsRNA 地域は Mrna および Mrna、事前または pri miRNAs3、多く他非コーディング RNAs1,26,27など伝統的なアンチセンス標的 Rna の大部分であります。TFPNAs を使用して三重らせんを形成を通して二本を対象とその構造の特異性のため有利になること、調節不全疾患では、例えば Rna の正常な機能を復元するのに使えない可能性大です。

最近公開された3,28,29,30,31,32,33、Roznersらと私たちの仕事 34,35,36,37,38,39,40,41, 改善の努力を報告強化された関係を持つ二本に向けて変更された TFPNAs の選択的結合。チオ-pseudoisocytosine (L) モノマー30グアニジン変更 5-メチル シトシン (Q) モノマー31など合理的に設計の PNA モノマー (図 2) の合成法を開発しました。さまざまな生化学と生物物理学的評価方法により L と Q 残基を組み込んだ比較的短い PNAs (6-10 残基) が二本でそれぞれ、ワトソン Crick G C と C G の塩基対の認識率が改善を示すことを確認しました。また、L と Q 残基を含む PNAs 未変更 PNAs に比べると、宿主と dsDNA dsRNA の方より選択的バインドを表示しています。Q ベースのグアニジン機能42 HeLa 細胞31を入力する PNAs ができます。

当研究室で合成マニュアルの Boc 化学 PNAs (Boc またはt- Boc の略 tert butyloxycarbony (図 2参照) 固相ペプチド合成方法4。アミンの保護基として Boc と PNA モノマーの合成は、Boc のグループは PNA 単量体結合中に有益であるかもしれないグループを保護する fluorenylmethyloxycarbonyl (fmoc 保護) アミンと比較して立体かさばらず便利なしっかりサポート。Boc のグループは酸に不安定、簡単に削除できます固体支持の 20-50% トリフルオロ酢酸 (TFA) ジクロロ メタン (DCM) で PNA 合成時に。自動ペプチド合成は PNA オリゴマーの合成に用いることができます。ただし、PNA 単量体の 3-5 倍の過剰は、自動ペプチド合成に必要です。手動合成には、大幅に少ない PNA モノマー (2 ~ 3 倍過剰)、各結合カイザー テスト43で容易に監視が必要です。また、多くの自動化されたシンセサイザー Boc 除去ステップ中に腐食性 TFA の使用のため Boc 戦略合成との互換性はありません。

逆相高速液体クロマトグラフィー (クロマトグラフィー) MALDI-TOF の分子量特性評価に続いて、PNA オリゴマーを浄化することが (図 3 と4)30,31. 三重鎖形成を監視するという無料の RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているためにを表示別の移行率 (図 5)30,31ページの非変化を用いて.ラベルは必要ありません RNA 二重と PNA· の両方の効率化後染色が得られるならRNA2三重バンド。比較的少量の試料は、非変性ページ実験に必要です。ただし、読み込み (インキュベーション) バッファーおよび実行バッファー (pH 8.3) できない場合があります同じ 8.3 の比較的高い pH は大きく、トリプレックスを揺るがす可能性がありますので、速度論的に安定したおしゃれに限定されている測定の結果します。

による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度 (約 370 に発光ピークを持つ nm) はローカル構造的な環境変化に敏感とバインド サイト (PNA 近く設立による 2-アミノプリンの残基三重鎖形成の監視に適しています図 6)31. 多く他の染料は目に見える範囲で蛍光性の放出を示すとは異なり 2-アミノプリン標識 RNA が写真漂白なし室内灯に公開できます。実行バッファー pH 8.3 がしばしば必要となるページの実験とは異なりによる 2-アミノプリンの蛍光滴定指定した pH で 1 つのソリューションに結合の測定が可能、測定と比較的弱いの検出可能性があることと速度論的に不安定な平衡のバインディングします。

UV 吸光度検出熱溶融実験許可二重 (図 7)31とトライの熱安定性の測定プレックス30,32,44,45。長さとシーケンスの組成によっておしゃれの融解は、明確な転移を示さないかもしれない。熱力学的パラメーターは、加熱と冷却曲線が重なっている場合に得られるかもしれない。等温滴定熱量測定 (ITC)32; 正確な熱力学的パラメーターを取得します。ただし、比較的大量のサンプルが ITC の一般的に必要です。

Protocol

1 です。 手動固相ペプチド合成の PNAs 使用 Boc 化学

注: 成功および目的の PNA オリゴマー合成の容易さは、すべての溶剤、試薬が無水する必要があります。適切な分子ふるい (4 a、1-2 mm 直径ペレット) を追加し、時折瓶に乾燥窒素ガスをパージします。変更された PNA モノマーの合成、それぞれ参照 30 , 31 で報告されたプロトコルを使用できます。PNA のいないモノマーは、商業ソースから購入できます。それがオフに消耗する前に、スラリーを成形樹脂に洗濯の手順のそれぞれで、溶剤の適切な量が追加されます

