Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering af Synaptic grænsefladen af primære menneskelige T celler fra perifert blod og lymfoide væv

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/58143
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 4
1Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 2Department of Microbiology and Institute for Immunology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital Huddinge, 4Departments of Microbiology and Immunology and Medical Oncology, Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

Summary

Protokollen beskriver en teknik til at studere primære polyklonale humane T celler evne til at danne synaptic grænseflader ved hjælp af planar lipid dobbeltlag. Vi bruger denne teknik til at vise den differentiale synapse dannelse evne til menneskelige primære T celler, der stammer fra lymfeknuder og perifert blod.

Abstract

Den nuværende forståelse af dynamikken og strukturelle funktioner af T-celle synaptic grænseflader har været stort set beslutsomme ved hjælp af glas-støttede planar dobbeltlag og i in vitro-afledte T-celler kloner eller linjer1,2 ,3,4. Hvordan disse konklusioner gælder for de primære humane T celler isoleret fra blod eller lymfoide væv er ikke kendt, dels på grund af betydelige vanskeligheder med at opnå et tilstrækkeligt antal celler for analyse5. Her løse vi dette gennem udvikling af en teknik, udnytte multikanals flow dias for at opbygge planar lipid dobbeltlag indeholdende aktivering og vedhæftning molekyler. Den lave højde flow dias fremmer hurtig celle sedimentering for at synkronisere celle: tolagede udlæg, hvorved forskere til at studere dynamikken i synaptic interface dannelse og kinetik af granulat frigivelse. Vi anvender denne metode til at analysere synaptiske grænsefladen af så få som 104 til 105 primære befrugtede T celler isoleret fra perifert blod (PB) og lymfeknuder (LN). Resultaterne viser, at romanen planar lipid tolagede teknik gør det muligt for studiet af de biofysiske egenskaber af primære menneskelige T cellerne stammer fra blod og væv i forbindelse med sundhed og sygdom.

Introduction

Videnskabelig viden om de strukturelle egenskaber af T-celle immun synapser og tilknytning til den funktionelle aktivitet af T-celler er blevet genereret primært fra studiet af cellelinjer og kloner stammer fra PB. I hvilken grad disse konklusioner vedrører primære T celler fremstillet af blod eller lymfoide væv er fortsat uklart, da de synaptiske grænseflader af T-celler bosat i lymfoide og andre væv ikke er blevet analyseret hidtil. Vigtigere, tyder nye oplysninger på, at væv er hjemmehørende og lymfoide-orgel-afledte T celler kan have betydelige forskelle i deres fænotype og funktionel aktivitet sammenlignet med dem i PB6,7. Dette er yderligere størknet behovet for bedre at forstå funktionerne af T-celle synaptic grænseflade i primære humane T celler.

Til dette formål har vi udviklet en roman mini skala tilgang udnytter lipid dobbeltlag indbygget i multikanals flow dias gør det muligt for os at udføre billeddannelse af T-celle/tolagede grænseflader med mindre end 105 primære T celler isoleret fra menneskelige PB og LN. Denne nye teknik giver mulighed for undersøgelse af primære human T-celle synaptic grænseflader for at bedre model og forstå i vivo celle-celle interaktioner biofysiske egenskaber.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagerne, og blod og lymfeknude prøver blev erhvervet med godkendelse af den institutionelle Review Board på University of Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Alle forsøgspersoner blev voksne. Ledning blodprøver blev venligst leveret af arbejdskraft og levering af Institut for Obstetrik og Gynækologi ved Thomas Jefferson University. Alle prøver blev de identificerede.

