Summary
Detta dokument beskriver ett protokoll för ex vivo kalcium avbildning av hjärnan som Drosophila . Den här metoden kan naturliga eller syntetiska föreningar tillämpas på bufferten att testa sin förmåga att aktivera särskilda nervceller i hjärnan.
Abstract
Orgel-till-organ kommunikation av endokrin signalering, exempelvis är från periferin till hjärnan, väsentliga för att upprätthålla homeostas. Som en modell djur för endokrina forskning används Drosophila melanogaster, som har avancerad genetiska verktyg och genominformationen, alltmer. Denna artikel beskriver en metod för kalcium bildtagning av Drosophila hjärnan bladsticklingar. Denna metod möjliggör upptäckt av den direkta signalering av ett hormon till hjärnan. Det är väl känt att många peptidhormoner agera via G-protein-kopplade receptorer (varandra), vars aktivering orsakar en ökning i den intracellulära Ca2 +koncentrationen. Neural aktivering höjer också intracellulära Ca2 + nivåer, från både Ca2 + tillströmning och frisläppandet av Ca2 + lagras i det endoplasmatiska retiklet (ER). En kalcium-sensor, GCaMP, kan övervaka dessa Ca2 + förändringar. I denna metod, GCaMP uttrycks i nervceller i intresse, och GCaMP-uttryckande larval hjärnan är dissekeras och odlade ex vivo. Test peptiden tillämpas sedan på den hjärnan explant och fluorescerande förändringarna i GCaMP upptäcks med snurrande skiva confocal Mikroskop utrustat med en CCD-kamera. Med den här metoden någon vattenlöslig molekyl kan testas och olika cellulära händelser associerade med neural aktivering kan avbildas med hjälp av lämpliga fluorescerande indikatorer. Dessutom genom att ändra imaging kammaren, kan denna metod användas för att bild andra Drosophila organ eller organ av andra djur.
Introduction
Orgel-till-organ kommunikation är en evolutionärt bevarade strategi för att upprätthålla homeostas för att klara av miljöförändringar. Människa, en mängd hormoner arereleased från endokrina körtlar i cirkulationen. Många av dessa hormoner rikta hypotalamus i hjärnan som reglerar metaboliska processer och grundläggande beteenden såsom utfodring1,2. Många hormoner har upptäckts med hjälp av däggdjur modeller. Deras verkningsmekanismer, särskilt de interorgan nätverken som de deltar, är dock fortfarande till stor del oklart.
Drosophila melanogaster har vuxit fram som en användbar modell för att studera orgel-till-organ kommunikation. Hos insekter styrs många fysiologiska processer av hormoner. Tidiga studier med fokus på tillväxt och metamorfos används stora insekter. I dessa studier förutspådde flyttning eller transplantation av specifika organ existensen av Inter orgel signalmolekyler; senare, var Juvenile hormon (JH), Prothoracicotropic hormon (PTTH) och Ecdysone biokemiskt renat3,4,5. En stor familj av intercellulära signalering peptider tros vara inblandade i olika fysiologiska händelser under insekt livscykel6,7. De flesta av dessa peptider agera på G-proteinkopplade receptorer (varandra), även om de specifika varandra var inledningsvis svårt att identifiera med hjälp av konventionella metoder. Offentliggörandet av Drosophila hela arvsmassan sekvens8 var det genombrott som aktiverat identifiering av Drosophila bioaktiva peptider baserat på deras homologi de som finns i andra insekter. Dessutom identifierades receptorerna för flera peptider från varandra förutspådde i genomet med cell-kultur-baserade GPCR-ligand bindande analyser. Nästa, förutspådde uttryck analyser orgel-till-organ pathways framkallas av dessa peptider och receptorer. Särskilt uttrycks många av de förmodade peptid-receptorerna i hjärnan, vilket tyder på att hjärnan är ett viktigt mål av peptid hormoner9. Dessutom har de avancerade genetiska verktyg i Drosophila bidragit till identifiering av fysiologiska roller av peptid-GPCR kombinationer. Exempelvis aktivera den GAL4 och LexA-baserade binära transkriptionell system gen knockdown eller överuttryck i ett spatialt och temporalt kontrollerat sätt. GAL4, en transkriptionsfaktor som identifierats i jäst, binder till en specifik cis-reglerande sekvens som kallas uppströms aktivering sekvensen (UAS). I GAL4/UAS-systemet driver linjen ger vävnadsspecifika eller scenen-specifika GAL4 uttryck och responder raden bär UAS uppströms av genen av intresse eller konstruktionen till drive shRNA uttryck. LexA/LexAop systemet bygger på en liknande mekanism. Fenotypiska analyser av vävnadsspecifika peptid-knockdown och vävnadsspecifika GPCR-knockdown djur kan avslöja information om den peptid-GPCR signalering läge och platsen för åtgärden. De slutsatser som kan nås endast av genetiska data är dock begränsade. Däremot, när förmodad mål för en viss peptidhormon är minskat ner till en vävnads- eller typ, kan ex vivo kalcium imaging i orgel bladsticklingar användas att belysa orgel-till-organ kommunikationen medieras av peptid-GPCR signalering. Vid aktivering av en Gq-kopplade GPCR ökas intracellulära Ca2 + koncentrationen på grund av frisläppandet av Ca2 + från ER10. I hjärnan höjer neural aktivering också de intracellulära Ca2 + nivåerna. Sådana Ca2 + prishöjningar kan upptäckas genom en kalcium-sensor, GCaMP, som genomgår en konfirmerande förändringar i närvaro av Ca2 + resulterar i fluorescens utsläpp11.