  1. 最初のモノマーの読み込みとキャッピングの余分な無料の第一級アミン樹脂に
    1. の重量を量る 30 mg 4-methylbenzhydrylamine 塩酸塩 (MBHA·HCl) のポリスチレン樹脂 (市販; 値 0.7 1.4 を読み込むモル/g;100-200 メッシュ サイズ)、および 5 mL に転送固相ペプチド反応容器バルブとガラス ストッパー装備
      2. 。
    2. うねりし、アミン (塩酸塩) を公開する樹脂を許可する、1 h の DCM の適切な量の樹脂を浸漬します
      。 注: 樹脂ビーズが常に完全に浸漬される合成中溶剤
      3. 。
    3. フラスコの上に乾燥窒素ガスの穏やかな流れを適用することで DCM 切る。50% (v/v) N, N の 1 mL を追加-diisopropylethylamine (DIPEA) DCM で、15 分間それを残します。これは樹脂の遊離アミンに接続されている塩酸塩を中和する
      4. 。
    4. 繰り返しステップ 1.1.3。一方、モノマーの 6 µmol と 6 µmol (ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ) tripyrrolidinophosphonium ヘキサフルオロリン酸 (PyBOP) の重量を量るし、1.5 mL チューブに移します。ジメチルホルムアミド (DMF) を 200 μ l 添加し、DIPEA の 12 µmol を追加します。渦カップリング ソリューション 3 ~ 5 分の
      注: 使用される必要な荷重値は 0.2 モル/g です。追加最初のモノマーは、所望の PNA シーケンスの C 末端にモノマーです。ピクリン酸法 46 で最初のアミノ酸の読み込み値を計算できます
      5. 。
    5. DCM から DIPEA 切るソリューションです。DMF (x 3)、続いて (x 3)、DCM の樹脂を洗浄し、活栓を閉じる。樹脂に準備された結合ソリューションを追加し、軽く振る。容器の内側の壁に沿ってガレージをきれいなステンレスのヘラを使って結合ソリューションに押し込みます。ガラス栓を接続し、40 で 3 h のインキュベーター シェーカーに容器を安全な ° C
      注: また、反応容器保つことができる安定したペプチド カップリング反応の完了を許可する 6-8 時間室温で
      6. 。
    6. は、無水酢酸の 240 µmol と DCM の 200 μ L に DIPEA の 360 µmol を混ぜてキャッピングのソリューションを準備します。結合ソリューションを切るし、DMF (x 3) と DCM (x 3) 樹脂を洗ってください。キャッピングのソリューションで追加し、30 分、時折軽く船を揺するために船を残します。アセチル化による樹脂上の余分な無料の第一次アミン グループをマスク キャッピングします
      7. 。
    7. 繰り返しステップ 1.1.6。キャッピングのソリューションをドレインし、DCM (x 3) の樹脂を洗浄します
      8. 。
    8. は、薄い毛管管を用いた樹脂ビーズの小さな因数を削除し、1.5 mL の小さなガラスの瓶にそれらを配置します。カイザー テスト 43 を実行します。各テスト ソリューションのガラス瓶し、熱銃を使用して熱のカイザーの 15 μ L を追加します。加熱後、ビーズの色を確認します。ビーズのカラー樹脂上の遊離アミン グループの欠如を示す変更されないままにする必要があります
      。 注: カイザー テスト キットは市販または報告されたプロトコルに従って準備することができます。ソリューション a: ニンヒドリン エタノール;ソリューション エタノール; b: フェノールソリューション c: シアン化カリウム (KCN) ピリジン
      。 注意: KCN は猛毒です。適切な保護服を着用する必要があり、可燃性溶媒や試薬の留守中の換気ヒューム フードで暖房を実行必要があります
      9. 。
    9. 1.1.6 樹脂ビーズ青または薄い青の色を表示する場合の手順を繰り返します
      10. 。
  2. N ターミナル アミンの保護基の除去
    1. 反応容器から溶剤を排出し、DCM、樹脂が完全に水中に沈むことを確実にトリフルオロ酢酸 (TFA) の 50% (v/v) のソリューションを追加します。アミン基の脱保護を容易にするために時折揺れの 15 分のために船を残します。2 より多くのサイクルを繰り返します
      。 注意: TFA は腐食性の高いです。処理するとき、適切な防護服を着用する必要があります
      2. 。
    2. は、DCM (x 3)、DMF (x 3)、DCM (x 3) と樹脂を洗います。5% の溶液を追加 DCM で DIPEA。15 分のために船を残します。この手順では、TFA カウンターの陰イオンを中和することによって遊離アミンをアクティブにします。もう一度繰り返す
      3. 。
    3. は、DCM ソリューションから DIPEA をフラッシュします。DCM (x 3) の樹脂を洗浄します。カイザー テスト (手順 1.1.8) を実行します
      。 注: アミン グループの成功の脱保護はビーズの青い変色になります。脱保護が成功すると、ペプチド結合によって単量体のそれに続く結合が実施されることができます
      4. 。
  3. 以降の単量体の結合
    1. の重量を量る 18 µmol (Boc PNA Q オ単量体、モノマーの 13.2 mg を秤量) のモノマーを望まれると 1.5 mL チューブに PyBOP の 18 µmol。DMF の 200 μ L と 1.5 mL チューブに DIPEA の 36 µmol を追加します。すべての固体の化合物を溶解するまで渦
      2. 。
    2. は、DMF (x 3) と樹脂を洗います。反応容器に結合ソリューションを追加し、軽く振る。容器の内側の壁に沿ってガレージをきれいなステンレスのヘラを使って結合ソリューションに押し込みます。ガラス栓を接続し、40 で 3 h のインキュベーター シェーカーに容器を安全な ° C
    3. ドレイン結合ソリューションと DMF (x 3) と DCM (x 3) 樹脂を洗浄します。1.1.8 の手順を実行します。ビーズのままの色が変更されていない場合は、目的の PNA シーケンスが完了するまで手順 1.2.1-1.3.3 を繰り返します。単量体の結合後、ビーズの青色の変色を観察する場合は、手順 1.3.1-1.3.3 を繰り返します。変色がそれでも解決しない場合は、再び制限実行 (ステップ 1.1.6).
