Summary
Cet article décrit un protocole pour ex vivo imagerie calcique du cerveau drosophile . Dans cette méthode, des composés naturels ou synthétiques peuvent être appliqués à la mémoire tampon pour tester leur capacité à activer les neurones particulières dans le cerveau.
Abstract
Orgue-de communication par la signalisation endocrinienne, par exemple, de la périphérie vers le cerveau, est essentielle au maintien de l’homéostasie. Comme un animal modèle pour la recherche endocrinienne, Drosophila melanogaster, qui a sophistiqué outils génétiques et l’information de génome, est plus en plus utilisé. Cet article décrit une méthode pour l’imagerie calcique des explants de cerveau de drosophile . Cette méthode permet la détection de la signalisation directe d’une hormone dans le cerveau. Il est bien connu que beaucoup d’hormones peptidiques agissent par l’intermédiaire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), dont l’activation entraîne une augmentation de la concentration intracellulaire du Ca2 +. Activation neurale élève aussiCa 2 + intracellulaire, de l’influx de Ca2 + et de la libération de Ca2 + stocké dans le réticulum endoplasmique (re). Un capteur de calcium, GCaMP, permet de surveiller ces changements de Ca2 + . Dans cette méthode, GCaMP est exprimé dans les neurones d’intérêt, et le cerveau larvaire exprimant le GCaMP est disséqué et cultivé ex vivo. Le peptide de test est ensuite appliqué à l’explant de cerveau, et les changements fluorescents dans GCaMP sont détectés à l’aide d’un microscope confocal de rotation disque équipé d’une caméra CCD. En utilisant cette méthode, n’importe quelle molécule soluble dans l’eau peut être testée, et divers événements cellulaires associés à l’activation neuronale peuvent être photographiées en utilisant les indicateurs fluorescents appropriés. En outre, en modifiant la chambre d’imagerie, cette méthode peut servir à l’image des autres organes de la drosophile ou les organes d’autres animaux.
Introduction
Orgue-de communication est une stratégie évolutivement conservée pour le maintien de l’homéostasie pour faire face aux changements environnementaux. Chez l’homme, une variété d’arereleased hormones des glandes endocrines dans la circulation. Beaucoup de ces hormones ciblent l’hypothalamus du cerveau, qui régit les processus métaboliques et des comportements fondamentaux tels que l’alimentation1,2. Beaucoup d’hormones ont été découverts à l’aide de modèles mammifères. Cependant, les mécanismes de leur action, en particulier les réseaux proposé auxquelles ils participent, demeurent en grande partie incertains.
Drosophila melanogaster est devenue un modèle utile pour étudier l’orgue au grand orgue communication. Chez les insectes, de nombreux processus physiologiques sont contrôlés par les hormones. Les premières études axées sur la croissance et métamorphose utilisé de gros insectes. Dans ces études, l’enlèvement ou la transplantation d’organes spécifiques avait prédit l’existence de molécules de signalisation inter orgues ; plus tard, l’hormone juvénile (JH), prothoracicotropique hormone (PTTH) et Ecdysone sont biochimiquement purifiée3,4,5. Une grande famille de peptides de signalisation intercellulaires est censée participer à diverses manifestations physiologiques durant le cycle de vie insectes6,7. La plupart de ces peptides agit sur les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), bien que les RCPG spécifiques ont été initialement difficile à identifier à l’aide de méthodes conventionnelles. La publication de la drosophile de séquence du génome entier8 a été la percée qui a permis l’identification de peptides bioactifs de Drosophila basé sur leur homologie à celles retrouvées chez d’autres insectes. En outre, les récepteurs de plusieurs peptides ont été identifiés des RCPG prévues dans le génome à l’aide de la culture-RCPG-ligand binding analyses cellulaires. Ensuite, analyses d’expression prédit les voies à-orgue induites par ces peptides et récepteurs. En particulier, beaucoup des récepteurs putatifs de peptide sont exprimés dans le cerveau, ce qui suggère que le cerveau est une cible majeure du peptide