Summary
本稿では、ショウジョウバエの脳のカルシウム イメージング前のヴィヴォのプロトコルについて説明します。この方法で天然または合成化合物は、脳の特定の神経細胞をアクティブにする能力をテストするバッファーに適用できます。
Abstract
内分泌シグナルによる臓器に通信たとえば、脳に周囲からは恒常性を維持するために不可欠。内分泌研究のためのモデルとして、キイロショウジョウバエ、遺伝学的ツールとゲノム情報が洗練された、これがますます使用されています。この資料では、ショウジョウバエ脳外植体のカルシウム イメージング法について説明します。このメソッドは、脳にホルモンの直接シグナルを検出できます。多くのペプチッド ホルモン行動を通じて G タンパク質共役受容体 (Gpcr) が活性化は、細胞内 Ca2 +濃度の増加を引き起こすことが知られています。神経活性化は、細胞内の Ca2 +濃度 Ca2 +流入の Ca2 +細胞質網状質 (ER) に格納されているリリースからも高めます。カルシウム センサー、GCaMP は、これらの Ca2 +変更を監視できます。この方法で GCaMP は関心のニューロンで表現され GCaMP 表現する幼虫の脳は解剖、養殖前のヴィヴォ。テストのペプチドが脳植に適用されますし CCD カメラを装備して回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた GCaMP の蛍光変化を検出する.このメソッドを使用すると、任意の水溶性分子をテストことができますと適切な蛍光インジケーターを使用して神経の活性化に関連付けられている様々 な携帯電話イベントをイメージすることができます。また、他のショウジョウバエや他の動物の臓器を画像に、イメージングのチャンバーを変更すると、このメソッドを使用できます。
Introduction
臓器器官のコミュニケーションは、環境の変化に対処するための恒常性を維持するための進化上保存された戦略です。人間、内分泌腺からホルモン直火のさまざまな循環に。これらのホルモンの多くは代謝過程と1,2を供給など基本的な動作を調節する脳の視床下部をターゲットします。多くのホルモンは、哺乳類のモデルを使用して発見されています。しかし、彼らの行動は、彼らが参加、特に interorgan ネットワークのメカニズムはほとんど不明します。
キイロショウジョウバエは、臓器器官のコミュニケーションを研究するための有用なモデルとして登場しました。昆虫では、多くの生理学的なプロセスはホルモンによって制御されます。成長と変容に着目した初期の研究では、大型の昆虫を使用しました。これらの研究で削除または特定の臓器の移植は、臓器間のシグナリング分子の存在を予言その後、幼若ホルモン (JH)、Prothoracicotropic ホルモン (PTTH) とエクダイソン生化学的精製3,4,5をだった。細胞内情報伝達の大家族は、昆虫のライフ サイクル6、7の中に様々 な生理学的なイベントに関与すると考えられます。これらのペプチドのほとんどは、特定の Gpcr が従来のアプローチを使用して識別するために最初に困難な G タンパク質共役受容体 (Gpcr) に関する法律します。ショウジョウバエゲノム シーケンス8の出版物は、他の昆虫に見られる彼らの相同性に基づくショウジョウバエ生理活性ペプチドの同定に有効な画期的なだった。さらに、いくつかのペプチド受容体は、Gpcr 細胞・培養技術を用いた GPCR リガンド結合アッセイを使用してゲノムの予測から同定された.次に、発現解析は、これらのペプチド受容体によって誘発される臓器に経路を予測しました。特に、推定ペプチド受容体の多くは脳で脳はペプチド ホルモン9の主要なターゲットであることを示唆するいると表現されます。また、ショウジョウバエで高度な遺伝学的ツールは、ペプチド GPCR の組み合わせの生理的な役割の同定に貢献しました。例えば、GAL4 と LexA ベースのバイナリ転写システム時空間制御された方法では遺伝子ノックダウンまたは過剰発現を有効。 にします。酵母で識別される転写因子 GAL4 を上流活性化シーケンス (UAS) と呼ばれる特定のシス配列にバインドします。GAL4/UAS システム ドライバー ライン提供組織固有または段階における発現 GAL4 とレスポンダー ライン ドライブ shRNA 発現する構造や興味の遺伝子の上流の UAS を運ぶ。LexA/LexAop システムは、同様のメカニズムに基づいています。組織特異ペプチド ノックダウンおよび組織固有の GPCR ノックダウン動物の表現型解析は、ペプチド GPCR シグナル モードおよびアクションのサイトに関する情報を表示できます。