      注: 拡張時間 (3-12 h) および/または単量体の過剰な同等の使用をカップリング、カップリング剤が推奨される結合の問題が発生した場合
      4. 。 目的の PNA シーケンスが完了すると、
    4. は、DMF (x 3) と DCM (x 3) 樹脂を洗います。完全に 15 分間乾燥窒素ガスの連続的な流れを適用することによって、樹脂を乾燥します。この乾燥樹脂を分割し、リジンや蛍光タグ シアニン 3 など (Cy3) PNA の N 末端に carboxyfluorescein を取り付けるために使用することができます
      5. 。
  4. PNA の N 末端のリシンまたは蛍光タグ (Cy3 や Cy5, carboxyfluorescein) の添付ファイル
    1. 樹脂、目的の PNA シーケンスがプリインストールの 10 mg の重量を量る。5 mL の反応容器に移します。1 h. の DCM で樹脂を浸漬
    2. 、リジンの添付ファイルの実行手順 1.2.1-1.3.3、モノマーを置き換えるいずれかの Boc Lys (Z) - オハイオ州または fmoc 保護・ リス (Boc) - ああ
      3. 。
    3. Carboxyfluorescein の添付ファイル、実行手順 1.2.1-1.3.3、単量体として 5 6 carboxyfluorescein の 10 倍の過剰と N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) と DMF のカップリング剤として 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)。40 でインキュベーター シェーカーでカップリング反応を一晩残す ° C
      注: carboxyfluorescein は光に敏感、反作用の容器べきである覆われるアルミ箔します
      4. 。
    4. Cy3 や Cy5 染料、クリック化学法によるラベルの添付ファイルの実行手順 1.2.1-1.3.3、モノマーを N-Boc-2-propargyl-L-glycine に置き換えます。これは、N 末端アルキン グループと PNA の functionalizes します。アジ化含む Cy3 をアタッチするクリックの銅触媒を用いた反応を実行または Cy5 蛍光染料 12 , 47 , 48 , 49
  5. 固体支持体、精製とキャラクタリゼーションから PNA 胸の谷間
    注: DMF で 20 %piperdine と扱うことによってアミン グループが最初 deprotect アミン グループは fmoc 保護グループの保護で保護されている場合溶液中 15 分間 (2 サイクル)。DMF (x 3) DCM (x 3) が続くと徹底的に樹脂を洗浄します。15 分間乾燥窒素ガスの連続的な流れを適用することで、樹脂を完全に乾燥します。
    1. 小さな瓶に乾燥樹脂の転送 5 mg。Thioanisole の 10 μ L と 1, 2-エタンジチ樹脂、試薬に浸漬を確保の 4 μ L 追加します。5 分間室温でチューブを残して
      注: これらの試薬は、スカベン ジャーは、PNA のグループを保護するための除去の間に形作られる反応性の陽イオンをトラップとして機能します。側鎖の保護基に基づく適切なスカベン ジャーを選択ことができます
      2. 。
    2. 樹脂、スカベン ジャーを含むチューブに TFA の追加 100 μ L。優しく渦混合物と簡単なの遠心分離に。室温で 10 分間チューブを残して
      注意: TFA は腐食性の高いです。処理するとき、適切な防護服を着用する必要があります
      3. 。
    3. は慎重にチューブにトリフルオロメタンスルホン酸 (TFMSA) の 20 μ L を追加します。そっと部屋の温度で簡単なの遠心分離を施す前に反応混合物を揺り動かしなさい。2 のため室温で安定したチューブを残して
      注意: TFMSA は腐食性の高いです。処理するとき、適切な防護服を着用する必要があります
      4. 。
    4. フィルター ガラス パスツールを使って 5 mL 丸底フラスコ (RBF) カクテルの谷間をピペットは綿に装備。TFA の少量を使用して樹脂を洗浄する.
    5. は、すべての揮発性溶剤が蒸発するまでに収集した濾液に乾燥窒素ガスをパージします。RBF に冷たいジエチル エーテル 1 mL を追加します
      。 注: ジエチル エーテル沈殿する PNA になります。 1.5 mL チューブに曇りのソリューションを転送する前に数回
      1. リンス、ジエチルと RBF エーテル。PNA 沈殿物の解決を許可するように遠心分離管を対象します。溶剤をデカントし、沈殿するオートクレーブ養生水の 300-500 μ L を追加します。徹底的に、PNA を溶解する渦
        2. 。
    6. RP 高速液体クロマトグラフィーによる原油の PNA サンプルを浄化 water-acetonitrile-0.1% TFA を移動相として使用します。対応する分数を収集、オートクレーブ処理した水で浄化された PNA を再溶解する前に真空濃縮を使用してすべての溶媒を蒸発させます
      7. 。
    7. MALDI-TOF 分析試料の結晶マトリクスとして α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) の使用を介して精製 PNA を特徴づける
      8. 。
    8. UV 吸光度を測定 (260 nm) 65 の PNA の ° c. の計算、方程式を用いた PNA の濃度:
      Equation 1
      注: ここで c は濃度、得た吸光度の読み取り値は、ε は RNA シーケンスの消散係数、l はキュベット (1 の光路長cm。 PNA シーケンスの消散係数個々 の単量体 50 の消散係数の総和であります。アデニン、シトシン、グアニン、チミンの消散係数は、15.4、7.3、11.7 8.8 mL/µmol·cm、それぞれ。L と Q のモノマーの消散係数はシトシン (C) ベースのそれと同じであると見なされます
      9. 。