hormones9. En outre, les outils avancés de génétiques chez la drosophile ont contribué à l’identification des rôles physiologiques de combinaisons de peptide-RCPG. Par exemple, les systèmes transcriptionnelles binaires LexA et GAL4 permettent de gène ou la surexpression d’une manière contrôlée dans le temps et l’espace. GAL4, un facteur de transcription identifié chez la levure, se lie à une séquence de cis-réglementation spécifique appelée séquence d’Activation en amont (SAMU). Dans le système de GAL4/UAS, la ligne pilote fournit des tissus-spécifiques ou expression de GAL4 stade spécifique et la ligne de répondeur porte SAMU en amont du gène d’intérêt ou de la construction à l’expression de shARN en voiture. LexA/LexAop système repose sur un mécanisme similaire. Analyse phénotypique des animaux de tissu-spécifique tissu-spécifique et de peptide-choc de GPCR-knockdown peut révéler des informations sur le mode de signalisation le peptide-RCPG et site d’action. Toutefois, les conclusions qui sont accessibles uniquement par les données génétiques sont limitées. En revanche, une fois que la cible présumée d’une hormone peptidique particulière est réduite à un type de cellule ou de tissu, ex vivo calcium d’imagerie des explants orgue peut servir à élucider l’orgue-à communication médiée par le peptide-GPCR signalisation. Moment de l’activation d’un RCPG Gq couplées, la concentration intracellulaire de Ca2 + est augmentée en raison de la libération de Ca2 + de l' ER10. Dans le cerveau, activation neurale augmente également le taux intracellulaire de Ca2 + . Ces augmentations de Ca2 + peuvent être détectées par un capteur de calcium, GCaMP, qui subit des changements conformationnels en présence de Ca2 + résultant en fluorescence d’émission11.
Dans cet article, un méthode d’imagerie à l’aide de Drosophila cerveau des explants de calcium est décrite. Pour tester la capacité d’un peptide à activer les neurones spécifiques, un peptide de test est appliqué à l’explant exprimant le GCaMP de cerveau, et les changements de fluorescence sont surveillés par microscopie confocale. L’implication de la GRCP est ensuite confirmée en effectuant la même épreuve en utilisant un mutant cerveau manque le RCPG. Cette combinaison de génétique et d’imagerie fournit des informations précises sur l’orgue au grand orgue communication en peptides-RCPG. Possible modifications et les applications du présent protocole sont également discutées.
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Protocol
1. préparation des Explants de cerveau larvaire
- Faire une salle d’imagerie.
NOTE : Enregistrement Stable exige que les explants de cerveau être attaché. Ici, une chambre d’imagerie artisanaux, de faible coût est utilisée dans le Ca2 + système d’imagerie.- À l’aide de pinces, gratter le bas au centre d’un plat de culture en plastique (35 x 10 mm) pour créer une brèche pour le ganglion ventral du cerveau larvaire rendre le montage plus facile (étape 1.3, Figure 1).
- Avec un cure-dent, placez une petite goutte de colle de chaque côté de la dent et fixer une tige de tungstène (0,125 mm de diamètre, 6 à 7 mm de longueur) à la colle.
- À l’aide d’un petit morceau de mastic adhésif réutilisable, faire un mur circulaire (10 mm de diamètre et 3 mm de hauteur) entourant la dent (Figure 1).
Remarque : L’espace à l’intérieur de la paroi sera plus tard rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 0,14 M NaCl, KCl, 0,0027 M 0,01 M PO43 -, pH 7,4 ± 0,05 à 25 ° C).
- Préparation animaux
Remarque : Pour l’imagerie calcique, un indicateur de calcium, GCaMP6s, s’exprime dans le type de cellule d’intérêt, ce qui est couramment réalisée en utilisant des combinaisons de GAL4 tissu-spécifique et de SAMU-GCaMP6s. Pour vous assurer que le signal est médié par les récepteurs de candidat, GCaMP6s s’exprime également dans un mutant déficient dans le récepteur.- Lorsque des comparaisons expérimentales pour des génotypes différents tels que le type sauvage et mutants sont nécessaires, âge des larves test match pour éviter les variations de niveau expression GCaMP6 et différences physiologiques en raison des stades de développement.
