Summary
Vi beskriver en ny metod för leverans av DNA plasmid i urothelial celler mus blåsan i vivo genom urinröret kateterisering och elektroporation. Det erbjuder ett snabbt och bekvämt sätt för att generera autoktont musmodeller av urinblåsan sjukdomar.
Abstract
Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) är extremt värdefulla i avslöjande romanen biologiska insikter i initiering och progression mekanismer för mänskliga sjukdomar såsom cancer. Transgena och villkorliga knockoutmöss har ofta använts för genen överuttryck eller ablation i specifika vävnader eller cell typer i vivo. Däremot kan genererar könsceller musmodeller vara tidskrävande och kostsamma. Senaste framsteg i gen redigeringen och genomförbarheten av att leverera DNA plasmider av virusinfektion har aktiverat snabb generering av icke-könsceller autoktont cancer musmodeller för flera organ. Blåsan är ett organ som har varit svårt för virala vektorer tillgång till, på grund av närvaron av en glykosaminoglykan lager som täcker urotelet. Här beskriver vi en ny metod som utvecklades i lab för effektiv leverans av DNA plasmider in mus urinblåsan urotel i vivo. Genom intravesical instillation av pCAG-GFP DNA plasmid och elektroporation av kirurgiskt exponerade urinblåsan visar vi att DNA Plasmiden kan levereras specifikt in i urinblåsan urothelial celler för övergående uttryck. Vår metod ger ett snabbt och bekvämt sätt för överuttryck och Nedslagning av gener i mus urinblåsan, och kan användas till att bygga GEMMs av cancer i urinblåsan och andra urologiska sjukdomar.
Introduction
Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) har spelat en viktig roll i att utöka vår kunskap om djurs utveckling, gen funktioner i vivooch mekanismer för sjukdomsprogression1,2. Könsceller GEMMs utvecklas traditionellt på två sätt. Först är skapandet av transgena möss genom pronukleär injektion av DNA plasmid följt av transplantation av zygoter i pseudopregnant honor. Den andra är generationen av knock-out/inpressning möss av homolog rekombination i embryonala stamceller och utvecklingen av chimärer. Villkorliga knockout av gener i särskilda vävnads- eller typ av intresse innebär uppfödning av genmanipulerade alleler med Cre och flox platser för flera generationer. Hela processen kan vara dyrt och tidskrävande, särskilt om målet är att rikta flera gener vävnad-specifikt. Nyligen, genredigering teknik såsom klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) har tillämpats på flera organ av mössen att inducera vävnadsspecifika genetiska förändringar för autoktona cancer modellering3, 4,5,6,7 eller rätt sjukdom mutationer i situ8,9. I dessa studier var leveransen av gärna vektorerna vanligtvis uppnås genom adenovirala eller lentiviral infektion i orgel eller hydrodynamiska svans-ven injektion. Den relativa lätthet leverans av CRISPR komponenterna till lunga och lever har förbättrats avsevärt bekvämlighet och effektivitet av cancer modellering i dessa organ jämfört med traditionella Cre-Lox baserat musmodeller.
Det blåsan urotelet är där de flesta urinblåsan tumörer har sitt ursprung. Leverans av DNA vektorer till det blåsan urotelet för cancerbehandling modellering eller genen hämmas av ett glykosaminoglykan lager på den apikala urothelial ytan, som fungerar som en barriär för efterlevnad av infektiösa virus10,11. Flera förbehandling medel såsom Syn3 och natriumdodecylsulfat-β-d-maltoside har använts för att störa denna barriär och förbättra adenovirus infektion effektivitet12,13,14. Om adeno-associerade virus (AAVs) effektivt kan infektera blåsan har inte rapporterats. Sammantaget vore en icke-virala baserat leveransmetod önskvärt. Här beskriver vi en ny metod som utvecklats i laboratoriet för effektiv DNA plasmid leverans till mus urotel genom urinröret kateterisering och elektroporation. Eftersom vår metod inte innebär kemisk förbehandling av glykosaminoglykan lagret eller virus produktion, det avsevärt förenklar distribution av DNA plasmider i mus urinblåsan urotel och bör underlätta olika in-vivo studier av urinblåsan sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden beskrivs här utfördes i enlighet med de riktlinjer och förordningar från institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of California Santa Cruz.
1. plasmid och verktyg förberedelse
- För varje urinblåsan till transfect, förbereda minst 20 µL av DNA plasmid (1 µg/µL).
- Tillsätt 1 µL av Trypan blå till de 20 µL av Plasmiden lösning i en 1,5 mL mikrocentrifug rör. Pipetten att blanda väl.
- Autoklav alla kirurgiska instrument och sterilisera arbetsytan med 70% etanol. Ofta spraya kirurgiska instrument och handskar med 70% etanol eller Använd en glas pärla sterilizer när du utför följande steg för att upprätthålla sterila förhållanden.
2. bedöva djuret
- Använda en tabell top anestesi system för att söva djuret med isofluran. Slå på O2 tanken och justera syre flödesmätarens till 1 L/min.