2。ページの非変性

116.88 mg 塩化ナトリウム (200 mM) 100 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (0.5 mM) の 50 μ L、200 μ L 1 M 在庫を使用して
    1. の 必要なバッファー溶液の調製 準備インキュベーション バッファー (10 mL)HEPES (20 mM)、9.75 m H 2 O;pH 7.5 にバッファーを調整します
      2. 。
    2. X Tris ホウ酸 EDTA (TBE) 実行バッファー (1 L) 100 ml 10 準備 1 トリス-ホウ酸塩-EDTA pH 8.3 と 900 mL H 2 o ・ x
    3. 準備 10% アンモニア過硫酸 (APS) (300 μ L) して過硫酸アンモニウム 30 mg、300 μ L H 2 o.
  2. 12% ポリアクリルアミドゲルの調製
    1. よく成形櫛、ガラス鋳造板とエタノールとスペーサーをきれい; よく成形櫛とスペーサー厚さ 1 mm。ゲル アセンブリを設定し、ゲル シーリング テープで封印します
      2. 。
    2. 22 cm × 16.5 cm × 1 mm 寸法のポリアクリルアミドのゲル、ゲル溶液の 50 mL は十分。5.7 g アクリルアミドと N, N 0.3 g を量り '-チューブ methylenebisacrylamide (19:1) と 50 mL の遠心分離機に転送します
      。 注意: アクリルアミドは発がん性があります。アクリルアミドから粉塵ヒュームの吸入を避けるし、を処理するときに適切な防護服を着用することを確認します
      3. 。
    3. は、50 ° C の水浴 15 分またはすべての固体化合物が溶解しているまでに遠心管を置くことによって 50 mL 1 X TBE 実行バッファーに固体の化合物を溶解します。(3,000 rpm、5 分、25 ° C)、ソリューション内ですべての空気の泡を削除には遠心分離を行います。部屋の温度に冷却するソリューションを許可します
      4. 。
    4. は、ゲル溶液に 10 %aps ソリューションの 250 μ L とテトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 50 μ L を追加し、ゆっくりヘラを使ってを混ぜます。すぐに気泡を導入することを確かめるガラス板間の溶液を注ぐ。よく成形の櫛を挿入し、重合を使用する準備ができるまで 4 ° C で保存する前に、発生することを許可するように少なくとも 60 分間室温でゲル セットアップを残しています
      5. 。
  3. 試料の調製
    1. メインの在庫からきれいな 1.5 mL チューブにヘアピン RNA (1 μ M) の必要量を削除します。真空濃縮を使用して RNA 溶液を乾燥します
      。 注: 各サンプルには、20 μ L インキュベート バッファーで RNA の 1 μ M が含まれています。通常、1 つのページの実験のため、RNA の 13 のサンプルが用意されています。すべてのサンプルの RNA を単管で一緒に用意できます
      2. 。
    2. は、主要な株式市場と別 1.5 mL チューブに転送から (まで 50 μ M の最終的な集中) でターゲットを絞った PNA の必要なボリュームを削除します。真空濃縮を用いた PNA 溶液の水を蒸発します
      3. 。 RNA とミックスは、徹底的にすべての RNA がディスように乾燥
    3. 1.5 mL にインキュベーション バッファーの追加 260 μ 管含む海。冷却をスナップする RNA を対象: 5 分すぐにヒート ブロック (95 ° C に予熱) に挿入するチューブの氷浴に移すし、10 分を残しての場所