I den här artikeln beskrivs en kalcium bildgivande metod med Drosophila hjärnan explants. För att testa en peptid förmåga att aktivera specifika nervceller, en test peptid tillämpas på den GCaMP-uttryckande hjärnan explant och fluorescens förändringar övervakas av konfokalmikroskopi. Medverkan av GPCR bekräftas då genom att utföra samma analysen använder en mutant hjärna saknar GPCR. Denna kombination av imaging och genetik ger exakt information om orgel-till-organ kommunikation av peptider-varandra. möjliga ändringar och tillämpningar av detta protokoll diskuteras också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Larval hjärnan bladsticklingar
- Göra en tänkbar kammare.
Obs: Stabil inspelning kräver att de hjärnan bladsticklingar vara uppbundna. Här används en låg kostnad, handgjorda imaging kammare Ca2 + imaging system.- Med pincett, skrapa längst ned i mitten av en plast kultur maträtt (35 x 10 mm) att skapa en buckla för den ventrala ganglion av larval hjärnan att göra lättare montering (steg 1.3, figur 1).
- Med en tandpetare, placera en liten droppe superlim på vardera sidan av buckla och bifoga en volfram rod (0,125 mm diameter, 6 till 7 mm längd) till limmet.
- Gör en cirkulär vägg (10 mm i diameter och 3 mm hög) använder en liten bit av kittliknande återanvändbara lim, och omgivande buckla (figur 1).
Obs: Utrymmet inuti väggen kommer senare fyllas med fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 0,14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0,01 M PO43-, pH 7,4 ± 0,05 vid 25 ° C).
- Djur förberedelse
Obs: För kalcium imaging, en indikator för kalcium, GCaMP6s, uttrycks i celltyp av intresse, vilket uppnås vanligen med hjälp av kombinationer av vävnad-specifika GAL4 och UAS-GCaMP6s. För att säkerställa att signalen medieras via den kandidat receptorn, uttrycks GCaMP6s också i en mutant som är defekta i receptorn.- När experimentella jämförelser för olika genotyper som vildtyp och mutanter krävs nivå ålder match test larver att undvika GCaMP6 uttryck variationer och fysiologiska skillnader på grund av utvecklingsstadier.
- Hålla föräldraledighet flugor (30 flugor för varje kön) i en kultur injektionsflaska innehållande standard flyga mat för 8 h att äggläggningen på ytan av maten. Kultur-larver i mass under en 12-h ljus-mörker cykel vid 25 ° C och 60-70% relativ luftfuktighet.
- Dissektion av larval hjärnan
- På 90-120 h efter värpning (AEL), samla larver och tvätta dem minst 3 gånger med destillerat vatten för att avlägsna fastsittande matrester.
- Plats en larv på ett torg 1,5-tums urglas fylld med is kallt PBS.
Obs: Nästa två steg utförs i denna urglas under mikroskopet dissekera. - Använd tången för att försiktigt ta tag i den mellersta delen av larven. Använd en annan pincett att greppa mun krokar och dra munnen krokarna försiktigt för att separera den främre delen av larven som innehåller hjärnan från resten av kroppen.
Obs: Alternativt kirurgisk sax kan användas. - Håll den främre spetsen av tången och vrid larven inifrån och ut. Ta bort främmande vävnad kopplad till hjärnan, såsom imaginal diskar, fett organ och ring körtel. Försiktigt separera hjärnan från mouthparts.