- Garder les mouches parentales (30 mouches pour chaque sexe) dans un flacon de culture contenant alimentaire mouche standard pendant 8 h permettre à Ponte sur la surface de l’aliment. Larves de culture en masse sous un cycle lumière-obscurité de 12 h à 25 ° C et 60 à 70 % d’humidité relative.
- Dissection du cerveau larvaire
- 90-120 heures après la ponte (AEL), recueillir les larves et les laver au moins 3 fois avec de l’eau distillée pour enlever les débris alimentaires adhérentes.
- Place une larve sur un verre de montre carré 1,5 pouces bac à glace froide.
Remarque : Les deux étapes suivantes sont effectuées dans ce verre de montre sous le microscope à dissection. - Pince permet de saisir délicatement la partie médiane de la larve. Utiliser une autre pince pour saisir les crochets de la bouche et retirer les crochets de bouche doucement pour séparer la partie antérieure de la larve contenant le cerveau du reste du corps.
Remarque : Vous pouvez également ciseaux chirurgicaux peut être utilisé. - Tenez l’extrémité antérieure par forceps et mettez la larve à l’envers. Enlever les tissus étrangers rattachés au cerveau, tels que les disques imaginaux, corps gras et glande de l’anneau. Doucement le cerveau séparer les pièces buccales.
- Appliquer 200 µL de PBS à l’intérieur de l’anneau de l’adhésif réutilisable de mastic dans la salle d’imagerie. Aspirer doucement le cerveau disséqué avec PBS dans une pipette Pasteur et puis transférez-le dans la chambre d’imagerie.
- Affectant le cerveau dans la chambre d’imagerie
- Pince permet de saisir des fibres musculaires qui s’étend des ganglions ventrales. Insérez doucement le cerveau dans la dent sous le fil de tungstène.
- Une autre pince, tirez le fil de tungstène légèrement jusqu'à placer le cerveau à l’emplacement correct pour l’imagerie (Figure 1).
2. l’acquisition des Images de Ca2 + Fluorescence
Remarque : Les explants de cerveau plongés dans du PBS sont imagés à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un 20 X objectif à immersion dans l’eau (N.A. = 0,5). PBS n’active pas les cellules du cerveau. Si les images de l’axe z sont nécessaires, l’objectif est monté avec un moteur de lentille piézoélectrique activé. Une tête confocal de rotation disque est utilisée pour améliorer la résolution temporelle. Pour l’imagerie de la pénombre, un électron multipliant dispositif à couplage de charge caméra est monté sur le microscope. L’imagerie de fluorescence GCaMP6s (excitation/émission : 488/509 nm) nécessite un laser 488 nm pour l’excitation avec un séparateur de faisceau dichroïque et un filtre d’émission (p. ex.., 528 filtre passe-bande de ± 38 nm bande).
- Placez la chambre d’imagerie contenant l’explant cerveau sous le microscope.
- Abaisser l’objectif jusqu'à ce qu’il touche le PBS. Sous un éclairement lumineux-zone, placez le cerveau et l’amener dans le foyer. Basculez vers la lumière fluorescente et ajuster le focus sur les cellules marquées GCaMP6s.
Remarque : La fluorescence verte basale de la GCaMP6s doit être visible. - Démarrer l’acquisition à 250 ms/cadre avec une résolution de 512 × 512 pixels en mode refroidi à l’eau en utilisant le logiciel d’acquisition appropriée (p. ex.., µManager). Ajuster la durée d’exposition pour obtenir les valeurs de la fluorescence au sein de la gamme dynamique de la caméra CCD, sans être inférieur à 1000 (unités arbitraires), avec les images 16 bits (plage dynamique 0-65 535).