- Placera en vuxen kvinnlig C57BL/6J mus i induktion kammaren. Aktivera och justera den isofluran spridare till 3% för induktion. Musen ska vara i anestesi inom 2 min. administrera buprenorfin smärtstillande (0,1 mg/kg) subkutant vid borttagning av musen från induktion kammaren för föregripande analgesi.
Obs: I detta protokoll, honmöss används, eftersom de är lättare att arbeta med under urinröret kateterisering. Protokollet fungerar även för manliga möss, men extra försiktighet krävs när du utför steg 3. - Tillämpa oftalmologiska salva till ögonen på djuret att förebygga torrhet. Placera bedövat musen uppåt på en värmedyna med nosen i näsan konen. Slå på luft krets för att låta isofluran gå igenom näsan konen.
- Hålla tillbaka huvudet och näsan konen med tejp. Justera den isofluran spridare till 2% för underhåll.
- Hålla armar och ben med tejp. Utföra tå-nypa tester för att kontrollera att djuret är i djup anestesi och sedan raka buken.
3. urin utarmning och urinblåsan sköljning
- Applicera smörjmedel till katetern (24G, längd 2.11 cm, ytterdiameter 0,045 cm) och säkerställa att dess yttre yta är helt täckt.
- Sätt in katetern i urinröret öppningen och tryck det långsamt tills den når blåsan, då urinen ska flyta ut genom katetern. Tryck försiktigt på buken att hjälpa urinen utarmning.
- Kontrollera om katetern sitter rätt in i urinblåsan genom att observera automatisk urinen rinner ut. Undvika piercing urinröret och urinblåsan väggen, och applicera smörjmedel flera gånger om det behövs.
- Kassera urinen med en pipett till en avfall bägare.
- Pipettera 80 µL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i den yttre änden av katetern, med den andra ändan fortfarande i urinblåsan. Fäst en 1 mL spruta försiktigt till katetern. Tryck försiktigt på sprutan att injicera PBS i urinblåsan. Lämna vissa PBS i katetern att undvika att skapa luftbubblor i urinblåsan.
- Ta bort sprutan. Vänta på PBS rinna ut ur urinblåsan. Tryck försiktigt på buken att evakuera PBS.
- Kassera PBS i katetern med en pipett till avfall bägaren.
- Upprepa PBS tvätt (steg 3,4-3,6) för två gånger.
Obs: Det är viktigt att arbeta varsamt under stegen tvätt. Blod i katetern eller misslyckande av automatisk ut flödet av vätska visar vanligen urinröret är genomborrat. Det är också viktigt att undvika att införa luftbubblor, som de kommer att minska elektroporation effektivitet.
4. plasmid leverans
- Gälla mus buken 70% etanol och använda en skalpell för att göra ett vertikalt snitt 1 cm öppna buken huden ovanför urinblåsan.
- Pipettera minst 20 µL av Plasmiden plus Trypan blå lösning i den yttre änden av katetern och koppla sprutan.
- Plasmid lösningen injiceras i urinblåsan. Om blåsan blir blå, är injektionen framgångsrika. Lämna lite vätska i katetern att undvika att skapa luftbubblor i urinblåsan.
- Ta den externa urinrörets mynning med pincett, och sedan ta bort katetern och spruta. Använd ett snöre att dra åt den yttre urinrörets mynning. Gör två slingor med strängen och sedan knyta med två knutar.
Obs: Skärpning av de urinrör är viktigt för att förhindra återflödet av Plasmiden vätska. - Slå på elektroporation generatorn med följande parametrar: 33V, 50 ms arbetstid och 950 ms tidsintervall.
- Håll blåsan med pincett och nyp blåsan med två elektroder. Tryck ned fotpedalen till utföra elektroporation.
Obs: De elektriska pulserna är inställda att inträffa 5 gånger med korta intervall efter varje pedal push. Musen kan rycka i denna process. Trycka ned fotpedalen mer än en gång kan öka leverans effektiviteten, men alltför många elektriska pulser kan skada vävnad integritet urotelet.- Undvik kontakt mellan pincetten och elektroderna, eftersom detta genererar en gnista.
5. återhämtning
- Sutur buk- och hud öppningen med sterila kirurgiska suturer och klipp. Tillämpa jod på såret.
- Ta bort djuret från isofluran systemet. Administrera buprenorfin smärtstillande (0,1 mg/kg) subkutant för att minska postoperativ smärta.