    4. 追加 20 μ L RNA のそれぞれ 1.5 mL のチューブを含む PNA とのミックスを徹底的に乾燥させます。焼鈍を実行: 部屋の温度をゆっくりとサンプルの冷却熱ブロックの電源を 10 分ターン (65 ° C に予熱) ヒート ブロックに RNA と PNA の混合物を含んでいる管を配置。4 ° C でサンプルを一晩インキュベートします
      5. 。
  4. 実行中、ゲルの加工
    1. ガラス板の下側にゲル シーリング テープをはがします。マウントし、プラスチックの留め具を使用して垂直ゲル スタンドの上にガラス板を固定します
      。 注: ゲルの実行で行われる約 4 ° C で寒い部屋すべての機器、サンプル、およびバッファーのゲルを実行する前に 4 ° C で冷却されています
      2. 。 連続したバッファーの約 1-2 cm にプレートを浸漬まで、
    2. は 1 x TBE 連続したバッファーとバッファー下池を入力します。バッファーのレベルを超えるまでゲルの上で 1-2 cm ゆっくりとバッファーを実行すると上のバッファー、リザーバーと優しくよく形成の櫛、井戸を埋めるための連続したバッファーを許可するを削除します。
      3. 。
    3. ゲルのスタンドを電源装置に接続します。前 22 cm × 16.5 cm × 1 mm のゲルを最適化されている 250 V の定電圧で少なくとも 30 分のためのゲルを実行します
      4. 。 一方、
    4. はサンプルのそれぞれに 4 μ L (サンプル ボリュームの 20%) の 35% グリセリン溶液を追加、軽く混ぜます。中古の実行が完了すると、慎重によくマイクロ ピペットを使用して、下部に 20 μ L (1 つの RNA だけでサンプルに加えて RNA と PNA の混合物を含むサンプルを含む) 各サンプルを読み込むし、ゲルの読み込みヒント、任意の気泡を導入することを確かめます。5 h の 250 V、実行前と同様の定電圧でゲルを実行
    5. 5 h 後に電力供給を止めるし、ガラス板をスタンドから取り外します。残りのゲル シーリング テープを外し、ガラス板を外します。そっと削除し、350 mL の脱イオン水を入れた容器にゲルを浸します。慎重に臭化エチジウム (10 mg/mL) の 35 μ L を追加し、30 分プラットフォーム シェーカー (低速) でコンテナーを配置
      注意: エチジウム ブロマイドは、変異原性です。処理するとき、適切な防護服を着用する必要があります
      6. 。
    6. は、指定された廃棄物コンテナーにエチジウム ブロマイド ソリューションを破棄します。蒸留水の 1.5-2 L とジェルを洗い流してください。イメージャーを使用してゲルをスキャン (材料の表 を参照してください) 532 のグリーン レーザーと nm と放出フィルター セット 610 で nm
      7. 。
  5. ゲルの分析
    1. GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html) を無料のソフトウェアを使用してゲルのバンドの強度を定量化します。よるとバンド強度を正規化:
      Equation 2
      注: ここで私 二重マックス は PNA の付加なしで単独での RNA のヘアピンのバンド強度 三重最大 追加 PNA の最高濃度と三重のバンド強度です。
      1. 三重鎖形成割合の計算:
        Equation 3
    2. プロット PNA の濃度に対して三重鎖形成 (Y) の一部追加 (Μ M)。解離定数 (K d) を取得する数式にデータをフィット:
      Equation 4
      注: ここ R 0 RNA ヘアピン濃度 (1 μ M) であります。ここで Y 0 と B は、それぞれ初期、三重の割合の変化の最大値をされます。Y は、様々 な PNA 濃度トリプレックスの割合です。X は濃度 PNA と K d は解離定数
      3. 。