NOTE : Un temps d’exposition faible devrait servir à minimiser les photo-blanchiment de la GCaMP6s. Temps d’exposition doit être optimisé pour chaque expérience, puisqu’elle dépend des niveaux d’expression de la GCaMP6 et la sensibilité du système de détection. C’était 100 ms dans notre expérience, en utilisant dilp2 > GCaMP6s. Lorsque les profilés en z sont requises pour une profondeur donnée d’imagerie, plusieurs images de profilé en z peuvent être acquises selon les intervalles de temps et cadre de l’exposition. Si la caméra a une résolution spatiale suffisante, la taille binning (nombre de registres sur la puce qui va être mis en cellule dans un pixel numérique) doit être augmentée afin de réduire le temps d’exposition. - Une fois que les paramètres d’imagerie sont déterminés, prendre des photos pendant 1 min avant l’administration de peptides pour détecter l’intensité de signal de référence (F0).
- Appliquer le peptide de test ; pour ce faire, dissoudre 100 µL de solution de peptide dans du PBS et il Pipetter directement dans le bain de larve pour obtenir une concentration optimale.
Remarque : La solution de peptide doit être injectée lentement (p. ex., débit débit 20 µL/s) dans la solution de bain à l’aide d’une pipette. Peptide synthétique non apparenté, dissoute dans du PBS est utilisée comme contrôle négatif. - Enregistrement de l’émission de GCaMP6s pendant quelques minutes.
3. analyse des données
Remarque : Données d’imagerie sont analysées en mode hors connexion avec le ImageJ. Au cours de l’imagerie Time-lapse, pipetage provoque le cerveau larvaire pour se déplacer. Par conséquent, aberrations positionnelles des série images doivent être corrigées avant l’analyse. La correction peut être effectuée à l’aide d’un plug-in, d’ImageJ TurboReg comme suit.
- Ouvrez le logiciel d’analyse et d’utiliser la première image (avant application du peptide) comme une image de référence.
- Sélectionnez Plugins | Inscription | TurboReg.
- Choisissez le fichier image série comme la Source et l’image de référence comme la cible.
- Recherchez les Corps rigide (déplacement parallèle et la rotation des images) et précis (« Rapide » est grossier mais analyse rapide au lieu de cela) la méthode de traitement et de la qualité, respectivement.
- Cliquez sur lot pour commencer le traitement de l’image.
- Sélectionner plusieurs régions d’intérêt (ROIs) en utilisant Analyze | Outils | Gestionnaire de ROI dans ImageJ.
- Mesurer l’intensité du pixel en cliquant sur plus | Mesure multi | OK dans la fenêtre Gestionnaire de ROI.
- Calculer ΔF/F0 = (F - F,0) / f0, où F est l’intensité ROI au moment de la relance et F0 est l’intensité à une fenêtre de temps précédant un événement expérimental particulier (p. ex. 30 cadres précédant le apparition de stimulation).
- Répéter l’expérience à l’aide de plusieurs échantillons de cerveau, effectuant un traitement statistique pour obtenir la moyenne et l’écart-type de la moyenne (SEM) à chaque point dans le temps.
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Representative Results
Utilisant ce protocole, l’activation des cellules productrices d’insuline du cerveau (IPCs) de l’hormone peptidique, CCHa2, a été examinée. PISC du cerveau sauvage ont été marquées avec GCaMP6s à l’aide d’une combinaison de dilp2 -GAL412 (un don de Dr. Rulifson) et SAMU-GCaMP6s13 (Don de m. Kim). Explants de cerveau larvaires ont été traitées avec un peptide synthétique de CCHa2, et la fluorescence de GCaMP6s a été enregistrée en temps réel. Dans cette expérience, des images ont été extraites d’un seul plan focal. Chaque cluster de la CIB contient environ 14 éléments14et signaux de 3 à 6 cellules ont été détectés. L’intensité du signal GCaMP6s augmenta considérablement à l’administration de CCHa2 (Figure 2A, 1 film). Le cerveau sauvage n’a pas montré une réponse évidente à la ghréline ou nociceptine (film 2 et 3, respectivement), qui sont des hormones de peptide de mammifère sans un homologue de drosophile . Ces résultats indiquent que l’activation observée du PISC de CCHa2 est une réponse spécifique à CCHa2. Pour préciser si CCHa2 agit par l’intermédiaire de CCHa2-R, la même analyse a été réalisée à l’aide de cerveaux mutants CCHa2-R. Aucune telle augmentation de l’intensité du signal a été observée après l’administration de CCHa2 dans le cerveau de mutant (film 4). L’analyse statistique a montré que la différence d’intensité de signal entre le sauvage et le cerveau mutant CCHa2-R est devenue significative dans les 2 min après l’application de la CCHa2 et a été maintenue pendant au moins 7 min (Figure 2B). Ces résultats indiquent que IPCs sont spécifiquement activés par CCHa2 par CCHa2-R. Tous les peptides utilisés dans cette étude ont été dilués par PBS pour donner une concentration finale de 10-9 M.
