Site-verwiesene Immobilisierung von Knochen morphogenetische Protein 2 an feste Oberflächen durch Click-Chemie
Summary
Biomaterialien, dotiert mit Knochen morphogenetische Protein-2 (BMP2) wurden als neue therapeutische Strategie zur Pseudarthrose Knochenbrüche zu heilen. Um Nebenwirkungen durch eine unkontrollierbare Freigabe des Faktors zu überwinden, schlagen wir eine neue Strategie zur Website-Faktors, wodurch Materialien mit verbesserten osteogene Funktionen direkt zu immobilisieren.
Abstract
Verschiedene therapeutische Strategien für die Behandlung von nicht heilenden lange Knochendefekte wurden intensiv untersucht. Derzeit verwendeten Behandlungen vorhanden mehrere Einschränkungen, die auf die Verwendung von Biomaterialien in Kombination mit knochenbildenden Wachstums-Faktoren, wie zum Beispiel Knochen morphogenetische Proteine (BMPs) geführt haben. Häufig verwendete Absorption oder Kapselung Methoden erfordern supra-physiologischen BMP2, was in der Regel in einem so genannten ersten Ausbruch-Release-Effekt, der mehrere schwere Nebenwirkungen hervorruft. Eine mögliche Strategie, um diese Probleme zu überwinden wäre, das Protein kovalent zum Schafott zu koppeln. Darüber hinaus sollten Kupplung in gewissem Sinne ortsspezifische durchgeführt werden, um einen reproduzierbaren Produkt Ergebnis zu garantieren. Deshalb haben wir eine BMP2 Variante, in der eine künstliche Aminosäure (Propargyl-L-Lysin) in den Reifen Teil des Proteins BMP2 Codon Usage Expansion (BMP2-K3Plk) eingeführt wurde. BMP2-K3Plk wurde an funktionalisierten Perlen durch Kupfer katalysierten Azid-Alkinen Cycloaddition (CuAAC) gekoppelt. Die biologische Aktivität des gekoppelten BMP2-K3Plk wurde in Vitro nachgewiesen und die knochenbildenden Aktivität der BMP2-K3Plk-funktionalisiert Perlen wurde in zellbasierte Assays nachgewiesen. Die funktionalisierten Perlen in Kontakt mit C2C12 Zellen konnten Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) in lokal begrenzten Nähe des Wulstes induzieren. Damit, mit dieser Technik funktionalisierten Gerüste hergestellt werden können, können die Zelldifferenzierung in Richtung einer osteogene Abstammung auslösen. Darüber hinaus sind niedrigere BMP2 Dosen ausreichend durch die kontrollierte Ausrichtung der Site-verwiesene gekoppelten BMP2. Mit dieser Methode sind BMPs immer ihre Rezeptoren auf der Zelloberfläche in der entsprechenden Ausrichtung ausgesetzt, die nicht der Fall ist, wenn die Faktoren über Site-verwiesene Kopplungstechniken gekoppelt sind. Das Produkt Ergebnis ist höchst steuerbar und somit Ergebnisse in Materialien mit homogenen Eigenschaften, verbessern ihre Anwendbarkeit für die Reparatur von kritischen Größe Knochen Defekte.
Introduction
Das ultimative Ziel des Tissue Engineering und Knochen Knochenregeneration ist die Überwindung der Nachteile und Einschränkungen bei gemeinsamen Behandlungen der Pseudarthrose Frakturen auftreten. Auto oder allo-Transplantationen werden vorwiegend als aktuelle Therapiestrategien eingesetzt, obwohl sie beide mehrere Nachteile haben. Die ideale Knochentransplantat sollte Osteogenesis durch Osteoinduction sowie Osteokonduktion, führend zu die Osteointegration des Transplantats in den Knochen induzieren. Heute ist nur Auto-Transplantation als der “Goldstandard” betrachtet, da es alle Eigenschaften eines idealen Knochentransplantat bietet. Leider stellt es auch wichtige negative Aspekte, wie langen OP-Zeiten und eine zweite Trauma-Website, die in der Regel mehr Komplikationen (z.B., chronische Schmerzen, Hämatom Formationen, Infektionen, kosmetische Fehler, etc.) mit sich bringt. Allogene Transplantate, haben auf der anderen Seite suboptimale Eigenschaften für alle allgemeines1. Alternative Bone Graft Technologien wurden in den letzten Jahren, mit dem Ziel, die Gerüste herstellen osteoinduktiv, osteokonduktiv, biokompatibel, und bioresorbierbaren verbessert. Da viele Biomaterialien nicht all diese knochenbildenden Merkmale zeigen, wurden verschiedene Wachstumsfaktoren, vor allem BMP2 und BMP7, aufgenommen um das osteogene Potenzial des bestimmten Gerüst2zu verbessern.
