توجه موقع التثبيت من البروتين Morphogenetic 2 العظام للسطوح الصلبة بالكيمياء انقر فوق
Summary
الحيوية يخدر بعظم Morphogenetic البروتين 2 (BMP2) استخدمت كاستراتيجية علاجية جديدة لشفاء كسور العظام غير الأعضاء في الاتحاد. للتغلب على الآثار الجانبية الناجمة عن إطلاق سراح منفلتة من العامل، فإننا نقترح وضع استراتيجية جديدة للموقع–شل مباشرة العامل، وبالتالي خلق المواد مع تحسين قدرات أوستيوجينيك.
Abstract
استراتيجيات علاجية مختلفة لعلاج تشوهات العظام الطويلة غير الشفاء قد تم التحقيق المكثف. وتستخدم حاليا العلاجات الحالية العديد من القيود التي أدت إلى استخدام المواد الحيوية في تركيبة مع أوستيوجينيك عوامل النمو، مثل البروتينات مورفوجينيتيك العظام (BMPs). تتطلب أساليب الاستيعاب أو تغليف استخداماً الفسيولوجية أعلاه مبالغ BMP2، عادة ما أسفر عن أثر الإفراج عن دفعة أولى ما يسمى يثير العديد من الآثار الجانبية السلبية الشديدة. استراتيجية ممكنة للتغلب على هذه المشاكل سيكون تساهمي زوجين البروتين السقالة. وعلاوة على ذلك، ينبغي إجراء اقتران بطريقة خاصة بالموقع لضمان التوصل إلى نتائج منتج استنساخه. ولذلك، قمنا بإنشاء متغير BMP2، الذي قدم حمض أميني اصطناعية (بروبارجيل-L-يسين) إلى الجزء ناضجة من البروتين BMP2 كودون استخدام التوسع (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk اقترن بالخرز فونكتيوناليزيد عن طريق أزيد تشجعهن النحاس-ألكاين سيكلواديشن (كواك). النشاط البيولوجي من جانب BMP2-K3Plk ثبت في المختبر وقد ثبت نشاط الخرز BMP2-K3Plk-فونكتيوناليزيد أوستيوجينيك في الخلية على أساس فحوصات. حبات فونكتيوناليزيد على اتصال بالخلايا C2C12 كانت قادرة على حمل التعبير الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) بالقرب من المحظورة محلياً من حبة. وهكذا، بهذا الأسلوب، يمكن إنتاج السقالات فونكتيوناليزيد التي يمكن أن تؤدي إلى تمييز الخلية نحو نسب أوستيوجينيك. بالإضافة إلى ذلك، تكفي جرعات BMP2 أقل بسبب توجه BMP2 إلى جانب توجيه الموقع التي تسيطر عليها. مع هذا الأسلوب، يتعرض BMPs دائماً على المستقبلات على سطح الخلية في الاتجاه المناسب، الذي ليس هو الحال إذا كانت تقترن العوامل عبر التقنيات الموجهة من موقع غير اقتران. نتائج المنتج يتم السيطرة عليها بدرجة عالية، وهكذا، ينتج مواد ذات خصائص متجانسة، وتحسين قابليتها لإصلاح الحجم الحرج العظام العيوب.
Introduction
الهدف النهائي لتجديد الهندسة والعظام أنسجة العظام التغلب على العوائق والقيود التي تحدث خلال فترة العلاج شيوعاً لكسور غير الأعضاء في الاتحاد. السيارات أو الو الزرع هي غالباً ما تستخدم كاستراتيجيات العلاج الحالية، على الرغم من أن كلا منهما لها عدة عيوب. وينبغي حمل الاختلاس العظام المثالي تكون العظم أوستيويندوكشن، فضلا عن أوستيوكوندوكشن، مما يؤدي إلى أوستيوينتيجريشن للفساد في العظام. في الوقت الحاضر، يعتبر فقط صناعة السيارات في زرع “المعيار الذهبي” حيث أنها تقدم كل الخصائص الاختلاس العظام المثالي. ولسوء الحظ، كما يعرض الجوانب السلبية الهامة، مثل أوقات جراحة طويلة وموقع صدمة ثانية التي عادة ما يستتبع مضاعفات أكثر (مثلاً، الألم المزمن، تشكيلات دموي، والالتهابات، وعيوب شكلية، إلخ). من ناحية أخرى بالطعوم allogenic، خصائص الأمثل لجميع الجوانب العامة1. التكنولوجيات الاختلاس العظام البديلة قد تحسنت في السنوات القليلة الماضية، بهدف إنتاج السقالات التي هي أوستيويندوكتيفي، أوستيوكوندوكتيفي، متوافق حيويا، وبيوريسوربابل. نظراً للعديد من المواد الحيوية لا تظهر كل هذه الخصائص أوستيوجينيك، قد أدمجت مختلف عوامل النمو، أساسا، BMP2 و BMP7، بغية تحسين إمكانات osteogenic سقالة خاصة2.