1. isolering af CD4+ T-celler for en billedanalyse

  1. Tø 1 mL alikvot del indeholdende 107 frosne perifert blod mononukleære celler (PBMC) eller lymfeknude mononukleære celler (LNMCs) fra indsamlede prøver. I en steril hætte, tilføje optøede cellerne til 9 mL RPMI suppleret med penicillin/streptomycin og glutamin.
    1. Centrifugate celler i 10 minutter ved 300 x g ved 4 ° C, Aspirér supernatanten, og pelleten celler i 5 mL af suppleres med RPMI som indeholder 10% FBS (komplet medium). Inkuber celler natten over i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
  2. Den næste dag, rense CD4+ T celler ved negative immunomagnetic sortering ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit efter fabrikantens anvisninger.
  3. Til at måle antallet af frisk renset CD4+ T celler, mix 5 µL af cellesuspension med et lige saa stort volumen af en trypan blå løsning. Indlæse en hemocytometer med en celle-trypan blå blanding og tælle de levende celler inde i 5 afsnit af hemocytometer.
  4. Tage gennemsnittet af celle nummer og bestemme antallet af celler i den oprindelige cellesuspension: antallet af celler/1 mL = det gennemsnitlige antal x 2 x 104. Hvis det samlede antal isolerede celler er for lille, bruge cellerne, som er uden at medregne.
  5. Centrifugeres celler på 300 x g i 10 min. og resuspend dem i en analysebuffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glucose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2og 1% human serumalbumin) på 105 < /C13 > celler/50 µL eller mindre og holde cellerne ved 4 ° C (for 1-2 h) indtil klar til brug i eksperimenter.
  6. Bortskaf alle biologisk affald ifølge de relevante institutionelle retningslinjer.
  7. Hvis det ønskes som en kontrol celle population, forberede aktiverede CD8 T celler fra navlestrengsblod PBMC, placere 107 celler i 5 mL af komplette mellemstore i en T25 kultur kolbe beklædt med en blanding af anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer på 10 µg/mL og 1 µg/mL , henholdsvis.
  8. Den næste dag, fjerne de aktiverede navlestrengsblod celler fra kolben, vaske dem 1 x med friske komplet medium og udvide cellerne i overværelse af rekombinant IL-2 (100 U/mL) for 2 uger.
  9. Rense navlestrengsblod CD8+ T celler ved negative immunomagnetic sortering ved hjælp af kommercielt tilgængelige kit efter fabrikantens anvisninger. Tælle cellerne og udskifter medier at analysebuffer som beskrevet i trin 1,3 – 1,6 for LN og PB CD8+ T celler.