ただし、遺伝的データによってだけ達することができる結論は制限されます。その一方で、特定のペプチド ホルモンの推定の対象は、組織または細胞の種類に絞られて、一度ペプチド GPCR シグナリングを介した臓器にコミュニケーションを明らかにする前のヴィヴォカルシウム器官外植体のイメージングを使用できます。Gq 共役 GPCR の活性化、ER10からの Ca2 +の放出による細胞内 Ca2 +濃度が増加します。脳神経の活性化はまた細胞内 Ca2 +濃度を高めます。このような Ca2 +増加はカルシウム センサー GCaMP は、Ca2 +蛍光発光11の結果の存在下での構造変化を経るによって検出できます。
この記事では、カルシウム イメージングを用いたショウジョウバエの脳外植片を説明します。特定のニューロンを作動するペプチドの機能をテストするテスト ペプチドは GCaMP 表現脳植に適用され、共焦点顕微鏡による蛍光の変化を監視します。GPCR が関与し、GPCR に欠けている突然変異体の脳を使用して同じアッセイを行って確認します。イメージングと遺伝学の組み合わせは、ペプチドによる臓器器官のコミュニケーションに関する正確な情報を提供しています-Gpcr。 可能な変更およびこのプロトコルのアプリケーションについても説明します。
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Protocol
1. 幼虫の脳外植片の準備
- イメージング室を作る。
注: 脳外植片が係留される安定した記録が必要です。ここでは、低コスト、手作りのイメージング商工会議所は、Ca2 +イメージング システムで使用されます。- 鉗子を使用して、取り付け簡単 (手順 1.3,図 1) を作る幼虫の脳の腹側神経節の凹みを作成するプラスチック製培養皿 (35 mm × 10 mm) の底面の中心を傷つけます。
- 、つまようじでくぼみの両側に瞬間接着剤の小さなドロップを配置し、タングステン棒 (径 0.125 mm、6 〜 7 mm 長さ) を接着剤に添付します。
- パテのような再利用可能な接着剤の小さなピースを使用して、作る円形の壁 (10 mm 径、高さ 3 mm) 周囲の凹み (図 1)。
注: 壁の内側の空間が後で満ちるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.01 M PO43 -、pH 7.4 ± 0.05 25 ° C で)。
- 動物の準備
注: カルシウム イメージング、カルシウム インジケーター、GCaMP6s は組織特異 GAL4 とUA GCaMP6sの組み合わせを使用して実現されます一般的興味のセル型で表されます。信号が候補受容体を通して仲介されることを確保するため、GCaMP6s も変異受容体の欠陥で表されます。- 野生型と変異体など異なる遺伝子型の実験的比較が必要な場合、GCaMP6 式レベル変動と生理学的な発達段階の違いを避けるために一致テスト幼虫を年齢します。
- 食品の表面に産卵を許可する 8 h の標準的なはえの食糧を含む文化バイアルに親のハエ (各性のため 30 ハエ) をしてください。質量 25 ° C と 60-70% の相対湿度で 12 時間の明暗周期下における幼虫の文化。
- 幼虫の脳の解剖
- 90-120 h 産卵 (AEL) 後、幼虫を収集し、付着性の食べ物のかすを除去する蒸留水で少なくとも 3 回洗ってください。
- 場所 1.5 インチ正方形時計ガラスの幼虫は、氷冷 PBS でいっぱい。
注: 次の 2 つの手順この時計ガラスの解剖顕微鏡下で実行されます。 - 幼虫の中央部を優しくつかむ鉗子を使用します。口フックを取得し、別の体の残りの部分から脳を含む幼虫の前方の部分に優しく口フックを引くもう一つの鉗子を使用します。
注: また、外科はさみ使用できます。 - 鉗子で前方の先端を押し、幼虫を裏返しします。成虫ディスク、脂肪体、リング腺など、脳に付着した余分な組織を削除します。口器から脳を優しきます。
- 200 μ L の PBS をイメージングの商工会議所のパテのような再利用可能な接着剤は、リングの内側に適用されます。パスツール ピペットに PBS で切り裂かれた脳を優しく吸うし、部屋に転送。
- 部屋に脳を設定
- 鉗子を使用して、腹側の神経節から伸びる筋線維をつかみます。タングステン線の下に凹みに脳をゆっくり挿入します。
- プル タングステン線は別鉗子を使用すると、(図 1) をイメージングのため適切な位置に脳にもわずかに配置しています。
2. Ca2 +蛍光画像の取得