Figure 1 . Chambre d’imagerie
(A) la Culture plat (35 mm x 10 mm) avec une petite dent et la tige de l’attachement. (B) mur en forme d’anneau en mastic adhésifs réutilisables. (C) un explant de cerveau larvaire inséré dans la salle d’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Imagerie calcique de l’explant cerveau larvaire
Cerveau de type sauvage (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) a été exposé à la nociceptine, ghréline et CCHa2. Mutant CCHa2-R (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) cerveau a été exposé à CCHa2. GCaMP6s signaux dans IPCs ont été détectés par microscopie confocale à 250 ms/cadre. Encore des images des points sélectionnés apparaissent en (A). Les images ont été pseudocolored de mieux visualiser les intensités de signal différent. ΔF/F0 à chaque instant a été tracée au point B. ΔF/F0 a été calculée à partir de 5 à 10 préparations différentes. ROIs ont été définies sur des corps cellulaires qui ont été détectés dans un même plan focal. Les lignes pleines indiquent la moyenne des échantillons de 5 à 10, et les lignes en pointillés marquent les limites supérieure et inférieure de l’écart-type de la moyenne. Les zones ombrées indiquent la variation des signaux dans les expériences. Barre d’échelle indique 50 µm. La figure est une adaptation de Sano et al. 15. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Film de 1. Sauvage-type PISSC exposés à CCHa215 s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Movie 2. PISC sauvage exposés à ghréline15 s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Movie 3. Sauvage-type PISSC exposés à la nociceptine15 s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Film 4. CCHa2-R mutant PISC exposés à CCHa2 15 s’il vous plaît cliquez ici pour regarder cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Le Ca2 + imagerie méthode décrite ici est un système utile pour tester le fonctionnement des hormones dans le cerveau. In vivo, le cerveau reçoit des hormones de divers organes endocriniens. En outre, le cerveau perçoit sans cesse croissant d’informations sensorielles, qui entraîne l’activation neuronale spontanée. Ce système ex vivo élimine ces bruits et donne un meilleur rapport signal/bruit que l’imagerie in vivo . Dans ce système, les molécules peuvent être testés séparément ou en combinaison. En plus des hormones peptidiques, toutes les molécules solubles dans l’eau, y compris des composés naturels ou synthétiques, peuvent être appliqués à l’explant de cerveau.
Pour l’imagerie2 + Ca explants de cerveau doivent être attachés. À cet effet, une matrice de gel en bas point de fusion point d’agarose ou fibrine a été utilisé précédemment16,17. Ces matrices de gel peuvent contenir l’échantillon stablement, cependant, les tissus sont chauffés au-dessus de 30 ° C. Cette température provoque une réponse au choc thermique chez les animaux poïkilothermes tels que des insectes. Pour éviter le stress thermique, le cerveau pourrait être attaché physiquement. Le cerveau attaché à la cuticule sont fixés avec des broches insecte18. Notre méthode à l’aide d’un fil de tungstène offre simple et stable, tenant de l’échantillon. Ce système est facile à préparer et réutilisable et permet des stimulants atteindre les cellules cibles plus facilement par rapport au gel intégrant la méthode. Ainsi, cela vous sera utile pour le dépistage de ligand.