3. による 2-アミノプリンの蛍光結合の試金

  1. (dsRNA を含む) 試料の調製
    1. による 2-アミノプリン (2AP) ラベル dsRNA (1 μ M ごとの必要数量を削除ストランドの) 主な在庫からきれいな 1.5 mL チューブに。真空濃縮を用いた RNA 溶液水を蒸発します
      。 注: 各サンプルには、75 μ L インキュベート バッファーで RNA の 1 μ M が含まれています。通常、RNA の 13 のサンプルが用意されています。すべてのサンプルの RNA を単管で一緒に用意できます
      2. 。
    2. は、主要な株式市場と別 1.5 mL チューブに転送から様々 な濃度のターゲットの PNA の必要なボリュームを削除します。真空濃縮を用いた PNA 溶液の水を蒸発します
      3. 。
    3. 1.5 mL にインキュベーション バッファーの追加 975 μ 管を含む乾燥 RNA とミックスは、徹底的にすべての RNA の溶解を確認します。簡単に RNA 溶液を遠心し、熱処理の対象: 部屋の温度をゆっくりとサンプルの冷却熱ブロックの電源を 10 分ターン (95 ° C に予熱) ヒート ブロックにチューブを配置します
      4. 。
    4. 追加 75 μ L RNA のそれぞれ 1.5 mL のチューブを含む PNA とのミックスを徹底的に乾燥させます。少なくとも 1 h. 加温室温でサンプル サンプル 4 ° C で一晩おきます
      5. 。
  2. (宿主を含む) 試料の調製
    1. クリーン 1.5 mL チューブに主な在庫から 2AP ラベル宿主 (1 μ M) の必要量を削除します。主な株式市場と、宿主を含むそれぞれ 1.5 mL チューブへの移動から様々 な濃度のターゲットを絞った PNA の必要なボリュームを抽出します。真空濃縮を使用して RNA と PNA の混合物を乾燥します
      2. 。
    2. インキュベーションの追加 75 μ L 1.5 mL チューブのそれぞれにバッファーし、よく混ぜます。混合物の熱処理を対象: サンプルはゆっくりと室温に冷却させ電源オフ 10 分ターン (95 ° C に予熱) ヒート ブロックにチューブを置きます。4 ° C でサンプルを一晩インキュベートします
      3. 。
  3. の測定と解析
    1. 330 550 nm の波長範囲にわたって放出を測定する分光蛍光光度計を使用します。303 の励起波長を使用して nm
      。 注: 室温でサンプルを測定し、各検体は測定 3 回、平均は撮影した
      2. 。 1 cm 平方キュヴェット
    2. インキュベーションの転送 70 μ L バッファー。測定を開始します
      3. 。
    3. は、キュベットからバッファーを削除します。蒸留水とキュベットを洗浄し、乾燥窒素ガスをパージします。すべてのサンプルに対して繰り返します。すべてのサンプルからバッファーの測定値を減算します
      4. 。
    4. は、波長 (nm) に対する蛍光強度 (a.u.) をプロットします。370 で蛍光強度を記録すべてのサンプルの nm。370 で蛍光強度をプロット nm (a.u.) PNA の対応する濃度 (μ M) を追加しました
      5. 。
    5. ステップし、解離定数 (K d) 2.5.2 から数式にデータが収まるよう: Y = Y 0 + (B/(2 r 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2-4R 0 X) 1/2)、R 0 が 2AP ラベル dsRNA 濃度 (1 μ M) は
      。 注: ここで Y 370 で蛍光強度の初期および最大の変化は、B 0 nm、それぞれ。Y は 370 で蛍光強度 nm PNA 濃度が異なる。X は濃度 PNA と K d は解離定数
      6. 。

4。熱溶融実験の UV 吸光度検出

  1. 試料の調製
    注: UV 吸光度を測定 (260 nm) (RNA の二次構造が破壊されかどうかを確認) する 95 ° C で RNA の。方程式をもつ RNA 濃度を計算:
    Equation 5
    ​ c の濃度ですが、得られた吸読書です、ε は消散係数RNA シーケンスのキュベット (1 cm) の光路長 l とします。RNA の消散係数は、 52 MeltWin 51 , を用いた近傍モデルに基づいて計算されます。プログラム パッケージは、リクエストに応じて提供可能性があります。
    1. 削除宿主 (5 μ M) 1.5 mL のきれいにメインのストックから必要量のチューブ。ターゲットを絞った PNA の必要なボリュームを削除 (5 μ M) から主要な株式市場と、宿主を含むそれぞれ 1.5 mL チューブに転送。真空濃縮を使用して RNA と PNA の混合物を乾燥します
      2. 。
    2. 培養追加 130 μ L 1.5 mL チューブのそれぞれにバッファーし、よく混ぜます。混合物の熱処理を対象: サンプルはゆっくりと室温に冷却させ電源オフ 10 分ターン (95 ° C に予熱) ヒート ブロックにチューブを置きます。4 ° C でサンプルを一晩インキュベートします
      3. 。
  2. 計測と解析
    1. 260 で吸光度を測定する紫外可視分光光度計を使用してパスの長さ 1 cm. の 8 マイクロセル キュベットを使用して nm を測定サンプル ' 15 から温度を上げることで結果95 から 0.5 の ° C/分の勾配 15 ° C への温度の減少によって続いて 95 ° c、
      2. 各井戸にサンプルの
    2. 転送 130 μ L、1 つをよく確かめてインキュベーション バッファーが含まれます。測定を開始します。必要に応じて繰り返します
      3. 。
    3. を団結、正規化を読んで高温で吸光度値の正規化し、温度 (° C) に対する正規化された吸光度をプロットします。曲線の 1 次導関数をプロットします。ガウス関数最初の微分曲線のあてはめによる溶融温度を取得します
      4. 。