Als ein wesentliches Kriterium sollten solche Wachstumsfaktor-Delivery-Systeme eine kontrollierte Dosis Version im Laufe der Zeit bereitstellen, um die wesentlichen Ereignisse wie Zelle Rekrutierung und Bindung, Zelle Einwachsen und Angiogenese zu erleichtern. Jedoch immobilisiert BMPs sowie andere osteogene Wachstumsfaktoren wurden häufig nicht kovalent3. Verlockende Falle und Adsorption Techniken erfordern den Einsatz von supra-physiologischen Mengen an Protein durch einen ersten Ausbruch-Freisetzung, führt zu schweren Nachteilen in-vivo, in der Regel Auswirkungen auf das umliegende Gewebe durch Induktion Knochen Wucherung, Osteolyse, Schwellung und Entzündung4. Somit kann die Beibehaltung der Wachstumsfaktoren an der Lieferstelle für längere Zeit durch kovalente Immobilisierung Methoden erreicht werden. BMP2 chemisch modifiziert (Succinylated5, Schimmelpilzschäden6 oder biotinylierte7) entwickelt Heterodimere8oder BMP2 abgeleiteten Oligopeptide9 entwickelt und verwendet, um die Beschränkungen zu überwinden wurden im Zusammenhang mit Absorption. Die Bio-Aktivität diese Konstrukte ist jedoch nicht vorhersehbar, da die Anordnung möglicherweise die Bindung des immobilisierten Liganden an den zellulären Rezeptoren hemmt. Wie zuvor dargestellt ist es wichtig, dass alle vier Rezeptor-Ketten beteiligt an der Gründung der aktivierten Ligand-Rezeptor-Komplexe mit den immobilisierten BMP2 interagieren, um vollständig alle nachgelagerten Signalisierung Kaskaden10aktivieren.
Um die Probleme der inhomogenen Produkt Ergebnis mit Einschränkungen in Bezug auf die Bioaktivität, Stabilität und Bioverfügbarkeit von immobilisierten Faktor zu überwinden, entwarfen wir eine BMP-Variante kovalent binden Gerüste in gewissem Sinne Seite gerichtet. Diese Variante, genannt BMP2-K3Plk umfasst eine künstliche Aminosäure, die durch genetische Codon Erweiterung11eingeführt wurde. Diese Variante wurde erfolgreich für Gerüste mit einer kovalenten Kupplung Strategie und gleichzeitig seine biologischen Aktivität verbunden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tagged Protein Variantenbildung durch genetische Codon Expansion ermöglicht die Einführung von verschiedenen nicht-natürliche Aminosäure-Analoga prinzipiell an jeder Stelle die primäre Proteinsequenz. Im Falle von BMPs wie BMP2, gemeinsame Stichwörter wie ein 6-Histidin (His)-Tag kann nur N-Terminal eingeführt, da die Protein´s C-terminalen Ende ist innerhalb der tertiären Proteinstruktur begraben, und somit nicht von außen zugänglich ist. An anderen Positionen kann die Größe des eingeführten Tags sehr wahr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. M. Rubini (Konstanz, Deutschland), für die das Plasmid Pyrrolysyl-tRNA kodieren und für die Bereitstellung von pRSFduet-PyrtRNAsynth die entsprechende Aminoacyl-tRNA Synthestase Codierung.
Materials
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | — | — | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | — | — | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | — | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | — | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3– (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | — | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge – 5417R | Eppendorf | — | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | — | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | — | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler – Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | — | PCR |
| TxRed – microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
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