Le choix de l’indicateur fluorescent dépend du type de neurones de la cible, le type de récepteurs exprimés dans les neurones et les questions biologiques abordées. Une série de variantes GCaMP6 optimisé pour détecter différents Ca2 + dynamique temporelle a été généré13. En particulier, les variantes GCaMP6 se distinguent par leur cinétique de la réponse : GCaMP6s (lent), GCaMP6m (moyen) et GCaMP6f (rapide). Les temps de décomposition de GCaMP6s et 6m sont relativement lents (i.e., τ1/2 après 10 potentiels d’action dans une préparation de tranches hippocampal) et ceux qui de GCaMP6f est rapide (τ1/2 après 1 potentiel d’action). D’autres types d’indicateurs fluorescents disponibles pour l’activité neurale incluent EPAC-cAMP (cAMP de), Synapto-pHluorin (libération synaptique) et ArcLight (potentiel membranaire)19,20,21. Ces indicateurs fluorescents génétiquement codés peuvent être exprimées dans les types spécifiques de cellules. Ainsi, l' ex vivo système d’imagerie peut détecter diverses réactions dans les neurones désirées.
Il y a plusieurs étapes cruciales dans le présent protocole. Tout d’abord, des tissus doivent être enlevés du cerveau pour obtenir une image claire. L’utilisation de forceps affuté et ciseaux chirurgicaux facilite le travail délicat. En second lieu, il convient de fixer le cerveau disséqué en position. Occasionnellement, l’échantillon de cerveau se déplace légèrement de pipetage (la gamme environ 5 µm). Pour empêcher le cerveau de bouger, la hauteur du fil de tungstène dans la salle d’imagerie doit être ajustée à la taille de l’échantillon de cerveau. Alternativement, un système de perfusion gravité pourrait être installé pour stimulation en douceur. En troisième lieu, les résultats de l’imagerie cérébrale devraient être interprétés avec prudence. Le ligand appliqué au cerveau pourrait stimuler les neurones inattendus, qui à son tour pourraient activer les neurones de la cible. Pour détecter l’effet direct d’une hormone sur les neurones spécifiques, les récepteurs doivent être démontés dans la targetneurons. Dans ce cas, l’expression de l’indicateur fluorescent est cumulable avec celle du récepteur ARNi en utilisant le système de Gal4/UAS.
Une limitation mineure du présent protocole est que la durée de l’imagerie est limitée en raison des dommages éventuels de l’échantillon de cerveau. Dans nos mains, le cerveau de la drosophile peut être photographié pour jusqu'à environ 60 min à l’aide de ce protocole. L’hémolymphe-comme solution, tels que HL3.1 saline22et intensités laser pourrait permettre à long terme d’imagerie. En outre, l’installation d’imagerie actuelle ne convient pas à une stimulation répétée d’un même échantillon. Pour ces expériences, un bain de perfusion peut être utilisé.
Enfin, ce protocole a diverses applications. En modifiant la chambre d’imagerie, le cerveau adulte et autres tissus de la drosophile ou les tissus d’autres animaux pourraient être photographiés. Chez les organismes non-modèle, le manque d’outils génétiques a rendu difficile d’introduire des indicateurs fluorescents dans le génome. Cependant, les techniques d’édition génome CRISPR/Cas9 récemment mis au point ont ouvert la porte au génie génétique chez ces animaux. Ainsi, ce protocole pourrait être utilisé pour étudier la signalisation inter-orgue dans une grande variété d’animaux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été pris en charge par des subventions pour la recherche scientifique (15K 07147, 17K 07419) de pages JSP (pour Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), une subvention de recherche de la Fondation Inamori (sur HI) et le programme commun Usage/Centre de recherche pour Developmental Medicine, à l’Institut d’embryologie moléculaire et génétique, Université de Kumamoto (a HS). Nous remercions le Dr Azusa Kamikouchi et M. Daichi Yamada pour leur aide dans l’utilisation du système d’imagerie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
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