2. komponenter til forberedelse af Planar Lipid dobbeltlag

  1. Forbered 3 slags Liposomer som beskrevet andetsteds5: a 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine) Liposomer, b 0.4 mM DOPC Liposomer som indeholder 33 mol % hunde-NTA (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic syre) succinyl] (ammoniumsalt)) lipider, (c) 0,4 mM DOPC Liposomer indeholdende 4 mol % Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(cap biotinyl) (natriumsalt)).
  2. Forberede 5% kasein løsning som tidligere beskrevet5.
    1. Opløses 5 g af kasein pulver i 100 mL i ultrarent vand og tilsættes 350 µL af 10 M natriumhydroxidopløsning. Omrøres alt på en regelmæssig magnetomrører med en langsom hastighed efter tilgængelige skala, ved stuetemperatur i 2 timer, og derefter natten over ved 4 ° C. PH indstilles til 7.3 og ultracentrifuge løsning til 2 h på 100.000 x g ved 4 ° C. Filtrer supernatanten med et 0,22 µm sterile filter og gemme løsningen i alikvoter ved-80 ° C.
      Forsigtig: natriumhydroxidopløsning kan forårsage kemiske forbrændinger og kan fremkalde permanent blindhed ved kontakt med øjnene. Brug gummihandsker, sikkerhedsbeklædning og øjenværn ved håndtering af dette kemikalie eller sine løsninger.
  3. Etiketten anti-CD3 antistof med biotin til at producere mono-bionylated antistof molekyler med en tidligere beskrevne fremgangsmåde8.
    1. Der fremstilles en opløsning af Biotin-PEO4-NHS i dimethylsulfoxid (DMSO) på 0,1 mg/mL. Tilføje 3,7 µL af opløsningen Biotin-PEO4-NHS til 1 mg af antistof i 0,5 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 100 mM natriumbikarbonat.
    2. Inkuber blanding i 2 timer ved stuetemperatur. Der fremstilles en opløsning af Alexa Fluor 488 NHS ester på 10 mg/mL i DMSO. Tilføje Alexa Fluor 488 NHS ester løsning til antistof mærket af Biotin-PEO4-NHS på en 10-fold kindtand overskydende.
    3. Inkuber blandingen i 1 time ved stuetemperatur med langsom omrøring på en regelmæssig magnetomrører. Særskilt ubundne farvestoffet bruger størrelse-udelukkelse kromatografi.
    4. Bestemme antistof koncentrationen ved at måle Ekstinktionen af opløsningen antistof på 280 nm (en280). Måling af Ekstinktionen af mærkede antistoffer på 577 nm (en577).
    5. Bestemme farvestof til antistof forholdet ved hjælp af følgende ligning:
      Equation
      Bemærk: Find yderligere detaljer i producentens protokol.
  4. Udtryk en rekombinant opløselige ICAM-1 protein i en Drosophila udtryk system som tidligere beskrevet3,4,9,10.
    1. Klon, med cDNA kodning, ectodomain af ICAM-1 i Drosophila udtryk vektor ydelse/V5-hans med en inducerbar metallothionein initiativtageren til at producere en rekombinant protein vedlagt med en hans6 tag på den C-terminale ende.
    2. Co transfect S2 celler med den deraf følgende ICAM-1 indeholdende plasmid og et G418 udtryk vektor. Vælg stabile transfectants ved hjælp af Schneiders Drosophila medier suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 0,5 mg/mL af G418 i 3 uger. Udvid celler i serumfrit insekt medium og fremkalde en protein udtryk med 0,5 mM CuSO4 for 3 d.
    3. Koncentrere kultur supernatanten 10 x og dialyze mod PBS via en tangential flow koncentrator som tidligere beskrevet11.
    4. Anvendelse af koncentreret kultur supernatanten til en kolonne, der indeholder Sepharose med en kovalent immobiliserede anti-ICAM-1 monoklonalt antistof og elueres den bundne ICAM-1 med en 50 mM glycin-buffer pH 3,0. Straks neutralisere den eluted ICAM-1 protein med en 2 M Tris buffer, pH 8,0.
    5. Dialyze det eluted materiale mod PBS, pH 8,0 og tilføje det dialyzed materiale til en kolonne indeholder Ni-NTA agarosegelelektroforese. Elueres opløselige ICAM-1 med 200 mM imidazol, pH 8,0. Dialyze det eluted materiale mod en PBS-buffer pH 8,0.
    6. Mærke den renset ICAM-1 med Cy5 NHS ester efter fabrikantens anvisninger.
      Bemærk: Det bedste endelige farvestof til protein forholdet er 1:1.
  5. Producere Fab fragmenter fra en anti-CD107a antistoffer af papain fordøjelse og rense Fab fragmenter af ionbyttende kromatografi som tidligere beskrevet3. Label Fab fragmenter med Alexa Fluor 568 NHS ester efter fabrikantens anvisninger.