注: 脳外植片 PBS 中に浸漬、水浸対物レンズ × 20 を搭載した蛍光顕微鏡を使ってイメージ化 (n. a. = 0.5)。PBS は、脳細胞をアクティブにしません。Z 軸のイメージが必要な場合圧電アクティブ レンズ発動機を対物レンズを搭載します。回転のディスク共焦点ヘッドは、時間分解能を高めるために使用されます。低光イメージングのため電荷結合素子カメラを掛けて電子顕微鏡がマウントされます。GCaMP6s 蛍光イメージング (励起/蛍光: 488/509 nm) 励起発光フィルターとダイクロイック ビーム ・ スプリッターの 488 nm レーザーが必要です (e.g。, 528 ± 38 nm 帯域バンドパス フィルター)。
- 顕微鏡下で脳外植体を含むイメージングのチャンバーを配置します。
- それが PBS に触れるまでは、対物レンズを下げます。明視野照明下における脳の位置し、焦点に持って来る。蛍光灯に切り替えて、GCaMP6s というラベルの付いたセルにフォーカスを調整します。
注: GCaMP6s の基部の緑の蛍光性が見えるはずです。 - 250 ms で集録を開始/水冷モードで適正な取得ソフトウェアを使用して 512 × 512 ピクセルの解像度でフレーム (e.g。、µManager)。16 ビット画像 (ダイナミック レンジ 0 65,535) と CCD カメラのダイナミック レンジ内の蛍光値を取得がない 1000 (任意の単位) より低い露出時間を調整します。
注: GCaMP6s の光退色を最小限に抑える低露光時間を使用ください。露光時間を最適化して、GCaMP6 の発現と検出システムの感度にかかっており各実験でください。それは私たちを用いた実験で 100 ms dilp2 > GCaMP6s です。Z セクションが指定した深さでイメージングに必要ないくつかの z 断面画像は露出時間とフレームの間隔によって取得できます。カメラに十分な空間分解能がある場合は、露出時間を短縮するビニング サイズ (1 つデジタル ピクセルにビンがオンチップ レジスタの数) を増やしてください。 - 撮像パラメーターが決まったら、基準信号強度 (F0) を検出するペプチド投与前に、1 分の画像を取る。
- テスト ペプチドを適用します。このため、PBS におけるペプチド溶液 100 μ L を溶解し、最適濃度をもたらす幼虫お風呂に直接ピペットします。
注: ペプチド ソリューションゆっくり注入する必要があります (例えば流率 20 μ L/s) にピペットを使用してバス ソリューション。PBS に溶解した無関係の合成ペプチドは、ネガティブ コントロールとして使用されます。 - 数分の GCaMP6s 排出量を記録します。
3. データ分析
注: 画像データは、ImageJ とオフライン分析されます。時間経過イメージ投射の間を移動する幼虫の脳を引き起こすピペッティングします。したがって、解析の前にシリアルの画像の位置異常を修正必要があります。補正は、ImageJ、プラグイン、TurboReg を次のように使用して実行できます。
- 解析ソフトウェアを開き、参照イメージとして (ペプチッドのアプリケーション) の前に最初のフレームを使用します。
- プラグインを選択 |登録 |TurboReg。
- ソースとしてシリアル イメージ ファイルとターゲットとして参照イメージを選択します。
- それぞれ剛体(平行変位と画像の回転) と正確性(「高速」は代わりに高速な解析粗いです) を処理方法と品質を確認します。
- バッチ画像処理を開始するをクリックします。
- 分析を用いた関心 (ROIs) の複数の領域を選択 |ツール |ROI マネージャー ImageJ で。
- もっとをクリックしてピクセル強度を測定 |マルチ メジャー |OK ROI マネージャー] ウィンドウで。
- 計算 ΔF/F0 = (F - F0)/F0、どこ F ROI 強度刺激時と F0は特定の実験的イベントの直前の時間帯での強度 (例えば30 前のフレーム、刺激開始)。
- 複数の脳サンプルを使用して、平均と各時点での平均 (SEM) の標準エラーを取得する統計処理を行う実験を繰り返します。
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Representative Results