Representative Results

逆相高速液体クロマトグラフィーでは、PNA オリゴマーの浄化をことができます。我々 は、高速液体クロマトグラフィー精製 (図 3) の 2 つのラウンドで純粋な PNA オリゴマーを取得できます。MALDI-TOF 分析 (図 4) によって、PNAs の id を確認できます。

非変性のページは結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるため簡単で有益な手法です。私たち通常使用複数の RNA のヘアピン構造や二重単一塩基変異を持つバインディング プロパティ (図 5) を特徴付けるため。非変化ページのデータを図 5に示すように明確に示唆している、Q と L-修飾 PNA C G ペア (図 5B底板) で dsRNA 領域を認識できる (図 5B、トップ C G ペアがないものではないが、パネル)。この特定と強化された認識は、T·、A U、L·G-C、および q ·C G PNA·RNA2基本トリプル (図 1A C D) の形成。1 つまたは複数の遺伝子変異を有する様々 な PNAs も変更された PNA の改良された結合特性を発揮する使えます。インキュベーション バッファーに 2 mM Mg2 +を追加するバインドは影響しませんを示した大幅31。

Q と L 変更の PNA にバインド ターゲット dsRNA 地域 (図 6A, 6 C, 6 D) がいない宿主 (図 6B、6 e、6 f) による 2-アミノプリン蛍光滴定法により実証しました。PNA P3 は 0.8 ± 0.1 μ M のKのd値を持つ 2-アミノプリン ラベル dsRNA にバインドします。370 で蛍光強度 2-アミノプリン ラベル宿主の nm、宿主の PNA P3 結合の欠如を示す、P3 濃度が異なると比較的一定している残る。

PNAs の融解転移 (図 7)、宿主へのバインドがないことを示すない熱 Q 残留 (P2、P3) ショーを含みます。これ立体衝突 Q G ペアのようなワトソン Crick に存在ためです。未変更の PNA P1 と比較して、PNAs P4 と P5 を含む変更 L 残基がない Q 残留、ショーは立体衝突 L G ペアのようなワトソン Crick の存在により対応する RNA PNA デュープレックスの溶解温度を減少しました。UV 吸光度検出熱溶融データも Q と L 残基を含む PNA は宿主にかなりバインドできません表示による 2-アミノプリンの蛍光滴定データと一致している (図 6B、6 e、6 階)。Q ベース ワトソン Crick 様 L G ペア (図 1E と比較してワトソン Crick 様 Q G ペア (図 1F) の形成でより重要な立体衝突があり、L ベースよりもより不安定 Q ベースを組み込むことは).

Figure 1
図 1: 安定した基本トリプルと不安定な塩基対の構造の化学構造。(A ~ D)主要な溝 PNA·T· の RNA2基本組(A) A U, C+·G-C (B) L·G C (C)、および q ·C G (D)。(E, F)L G (E) と (F) - G の Q の PNA RNA 塩基対のような不安定なワトソン Crick。R の文字は、RNA の糖リン酸塩のバックボーンを表します。水素結合は、黒の破線で示されます。図は参照31から再現します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: PNA 単量体の化学構造。4 PNA モノマー (T、C、L、および Q) が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: PNA オリゴマーと RP hplc 精製の化学構造。(A) PNA シーケンス P3 の化学構造。(B、C)原油の PNA P3 のクロマトグラフィー データ (B) PNA P3 を再精製 (C)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4:精製 PNA P3 の MALDI-TOF スペクトル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5:RNA のヘアピンと PNA シーケンスおよび非変化のページによるバインディングの評価。(A) RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2)、PNA P3 と、PNA·PNA P3 と rHP2 間に RNA2三重が形成されました。(B) 非変性ページ (12%) は、rHP1 と PNA P3 への rHP2 結合の結果します。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。読み込まれた RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2) は、20 μ L で 1 μ M にあります。左から右への車線で PNA 濃度が 0、0.2、0.4、1、1.6、2、4、10、16、20、28、50 μ M. PNA P3 にバインドされません rHP1 と rHP2 (上部パネル) がバインド (底板)。(C) Kd定量 rHP2 P3 バインディングのため。三重鎖形成 (Y) の割合は、PNA の濃度に対してプロットしました。図は参照31から適応です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: PNA P3 バインディングの蛍光滴定法の研究2-アミノプリン標識 Rna。による 2-アミノプリンの残渣は、RNA シーケンスに '2' として指定されます。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。(A)、PNA·P3 と 2-アミノプリン ラベル dsRNA (dsRNA2 2AP) 間に RNA2三重が形成されました。P3 と 2-アミノプリン ラベル宿主 (ssRNA2 2AP) 間に (B) A 仮想 PNA RNA 二重が形成されました。(C、 E)蛍光発光スペクトル 2-アミノプリン標識 RNA 二重 (1 μ M) と宿主 (1 μ M) のそれぞれと様々 な pH 7.5 で P3 濃度。ピークで約 475 nm は PNA の L ベースの弱い蛍光発光によるもの。(D, F)Kによる 2-アミノプリンの蛍光強度のプロットに基づくd定量 (370 で nm) の RNA 二重と宿主、PNA P3 濃度対それぞれ。図は参照31から適応です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: 熱溶融性二本鎖 RNA PNA の結果。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM NaH2PO4、pH 7.5 です。すべてのサンプルには、単一座礁させた RNA (ssRNA1) ・ 130 μ。 (A) 単一座礁させた rna (ssRNA1) PNA、PNAs (P1、P2、P3、P4、P5) PNA P3 と平行方向に ssRNA1 間に形成された仮説的な PNA RNA 二重の 5 μ M が含まれています。Q G と L G ペアのようなワトソン Crick の立体の衝突は示されます。異なる PNAs の曲線に (B) 溶融 ssRNA1 へのバインディングします。溶ける温度が融点が遷移曲線の表示されます。図は参照31から適応です。