3. dannelsen af glas-støttede Planar Lipid dobbeltlag

  1. Forberede en frisk sure piranha løsning ved at blande 140 mL koncentreret svovlsyre og 60 mL 30% hydrogenperoxid. Vaske glas coverslips for flow dias af iblødsætning dem i syre piranha løsning for 30 min. Hold glas coverslip med polypropylen scissor-type pincet.
    Forsigtig: Piranha løsning er en ekstremt stærkt oxidationsmiddel. Husk at bære sikkerhedsbriller eller beskyttelsesbriller eller en full-face skjold sammen med tyk gummihandsker på alle tidspunkter under håndtering løsningen. Kun arbejde med piranha løsning under et stinkskab. Undgå varme, transporterer eller ryster det på ethvert tidspunkt under brug, da det kan eksplodere. Indsamle piranha affald ind i en glasflaske med en bly-holdige hul. Kontakt den institutionelle sikkerhedsudvalg om ordentlig affald udnyttelse.
  2. Skyl den vasket coverslips 7 x med ultrarent vand ved at overføre dem sekventielt i bægre indeholdende frisk vand. Sæt de våde coverslips til side at lade de resterende vand roll off den rene glas, efterlader det tørre glas.
    1. Alternativt bruge en pipette tip knyttet til en vakuumpumpe til forsigtigt fjerne de resterende vanddråber fra coverslips.
  3. I den sterile hood, udføre fortyndinger af forskellige lipider at producere Liposom blandingen for at gøre dobbeltlag. Først, kombinere 37 µL af DOPC Liposomer og 3 µL af Biotinyl-Cap-PE Liposomer. For det andet mix 14 µL af DOPC Liposomer og 15 µL af hunde-NTA Liposomer. For det tredje tilføje 1 µL af den første blanding til 29 µL af den anden blanding til at fabrikere den endelige Liposom blanding.
  4. I sterile hætten, sætte op et arbejdsområde med tørre coverslips tæt ved. Alikvot 2 µL af den endelige Liposom blanding (Se trin 3.3) netop i midten af en selvklæbende dias kanal. Straks og meget præcist justere en ren og tør coverslip med diaset og sænk forsigtigt coverslip på den klistrede side af diaset.
    1. Hvis udarbejdelsen af mere end ét dias, arbejde på ét dias ad gangen, da Liposom blandingen fordamper hurtigt. Vend diasset og bruge den ydre ring af polypropylen scissor-type pincet til at anvende et let tryk til de perifere kontakt af coverslip med vandrutschebane, og sørg for, at slip er tæt knyttet til dias til hinder for lækage.
      Bemærk: Tryk ikke mod kanaler af dias til at undgå at bryde eller revner i coverslip.
    2. Drej diaset igen og markere placeringen af den dannede tolagede, som ligner en slip mellem coverslip og diasset kanal af tegning 4 prikker med en permanent markør rundt tolagede på den eksterne dias side af forsamlingen.
  5. Før den første injektion af en væske ind i kanalen, udpege en port af kanalen som indgang port og den anden som exit port og opretholde denne betegnelse i hele eksperimentet.
  6. For at undgå at danne bobler, indsætte slutningen af afpipetteres tip direkte til posten porten af kanalen. Langsomt fylde kanaler af diaset med 50 µL af varme (mindst stuetemperatur) analysebuffer (Se trin 1,5 til buffer sammensætning).
  7. Forberede en 0,5 M nickel(II) chloridopløsning. Tø en 2 mL alikvot af kasein løsning i et vandbad ved 37 ° C i 30 min og supplere den med en nikkel chloridopløsning i en endelig koncentration på 200 µM.
  8. Vaske dobbeltlag af første injektion 100 µL af kasein løsning i posten havn i kanalen og derefter straks at fjerne 100 µL ud af exit port på diaset af pipettering. Blokere dobbeltlag med samme løsning ved at indsprøjte 100 µL af opløsningen kasein i post-port i hver kanal og inkubere glideslidsen for 45 min ved stuetemperatur.
  9. Tø delprøver af Cy5-ICAM-1-hans6 og streptavidin proteiner. Kombinere proteiner i analysebuffer ved den endelige koncentration af 2 µg/mL hver. Der centrifugeres løsning for 30 min på 20.000 x g og 4 ° C for at fjerne enhver aggregater.
  10. Fjerne resten af den blokerende løsning fra exit port af dias kanal af pipettering. Indsprøjtes 100 µL af opløsningen indeholdende ICAM-1 og streptavidin i post-porten.
  11. Inkuber glideslidsen for 45 min ved stuetemperatur. Fjern overskydende protein løsning fra exit port. Vaske tolagede 2 x ved første injektion 100 µL af analysebuffer i posten havn i kanalen og derefter straks at fjerne 100 µL ud af exit port.
  12. Fortynde en Alexa-Fluor-488-mærket anti-CD3 antistof med analysebuffer til en slutkoncentration på 2 µg/mL. Indsprøjtes 100 µL af opløsningen antistof i post-porten af dias og Inkuber det i 45 min. ved stuetemperatur. Fjern overskydende protein løsning fra exit port. Vaske tolagede 2 x med 100 µL af analysebuffer som i trin 3.11.