このプロトコルを使用すると、ペプチド ホルモン、CCHa2、インスリン産生細胞脳 (IPCs) の活性化を調べた。GCaMP6s とラベル付けされた野生型脳の IPCs dilp2 -GAL412 (ルイグソン博士からの贈り物) とUA GCaMP6s13 (キム博士からの贈り物) の組み合わせを使用します。合成 CCHa2 ペプチドと扱われた幼虫の脳外植体と GCaMP6s からの蛍光は、リアルタイムで記録されました。この実験では、1 つの焦点平面から画像を得た。各 IPC クラスターを含む約 14 セル14、および 3 から 6 セルまでの信号が検出されました。GCaMP6s 信号強度は CCHa2 管理 (図 2A、映画 1) に劇的に増加しました。野生型の脳はグレリンやノシセプチンに明らかな反応を示さなかった (映画 2 および 3、それぞれ)、ショウジョウバエ相同遺伝子のない哺乳類ペプチド ホルモンであります。CCHa2 で IPCs の観察されたライセンス認証が CCHa2 に固有の応答であることが示唆されました。CCHa2 CCHa2 R を通して行動するかどうかを明らかにするには、CCHa2 R 変異脳を使用して同様の分析を行った。突然変異体の脳 (映画 4) CCHa2 投与後その信号強度の増加は認められなかった。統計解析は、野生型とCCHa2 R変異脳信号強度の違い CCHa2 塗布後は 2 分以内で顕著となった、少なくとも 7 分 (図 2B) 維持したことを示した。IPCs は特にから CCHa2 R CCHa2 によってアクティブ化されるこれらの結果を示す本研究で使用されるすべてのペプチドは、収量 10-9 M の最終的な集中に PBS で希釈されました。
図 1.イメージング商工会議所
(A)は、小さなへこみとテザリング ロッド皿 (35 mm × 10 mm) を文化します。パテのような再利用可能な接着剤で作られた (B) リング状壁(C) A 幼虫脳植イメージング室に挿入します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.幼虫の脳外植体のカルシウム イメージング
野生型 (dilp2 Gal4/UA GCaMP6s) 脳は、CCHa2、グレリン、ノシセプチンにさらされました。CCHa2 R変異 (dilp2 Gal4 CCHa2 Rタル 34/UA GCaMP6s、CCHa2 Rタル 34) CCHa2 に脳がさらされました。IPCs で GCaMP6s 信号は 250 ms/フレーム共焦点顕微鏡法によって検出されました。まだ選択した時点の画像は、(A) に表示されます。画像は異なる信号強度を見やすくします pseudocolored.ΔF/F0時間の各ポイントでは、(B) でプロットしました。ΔF/F0は、10 の異なる準備に 5 から計算しました。・ ロワは、同じ面上で検出された細胞体に設定されました。5 に 10 のサンプルの平均値を示す実線と点線マーク平均の標準誤差の上限と下限の制限。影の部分は、実験では信号の変化を示します。スケール バーは、50 μ m を示します。図は、佐野らから適応15.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ムービー 1。CCHa2 にさらされる野生型 IPCsこのビデオを表示する15 をここでクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)
ムービー 2。グレリンにさらされる野生型 IPCsこのビデオを表示する15 をここでクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)
ムービー 3。ノシセプチンにさらされる野生型 IPCsこのビデオを表示する15 をここでクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)
映画 4.CCHa2 RCCHa2 にさらされる変異 IPCs15 このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
Ca2 +イメージング法は、ここで説明した脳のホルモンの機能をテストするための便利なシステムです。生体内で、脳は様々 な内分泌腺からホルモンを受け取ります。さらに、脳は常に自発神経活性化を引き起こす感覚情報を昇順を認識します。この前のヴィヴォシステムは、このようなノイズを排除し、生体内イメージングより良い信号/ノイズ比が得られます。このシステムは、単独または組み合わせて分子をテストできます。ペプチド ホルモンに加えて天然または合成化合物を含む任意の水溶性分子は脳外植体に適用できます。