- Hålla djur på värmedyna och returnera den till buren efter fullständig återhämtning. Kontrollera djur minst en gång dagligen för normal rörlighet, dricka och utfodring beteenden och inga tecken på infektion tills såret är läkt och ta sedan bort klippen. Administrera efterföljande injektioner av buprenorfin smärtstillande om djuret visar smärta symptom såsom minskad grooming, ökad aggressivitet och läte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera framgång leveranssätt genen in i urinblåsan urotel, använde vi pCAG-GFP15 plasmiden för elektroporation. 20 µL av plasmid och Trypan blå lösningen injicerades genom urinröret och 5 elektriska pulser administrerades. Efter 48 h, vi dissekerade mus blåsan och observerade fläckar av GFP fluorescens i dissektion fluorescens Mikroskop, medan en negativ kontrollerar urinblåsan som inte genomgick elektroporation visade ingen GFP signal (figur 1A). När vi utförde immunofluorescens färgning av sektionerad urinblåsan vävnader med cytokeratin (CK) 5, CK18, och god Jordbrukarsed antikroppar, Vi hittade att GFP signal var närvarande i paraply, mellanliggande, och basala celler, men inte i muskeln lager (figur 1B), som anger god specificitet av Plasmiden leverans till urotelet. Ca 15% av urothelial celler är GFP+, och sådan klonal natur borde vara idealisk för cancer modellering eftersom tumörer brukar inleda från enskilda celler.
Figur 1: framgångsrik leverans av pCAG-GFP plasmiden att det musen urinblåsan urotelet. (A) jämförelse av en urinblåsa som genomgick elektroporation (höger) till en negativ kontroll urinblåsan (vänster) visar att elektroporation framgångsrikt blev blåsan grön. (B) immunofluorescens färgning av sektionerad urinblåsan vävnader visar mosaikmönster uttryck av GFP+ celler i paraply (CK18+), mellanliggande (CK5+CK18+), och basala (CK5+) urothelial lager. Skalstapeln i A motsvarar till 1 mm och i B 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektroporation ökar permeabilitet cellmembranet och är en kraftfull teknik för gen electrotransfer16. Gen leverans till levande gnagare av elektroporation har ofta använts i neurobiologi fält17,18,19,20,21. Dess potentiella tillämpningar i många andra organ har inte undersökts utförligt. Till vår kunskap är vår metod som beskrivs här den första rapporten av framgångsrik gen leverans av elektroporation till det blåsan urotelet. Det erbjuder flera fördelar att metoderna adenovirus/lentivirus-baserade infektion. Första är metoden elektroporation enklare, säkrare och billigare att anta eftersom Icke-virala genetiska vektorer används och leverans av DNA plasmider till specifikt organ platser i vivo är relativt okomplicerad. För det andra, man undviker oönskade värd immunsvaren som ofta är kopplade till leveransen av virus vektorer22. För det tredje, när det gäller urinblåsa, det förnekar behovet av kemisk förbehandling av lagrets glykosaminoglykan, som normalt blockerar virus bindning till urothelial celler.
De viktigaste stegen i detta protokoll är kateterisering, sköljning och plasmid injektion. Extra omsorg och varsam hantering behövs för att säkerställa att katetern inte punkteras genom urinröret eller blåsväggen när du utför isättning och fästa/ta bort sprutan. Applicera tillräcklig smörjmedel för att helt täcka den yttre ytan av katetern är också viktigt. En annan trolig orsak till misslyckande är införandet av luftbubblor in i urinblåsan under sköljning och plasmid injektion, eftersom det kommer att minska elektriska ledningsförmåga. För att förhindra detta, rekommenderar vi alltid lämna lite vätska i katetern när du utför dessa steg.
Våra protokoll bör fungera för vuxna möss oavsett ålder, eftersom vi inte har följt en skillnad i leverans effektiviteten mellan yngre (2 månader) och äldre (1 år) möss. Flera faktorer kan påverka plasmid leverans effektivitet. Vi rekommenderar 20 µL av plasmiden som den minimala volymen för injektion eftersom lägre belopp inte kan tillräckligt täcker den inre ytan av blåsan. Ökande plasmid volym och koncentration generellt ger högre penetration, men observerades ingen ytterligare fördel för volymer bortom 60 µL. ger mer elektriska pulser och röra olika ytor av urinblåsan med elektroder måste den största påverkan på effektivisera leveransen. Elektroporation parametrarna beskrivs i detta protokoll är inställd att tillåta permeabilisering av urothelial celler samtidigt bevara vävnad integritet, eftersom högre spänning tenderar att inducera celldöd. Det är möjligt att justera parametrarna för ytterligare optimering. Mus-att-mouse variationer och hanteringen av forskaren kan påverka effektiviteten avsevärt. Beroende på syftet med projektet rekommenderar vi att utföra studier för att avgöra de bästa parametrarna för varje specifik experiment. Till exempel i modellering cancer initiering och klonal tillväxt, kan en lägre penetration önska.
Som ett proof-of-principle för våra leveranssätt, GFP uttryck kan visualiseras i urinblåsan så tidigt som 36 h efter elektroporation och kan kvarstå i minst två veckor. Med denna nya metod är det nu möjligt att leverera DNA plasmider till mus blåsan snabbt och billigt för genen överuttryck eller down-förordning och editering. Det öppnar nya vägar för studiet av urinblåsan utveckling och sjukdomar, samt bygga nya autoktont urinblåsan cancer modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande intresse.
Acknowledgments
Vi tackar Professor Bin Chen, Dr Yue Zhang och Kendy Hoang för hjälp med att ställa in elektroporation systemet. Detta arbete stöds av bidrag från Santa Cruz Cancer nytta Group och NIH till Z.A.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