Discussion

RNA 二重バインディング PNA オリゴマー (例えば、10 mers) 中型の分子でありこうして示すことができる結合する電気泳動の移動性シフト Rna に同等またはわずかに大きいサイズの (例えば、50 mer またはより小さい)。RNA が PNA よりも著しく大きい場合、RNA に PNA の滴定が限られたゲルの移動性シフトのため機能しません。したがって、ページの非変化試金のため大規模な RNA が切り捨てられます。大規模な RNA の蛍光ラベルの PNA に滴定ゲル40の途中でロード サンプル非変化のアガロースゲル三重鎖形成の監視が可能です。

RNA の一定濃度の非変化ページによる滴定実験のため通常効率的な投稿が無料 RNA と三重のバンドのエチジウム ブロマイドで染色の 1 μ M のラベルの RNA 濃度を使用します。RNA 濃度 0.2 μ M としては RNA 構造31によって十分な場合もあります。ラベル付けされていない RNA 濃度 (0.2 μ M) は 0.2 μ M 程度より大きいこと正確に測定することができるKd値を決定します。他の染色の染料は、染色の効率を高めるために使えます。また、未発表データは、タイトなバインディング イベントを測定する非変化ページ実験で Cy3 色素標識 Rna が使えるをお勧めします。

による 2-アミノプリンは適度蛍光灯のみ、という事実のためにによる 2-アミノプリンの蛍光滴定してKd値 0.2 μ M31以上に近い結合の測定に限られています。蛍光信号53,54,の変化における結合結果する場合蛍光滴定液で比較的タイトなバインドを定量化するための比較的明るい染料 RNA または PNA で付いたことがあります。55。

PNAs の dsRNA バインディングによって RNA の構造を対象とする戦略は、Rna の限られた数のテストされています。シーケンスと塩基組成の異なる二本のバインディング プロパティが異なることが考えられます。1 つは常に TFPNAs の設計のための二重のプリン豊富なストランドを選択可能性があります。どのように連続 q · を理解することが重要C G トリプル、トリプレックスの安定性に影響を与える可能性があります。広範なシーケンスに依存した研究は明らかに TFPNAs の配列依存的結合特性を理解する必要です。

TFPNAs の結合親和性は、長くおよび/または TFPNAs の基盤およびバックボーン用56,57のさらなる変更によってさらに強化できます。ただし、連続二重地域がしばしば成り立たない、中断することがなく 10 以上の連続塩基の非ワトソン Crick 構造によって。TFPNAs を共役 dsRNA 地域に隣接する非ワトソン Crick 構造の認識のための小分子で 1 つ可能性があります。原則として、TFPNA 小分子の共役結合親和性と TFPNA や小さな分子だけに比べて特異性が強化されます。ただし、活用58,59,60,61,62,63,64 リンカーの化学および物理的特性最適化する必要があります。

TFPNAs は ssRNAs と二本、二本に選択的にバインドできますという事実を示唆非常に有用なプローブと RNA 構造力学との相互作用の調節を介して潜在的な治療のリガンドとして TFPNAs を開発することが可能です。タンパク質と代謝産物。低分子、ペプチド、ナノ粒子などの細胞貫通部分の活用やリポソーム56,などの超分子構造との錯形成を通して TFPNAs の細胞内取り込みを促進することがあります。 ,12,17,25,31,41,65,66。さらに蛍光物質や放射性同位元素などのバイオ イメージング タグ TFPNAs の高機能化は、検出、イメージング、および生きている有機体の機能性 RNA の構造のターゲットを促進するかもしれない。

Disclosures

ここで報告される作業に基づく特許出願 (パット/179/14/15/PCT) が提出されています。

Acknowledgments

この作品は、(RGT3/13 ・ RG42/15 g. c. に) 教育 (MOE) の層 1 のシンガポール省と萌え層 2 (MOE2013-T2-2-024 と g. c. に MOE2015-T2-1-028) によって支持されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

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一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸
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Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen,… More

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).

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