4. billeddannelse af T celler interaktion med den plane tolagede

  1. Forvarm scenen og målet om en Konfokal eller total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskop, indtil temperaturen er ekvilibreres ved 37 ° C. Oprette dias med en bilayer(s) på den opvarmede scene. Flytte scenen til en passende position ifølge blæk mærker og fokusere på tolagede beskæftiger fluorescens af Cy-mærket ICAM-1 molekyler.
    1. Bruge en 61 X mål for Konfokal mikroskop eller et 100 X mål for JOHANNAS mikroskop, med passende filterindstillinger.
  2. Til granulet frigive billeddannelse af JOHANNAS mikroskopi, tilføje Alexa-Fluor-568-mærket anti-CD107a antistof Fab fragmenter til cellesuspension i en endelig koncentration på 4 µg/mL før injektion cellerne i post-portene.
    1. Resuspend den forberedte CD4+ T celler isoleret fra LN eller PB eller ledningen blod og injicere 50 µL af cellesuspension til dias kanalen indeholdende tolagede post-port.
  3. Vælg det ønskede antal felter og optage billeder af hvert felt 1 x hver 2 min i 30 min efter injektionen.
  4. Udnytte lysfelt, reflekteret lys og fluorescerende kanaler (Alexa 488 og Cy5) af Konfokal mikroskop til at erhverve billederne. Bruge JOHANNAS tilstand for Alexa-Fluor-488 og Alexa-Fluor-568 fluorescens og widefield for Cy5 fluorescens samt lysfelt imaging, på JOHANNAS mikroskop.

5. billedanalyse

  1. Analysere de erhvervede billeder ved hjælp af passende software. Observere celle morfologi i transmitteres lys billeder og udelukke grupperet og synligt beskadiget eller apoptotic celler fra analysen. Medtages i analysen kun de celler, der produktivt interagerer med tolagede overfladen (dvs., celler akkumulere Alexa-Fluor-488 fluorescens (anti-CD3 antistoffer) på grænsefladen).
  2. Bestemme størrelsen af området celle vedhæftning på 20 min efter indledningen af celle-tolagede interaktion.
    Bemærk: Området vedhæftning er det mørke område udviklet på celle-tolagede interface på indblanding overvejelser mikroskopi (IRM) billeder.
  3. Iagttage enhver ophobning af Cy5-ICAM-1 fluorescens og en formation af ring krydset af adskilte Cy-ICAM-1 molekyler på celle-tolagede interface. Hvis akkumulerede ICAM-1 molekyler dannet en vedhæftning ring krydset på mindst to på hinanden følgende billeder, udpege sådanne celler som celler udvikle en perifer Supramolekylær aktiverende cluster (pSMAC)12.
  4. Evaluere granulet frigivelse af måling af Alexa-Fluor-568 fluorescens intensiteten på T-celle-tolagede grænseflade over baggrunden fluorescens udenfor kontaktområde i umiddelbar nærhed af cellen. Udpege celler med et forhold på Alexa-Fluor-568 signal til baggrunden på mindst 1,3 som degranulating celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Først, vi sammenlignet strukturen af grænsefladen synaptic dannet af aktiverede ledning-blod-afledte CD8+ T celler udsat for lipid dobbeltlag bygget enten i traditionelle store flow celle systemer (Se Tabel af materialer for detaljer)1 ,2,3,4 eller i multikanals flow dias. Dobbeltlag indeholdt fluorescerende-mærket anti-CD3 og ICAM-1 på 50 molekyler/µm2 og 300 molekyler/µm2, henholdsvis. CD8+ T celler, der stammer fra menneskelige navlestrengsblod blev aktiveret ved en stimulering med plade-bundet anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer13,14. Der var ingen forskel mellem CD8+ T celler at dannede klassisk immunologiske synapser på lipid dobbeltlag bygget i cellen flow eller multikanals flow dias (figur 1). Alle andre eksperimenter blev udført med lipid dobbeltlag i multikanals flow dias.