- Tillämpas 200 µL av PBS på insidan av ringen av kittliknande återanvändbara limmet i imaging kammaren. Försiktigt suga dissekerade hjärnan med PBS i en Pasteur-pipett, och sedan överföra det in i imaging kammaren.
- Ställa in hjärnan i imaging kammare
- Använda pincett för att greppa muskelfibrer sträcker sig från de ventrala ganglierna. Sätt hjärnan försiktigt i buckla under volframtråd.
- Använder en annan tång, dra volframtråd placera något upp till hjärnan på rätt position för imaging (figur 1).
2. förvärv av Ca2 + fluorescens bilder
Obs: Hjärnan bladsticklingar nedsänkt i PBS är avbildade med fluorescens Mikroskop utrustad med en 20 X nedsänkning i vatten objektiv (N.A. = 0,5). PBS aktiveras inte celler i hjärnan. Om z-bilder behövs, är objektivet monterad med en piezoelektrisk-aktiverat lins mover. En snurrande skiva confocal huvudet används för att förbättra tidsupplösningen. För låg-ljus imaging, är en elektron att multiplicera kostnad – tillsammans enhetens kamera monterad på mikroskopet. Bildtagning av GCaMP6s fluorescens (excitation/utsläpp: 488/509 nm) kräver en 488-nm laser för excitation med en dikroisk stråldelare och ett utsläpp filter (t.ex., 528 ± 38 nm bandet bandpassfilter).
- Placera imaging kammaren som innehåller den hjärnan explant under mikroskopet.
- Sänk objektivet tills det berör PBS. Under ljusa fält belysning, placera hjärnan och föra in i fokus. Växla till fluorescerande ljus och justera fokus på GCaMP6s-märkt cellerna.
Obs: Den basala grön fluorescensen av GCaMP6s ska synas. - Starta förvärv på 250 ms/ram med en upplösning på 512 × 512 pixlar i vattenkylda läge med hjälp av lämpliga förvärv programvara (t.ex., µManager). Justera exponeringstid att erhålla fluorescens värden inom det dynamiska omfånget av den CCD-kameran, men inte lägre än 1000 (godtyckliga enheter), med 16-bitars bilder (dynamisk intervall 0-65 535).
Obs: En låg exponeringstid bör användas för att minimera foto-blekning av GCaMP6s. Exponeringstid bör optimeras i varje experiment eftersom det beror på uttrycksnivåerna för GCaMP6 och känslighet för upptäckande. Det var 100 ms i våra experiment med dilp2 > GCaMP6s. När z-avsnitten krävs för en given imaging djup, kan flera z-avsnittet bilder fås beroende på exponering tid och ram intervall. Om kameran har tillräckligt rumslig upplösning, bör binning storlek (antal register på det chip som kommer att kastas in i en digital pixel) höjas för att minska exponeringstiden. - När imaging parametrar bestäms, ta bilder för 1 min innan peptid administration att upptäcka baslinjen signal intensiteter (F0).
- Tillämpa testet peptiden; för detta, Lös 100 µL av peptid lösning i PBS och Pipettera det direkt till larval badet att ge en optimal koncentration.
Obs: Peptid lösningen skall injiceras långsamt (t.ex., flöde klassar 20 µL/s) i Bad lösning med pipett. Orelaterade syntetisk peptid upplöst i PBS används som en negativ kontroll. - Posten GCaMP6s utsläpp i några minuter.
3. dataanalys
Obs: Imaging data analyseras offline med ImageJ. Under time-lapse bildtagning orsakar pipettering larval hjärnan att flytta. Positionella avvikelser av de seriella bilderna bör därför rättas före analys. Korrigeringen kan utföras med en ImageJ plug-in, TurboReg enligt följande.
- Öppna programvaran analys och använda den första bildrutan (före tillämpning av peptid) som en referensavbildning.
- Välj Plugins | Registrering | TurboReg.
- Välj seriell bildfilen som källa och referensbilden som mål.
- Kontrollera Stel kropp (parallell förskjutning och rotation av bilder) och korrekt (”snabb” är grovt men snabb analys istället) för bearbetningsmetod och kvalitet, respektive.
- Klicka på Batch om du vill starta bildbehandlingen.
- Välj flera regioner av intresse (ROIs) genom att använda analysera | Verktyg | ROI Manager i ImageJ.
- Mäta pixel intensiteten genom att klicka på mer | Multi åtgärd | OK i fönstret ROI Manager.