Ca2 +イメージング、脳外植片が係留される必要があります。ポイントの低融点アガロースこの目的のため作られたゲルのマトリックスまたはフィブリンが従来の16,17。これらのゲルのマトリックスがサンプルを安定保持できる、30 ° C 以上に組織を加熱するただし、この温度は、昆虫などの poikilothermic の動物の熱ショック応答を引き起こします。熱ストレスを避けるためには、脳を物理的に係留することができます。キューティクルに接続されている脳は、昆虫ピン18に固定されます。タングステン線を用い, 提案法は、シンプルで安定したサンプルの保持を提供します。このシステムが準備を簡単で再利用、および覚醒剤ゲルを埋め込み法と比較してより簡単に標的細胞に到達することができます。したがって、これはリガンドのスクリーニングのため役に立つでしょう。
蛍光指示薬の選択は、ターゲット ニューロン受容体ニューロンと取り上げられている生物学的質問で表される型の型によって異なります。様々 な時間的 Ca2 +動態を検出するために最適化された GCaMP6 亜種のシリーズは、生成された13をされています。特に、GCaMP6 亜種は、その応答速度: GCaMP6s (低速)、GCaMP6m (中) と GCaMP6f (高速)。GCaMP6s と 6 m の減衰時間が比較的遅い (すなわち。、海馬スライス標本における 10 活動電位後 τ1/2 ) 一方、GCaMP6f は高速 (τ1/2 1 活動電位の後)。EPAC キャンプ (キャンプ)、シナプト pHluorin (シナプス リリース)、アークライト (膜電位)19,20,21などの他の種類の神経活動のできる蛍光インジケーター。これらの遺伝的コード化蛍光プローブは、特定の細胞型で表現できます。Ex vivoイメージング システムしたがって、機能目的ニューロンで様々 な反応を検出できます。
このプロトコルではいくつかの重要な手順があります。最初に、余分な組織は、明確な画像を得るには、脳から削除する必要があります。シャープ鉗子、手術用はさみの使用は、繊細な作業を軽減します。第二に、切り裂かれた脳は位置に固定する必要があります。時折、脳のサンプルは、若干 (範囲約 5 μ m) をピペッティングから移動します。脳の移動を防ぐために脳サンプルのサイズにイメージングのチャンバーにタングステン線の高さを調整する必要があります。また、重力フィード灌流システムは、穏やかな刺激のインストールでした。第三に、脳機能イメージングの結果は慎重に解釈すべき。配位子の脳に適用可能性があります順番ターゲット ニューロンをアクティブに可能性があります予期しないニューロンを刺激します。特定のニューロンにホルモンの直接の影響を検出するには、受容体必要があることをノックダウン、targetneurons で。この場合、蛍光指示薬の式は、RNAi Gal4/UAS システムを使用して受容体のと組み合わせることができます。
このプロトコルのマイナーな制限は、イメージングの期間は脳サンプルの最終的な損傷のため限られることです。私たちの手では、このプロトコルを使用して約 60 分までのショウジョウバエ脳をイメージすることができます。HL3.1 生理食塩水22やレーザー強度など、体液のようなソリューションが長期的なイメージングを有効にします。さらに、現在の画像の設定は同じサンプルの反復的な刺激のため適していません。そのような実験の灌浴をされる可能性があります。
最後に、このプロトコルには、さまざまなアプリケーションがあります。部屋を変更すると、成人の脳と他のショウジョウバエのティッシュまたは他の動物の組織を描出できた。非モデル生物における遺伝的ツールの欠如したゲノムに蛍光プローブを導入することは困難。しかし、最近開発された CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術は、これらの動物の遺伝子工学への扉を開いています。したがって、このプロトコルが使用して、臓器間シグナル動物の広い範囲を勉強します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は費補助金科学研究 (15 K 07147、17 K 07419) 日本学術振興会から (洋石本、佐野寛子) (HI) に稲盛財団研究助成金、共同利用・共同研究センターのプログラムでサポートされる発生発達医学分子発生学・遺伝学 (HS) に熊本大学研究所。イメージング システムを使用して彼らの助け、上川内あづさ先生と山田大地さんに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
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