Næste, vi undersøgte muligheden for PB - og LN-afledte menneskelige CD4+ T-celler til at danne synaptic grænseflader med planar lipid dobbeltlag og frigive granulat. Vi udnyttede JOHANNAS mikroskopi for at maksimere den lodrette opløsning på T-celle-tolagede grænseflade at visualiseret degranulating celler og evaluere kinetik af granulet frigivelse. Vi observerede 4 grupper af celler for både den LN - og PBMC-afledte CD4+ T celler: nogle T celler etableret modne immun synapser, men enten gjorde eller ikke frigive granulater, andre T-celler frigivet granulat uden en formation af modne synapser, og stadig andre T-celler hverken dannet synapser eller udgivet granulat (figur 2)7. Forskellen mellem LN - og PBMC-afledte CD4+ T celler blev tilsyneladende når kinetik af granulet udgivelsen blev evalueret. PBMC-afledte CD4+ T celler var i stand til at begynde at frigive granulat næsten dobbelt så hurtigt som LN-afledte CD4+ celler (figur 3)7. Samlet set data viser, at trods en heterogenitet af LN - og PBMC-afledte CD4+ T-celler, de sidstnævnte indeholdt en brøkdel af T-celler i stand til at hurtig degranulering.

Figure 1
Figur 1: sammenligning af flow slide system og konventionel flow afdeling. (A) dette panel viser den multichannel flow skub giver mulighed for en forsamling af 6 glas-støttede planar lipid dobbeltlag. Hver tolagede er forbundet med leveringen og udgang porte. Mindre end 1 x 105 celler er tilstrækkelig til analyse. (B) dette panel viser den konventionel flow kammer system giver mulighed for en forsamling af 1 glas-støttede planar lipid tolagede. 2 x 106 celler er påkrævet til analysen. De andre paneler viser (C og D) repræsentative JOHANNAS mikroskopi og (E og F) Konfokal med indblanding refleksion mikroskopi (IRM) billeder af grænsefladen udviklet af aktiveret ledning-blod-afledte CD8 T celler. Cellerne blev udsat for et lipid tolagede indeholdende ICAM-1 (300 molekyler/µm2) og anti-CD3 antistoffer (50 molekyler/µm2) erhvervet (C og E) i flow dias eller (D og F) i en konventionel Flow system under lignende forhold. JOHANNAS mikroskopi og konfokal med IRM billeder er taget med 100 X og 60 X forstørrelse mål, hhv. Procentdelen af T-celler, der form modne synapser på dobbeltlag bygget i enten flow dias eller konventionel flow kammer var meget ens, men varierer mellem eksperimenter fra 75% til 90%. I alle billeder, er Cy-5-mærket ICAM-1 molekyler vist med blåt; Alexa-Fluor-488-mærket anti-CD3 antistoffer er vist i grøn; Alexa-Fluor-568-mærket anti-CD107a antistoffer bundet til CD107a er vist med rødt; IRM billeder er vist i cyan; og skala barer er 10 µm i længden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Strukturen af en T-celle – tolagede interface og mønster af degranulering af lymfeknude og perifert blod mononukleære CD4+ T celler. LNMC - eller PBMC-afledte celler blev sorteret for at adskille CD4-+ T celler der blev udsat for dobbeltlag indeholdende 50 molekyler/µm2 anti-CD3 antistoffer og 300 molekyler/µm2 af ICAM-1 protein. Grænsefladen mellem cellerne og dobbeltlag var afbildet af JOHANNAS mikroskopi. Skala barer er 5 µm. (A) disse repræsentative billeder af en T-celle - tolagede interface viser strukturen af T celle – tolagede grænseflader og degranulering mønster. (B) disse diagrammer viser en repræsentation af LNMC - og PBMC-afledte CD4+ T celler med en anden struktur af synaptic grænseflader og mønstre af granulet frigivelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Dynamiske ændringer af strukturen af en T-celle – tolagede interface og kinetik af en degranulering af lymfeknude og perifert blod mononukleære CD4+ T celler. (A) dette panel viser tidsafhængig ændringer i en T-celle – tolagede interface og udseendet af frigivne granulat. Skala barer er 5 µm. (B) dette panel viser en kvantitering af kinetik af granulet frigivelse af LN-afledte CD4+ T celler (lukkede cirkler) og PBMC-afledte CD4+ T celler (åben cirkler). Hver enkelte cirkel angiver tidspunktet for den første optræden af en påviselig granulet frigivelse af individuelle celler. Median og IQR (interkvartil rækkevidde) er vist for alle scatter parceller. Mann-Whitney test blev udført for at sammenligne forskelle mellem de angivne grupper af T-celler. P < 0,05, ** P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nye teknik beskrevet her udnytter lignende reagenser skal bygge planar dobbeltlag i konventionel flow celle5 og med held kan anvendes til at udføre billeddannelse af primære human T-celle – tolagede grænseflader3,4 ,15. Teknikken tilbyder en betydelig reduktion i den fluorescerende molekyler skik og kræver 10 – 20 x færre T celler i forhold til et flow celle system5, at skabe mulighed for at analysere primære humane T celler fra blod og andre væv.