- Beräkna ΔF/F0 = (F - F0) f0, där F är ROI intensiteten på tiden av stimulansen och F0 är intensiteten på ett tidsfönster omedelbart före en experimentell händelse (t.ex. 30 bildrutor före den Stimulus debut).
- Upprepa försöket med hjälp av flera samplingar med hjärnan, genomföra statistisk bearbetning för att få det medelvärdet och standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) vid varje tidpunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av detta protokoll, undersöktes aktivering av hjärnans insulinproducerande celler (IPCs) av peptiden hormonet, CCHa2. IPCs av vildtyp hjärnan var märkt med GCaMP6s med en kombination av dilp2 -GAL412 (gåva från Dr Rulifson) och UAS-GCaMP6s13 (gåva från Dr. Kim). Larval hjärnan bladsticklingar behandlades med en syntetisk CCHa2 peptid, och fluorescensen från GCaMP6s spelades i realtid. I detta experiment erhölls bilder från en enda fokalplan. Varje IPC kluster innehåller runt 14 celler14och signaler från 3 till 6 celler upptäcktes. GCaMP6s signal intensiteten ökade dramatiskt vid den CCHa2 administrationen (figur 2A, film 1). Vildtyp hjärnor visade inte ett tydligt svar på Ghrelin eller Nociceptin (film 2 och 3, respektive), som är däggdjur peptidhormoner utan en Drosophila homologt. Dessa resultat indikerar att den observerade aktiveringen av IPCs av CCHa2 är ett specifikt svar på CCHa2. För att klargöra huruvida CCHa2 agerar genom CCHa2-R, utfördes samma analys med CCHa2-R mutant hjärnor. Ingen sådan ökning i signal intensiteten observerades efter CCHa2 administrering i mutant hjärnor (Movie 4). Statistisk analys visade att skillnaden i signalintensitet mellan vildtyps- och CCHa2-R mutant hjärna blev betydande inom 2 min efter CCHa2 ansökan och upprätthölls under minst 7 min (figur 2B). Dessa resultat indikerar att IPCs aktiveras specifikt av CCHa2 genom CCHa2-R. Alla peptider som används i denna studie var utspädd av PBS att ge en slutlig koncentration på 10-9 M.
Figur 1 . Imaging kammare
(A) kultur maträtt (35 x 10 mm) med en liten buckla och tjudra rod. (B) Ring-formad vägg av kittliknande återanvändbara lim. (C) en larval hjärnan explant infogas i imaging kammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Kalcium avbildning av det larval hjärnan explant
Vildtyp (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) hjärnan utsattes för CCHa2, Ghrelin och Nociceptin. CCHa2-R mutant (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) hjärnan utsattes för CCHa2. GCaMP6s signaler i IPCs upptäcktes av konfokalmikroskopi på 250 ms/ram. Fortfarande visas bilder av valda tidpunkter i (A). Bilderna var pseudocolored bättre visualisera olika signal stödnivåer. ΔF/F0 vid varje tidpunkt var ritade i (B). ΔF/F0 beräknades från 5 till 10 olika preparat. ROIs sattes på cellen organ som upptäcktes i en samma fokalplan. De heldragna linjerna visar medelvärdet av 5 till 10 prover och de streckade linjerna markerar övre och undre gräns för standardavvikelsen för medelvärdet. De skugga områdena visar variationen av signalerna i experimenten. Skalstapeln anger 50 µm. Siffran är anpassade från Sano o.a. 15. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Film 1. Vildtyp IPCs utsätts för CCHa215 Klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film 2. Vildtyp IPCs utsätts för Ghrelin15 Klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film 3. Vildtyp IPCs utsätts för Nociceptin15 Klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Movie 4. CCHa2-R Mutant IPCs utsätts för CCHa2 15 Klicka vänligen här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Ca2 + imaging metod som beskrivs här är ett användbart system för att testa funktionen av hormoner i hjärnan. In vivo hjärnan tar emot hormoner från olika endokrina organ. Dessutom uppfattar hjärnan ständigt stigande sensorisk information, vilket orsakar spontan neuronal aktivering. Detta ex vivo -system eliminerar sådant buller och ger ett bättre signal/brus-förhållande än i vivo imaging. I detta system, kan molekyler testas enskilt eller i kombination. Utöver peptidhormoner, kan eventuella vattenlösliga molekyler, inklusive naturliga eller syntetiska föreningar, tillämpas på den hjärnan explant.