كمعيار أساسي، ينبغي أن توفر نظم إيصال عامل النمو هذه إطلاق سراح جرعة التي تسيطر عليها مع مرور الوقت بغية تيسير أحداث أساسية مثل تجنيد الخلية والمرفقات، وخلية إينجرووث والأوعية. ومع ذلك، BMPs، فضلا عن العوامل الأخرى النمو osteogenic عادة المعطل تداولها غير تساهمي3. تقنيات الامتزاز والفخ تتطلب استخدام المبالغ أعلاه الفسيولوجية للبروتين بسبب إطلاق سراح دفعة أولية، الأمر الذي يؤدي إلى عيوب خطيرة المجراة، عادة ما تؤثر على الأنسجة المحيطة بفرط العظام، عظام النهايات وتورم والتهاب4. وهكذا، يمكن الاحتفاظ بعوامل النمو في موقع التسليم لفترات أطول من الوقت بأساليب التثبيت التساهمي. تعديل كيميائيا BMP2 (سوكسينيلاتيد5، أسيتيلاتيد6 أو7من بيوتينيلاتيد)، المهندسة heterodimers8، أو BMP2 أوليجوبيبتيديس المشتقة9 تم تصميمها واستخدامها للتغلب على القيود المتصلة ب الاستيعاب. بيد أن بيو-نشاط هذه الثوابت لا يمكن التنبؤ بها نظراً للترتيب الذي يحتمل أن يمنع ربط يجند المعطل تداولها المستقبلات الخلوية. كما هو موضح سابقا، من الضروري أن جميع سلاسل مستقبلات الأربعة المشاركة في تشكيل مجمعات المنشط مستقبلات يجند التفاعل مع BMP2 المعطل تداولها بغية تنشيط جميع المتلقين للمعلومات مما يشير إلى الشلالات10بالكامل.
للتغلب على مشاكل نتيجة المنتج متنافرة مع قيود من حيث بيواكتيفيتي، والاستقرار، والتوافر البيولوجي العامل المعطل تداولها، قمنا بتصميم متغير BMP قادرة على تساهمي ملزمة السقالات في طريقة توجيه الموقع. وتضم هذا البديل، BMP2-K3Plk، ووصف حمض أميني اصطناعي الذي عرضته كودون الوراثية التوسع في11. ارتبط هذا البديل بنجاح إلى السقالات باستخدام استراتيجية اقتران التساهمية مع الحفاظ على نشاطها البيولوجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
توليد المتغيرات البروتين الموسومة بتوسيع كودون الوراثية يسمح الأخذ بمختلف الأحماض الأمينية غير طبيعية النظير أساسا في أي موضع من تسلسل البروتين الأساسي. في حالة BMPs مثل BMP2, العلامات المشتركة مثل علامة 6-الحامض الأميني (له) لا يمكن عرض ن لا شفاء منها، منذ نهاية protein´s ج-الطرفية مدفونة داخل هي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور م. روبيني (كونستانز، ألمانيا) لتوفير بلازميد ترميز بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال وتوفير برسفدويت-بيرترناسينث ترميز سينثاتيز aminoacyl-الحمض الريبي النووي النقال المطابق.
Materials
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | — | — | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | — | — | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | — | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | — | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3– (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | — | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge – 5417R | Eppendorf | — | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | — | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | — | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler – Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | — | PCR |
| TxRed – microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