För Ca2 + imaging behöver hjärnan bladsticklingar vara bundna. För detta ändamål en gelmatris gjord av låg-smältande punkt agaros eller fibrin har använts tidigare16,17. Dessa gel matriser kan hålla provet stabilt, dock vävnader är uppvärmd till 30 ° c. Denna temperatur orsakar ett värme-chock svar i poikilothermic djur som insekter. För att undvika värmestress, kunde hjärnan vara uppbundna fysiskt. Hjärnan bifogas nagelbanden är fäst med insekt stift18. Vår metod att använda en volframtråd ger enkel och stabil innehav av provet. Detta system är lätt att förbereda och återanvändbara och tillåter stimulantia att nå målceller lättare jämfört med gelen inbäddning metod. Sålunda, detta kommer att vara användbart för ligand screening.
Valet av fluorescerande indikatorn beror på vilken typ av mål nervceller, typ av receptorer uttrycks i neuron och biologiska frågor behandlas. En rad GCaMP6 varianter optimeras för att upptäcka olika temporala Ca2 + dynamics har varit genererade13. I synnerhet GCaMP6 variantsna skilja sig åt i deras svar kinetik: GCaMP6s (långsam), GCaMP6m (medium), och GCaMP6f (snabb). Decay tider för GCaMP6s och 6m är relativt långsam (dvs., τ1/2 efter 10 handlingspänningar i en Hippocampus slice beredning) medan som för GCaMP6f är snabb (τ1/2 efter 1 aktionspotential). Andra typer av tillgängliga fluorescerande indikatorer för neural aktivitet inkluderar EPAC-cAMP (cAMP), Synapto-pHluorin (synaptic release) och ArcLight (membranpotential)19,20,21. Dessa genetiskt kodade fluorescerande indikatorer kan uttryckas i specifika celltyper. Således kan den ex vivo imaging system upptäcka olika svaren i önskad nervceller.
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll. Första, främmande vävnad måste tas bort från hjärnan för att få en tydlig bild. Användning av vass pincett och kirurgisk sax underlättar det känsliga arbetet. Det andra ska dissekerade hjärnan fixeras i position. Ibland flyttar hjärnan provet något från pipettering (mellan ca 5 µm). För att förhindra hjärnan från att flytta, bör höjden av volframtråd i imaging kammaren anpassas till storleken på hjärnan provet. Alternativt kunde ett allvar-feed perfusion system installeras för skonsam stimulering. För det tredje, resultaten av hjärnavbildning bör tolkas med försiktighet. Liganden tillämpas på hjärnan kan stimulera oväntade nervceller, som i sin tur kunde aktivera target nervceller. För att upptäcka den direkta effekten av ett hormon på specifika nervceller, receptorn bör vara bankat-ned i targetneurons. I detta fall kan uttrycket av fluorescerande indikatorn kombineras med receptorn RNAi använder Gal4/UAS-systemet.
En mindre begränsning av detta protokoll är att varaktigheten av imaging är begränsad på grund av eventuella skador på hjärnan provet. I våra händer kan Drosophila hjärnan avbildas för upp till ca 60 min användning av detta protokoll. Hemolymph-liknande lösning, till exempel HL3.1 saline22och laser stödnivåer kunde aktivera långsiktiga imaging. Dessutom är aktuella imaging inställning inte lämplig för repetitiv stimulering av samma prov. För sådana experiment, kan badkar perfusion användas.
Slutligen har detta protokoll olika applikationer. Genom att ändra imaging kammaren, kunde den vuxna hjärnan och andra Drosophila vävnader eller vävnader av andra djur avbildas. I icke-modellorganismer, har avsaknaden av genetiska verktyg gjort det svårt att införa fluorescerande indikatorer i genomet. Dock har nyligen utvecklat CRISPR/Cas9 genomet redigering tekniker öppnade dörren till genteknik i dessa djur. Således kunde detta protokoll användas för att studera inter orgel signalering i ett brett utbud av djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds av Grants-in-Aid för vetenskaplig forskning (15K 07147, 17K 07419) från JSPS (att Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), en Inamori Foundation forskningsanslag (till HI), och programmet för gemensam användning/Research Center for Developmental Medicine, på av Institutet för molekylär embryologi och genetik, Kumamoto universitetet (till HS). Vi tackar Dr. Azusa Kamikouchi och Mr Daichi Yamada för deras hjälp med att använda imaging system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
- Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S.
- Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).
- Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).
- Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).
- Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
- Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
- Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Sabado, V. aN., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
- Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
- Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