Antallet af injicerede celler, der anvendes i denne undersøgelse tillod os at billede omkring 50 celler pr. imaging med en 60 X formål. En større koncentration resulterede i celle sammenlægning, at reducere antallet af celler, der er velegnet til analyse. Vi kan yderligere reducere antallet af injicerede celler 10-50 x, men den nedre grænse for celle nummer afhænger af på celle heterogenitet, antallet af felter, billedbehandling og den eksperimentelle design. Nogle efterforskere har tidligere brugt dobbeltlag bygget i en åben kammer med en glas-bund, der kræves et tilsvarende antal celler ved analyse16. Dog det lukkede system beskrevet her, med en kanal højde på 0,1 - 0,4 mm, giver mulighed for hurtig celle sedimentering synkronisere celle udlæg og analyse af T-celle respons uden risiko for flydende fordampning. Sticky dias systemet yderligere tillader dannelsen af op til tre dobbeltlag pr. kanal. Således kunne den samme celle prøve bruges til analyse af celle adfærd på særskilte dobbeltlag med en anden sammensætning af stimulerende, vedhæftning og costimulatory molekyler.

Visse forholdsregler bør tages under samling af sticky dias og coverslips for en vellykket tolagede dannelse. Især, at coverslips skal være helt tør, som selv en lille mængde væske tilbage på glasoverfladen kunne resultere i udsivning under tolagede vask procedure. Vigtigere, er det vigtigt at selv den vedlagte coverslip på kanter af kontakten med den ydre ring af polypropylen scissor-type pincet til at undgå udsivning (som beskrevet i trin 3.4.1). Det er også vigtigt at undgå enhver boblende i post havne i kanalerne. Hvis nogen bobler Angiv et kanalnummer, er de næsten umuligt at fjerne og ødelægge tolagede i kanalen. Tilsvarende er det vigtigt at undgå enhver hurtig pipettering, da turbulent strømning af væske kan indføre bobler i kanalen og beskadige tolagede.

En frigivelse af cytolytisk granulat er opdaget af udseendet af CD107a på T-celle-tolagede interface. Fab regioner af Alexa-Fluor-568-mærket anti-CD107a antistoffer er føjet til CD8 T celler før pålæsningen på dobbeltlag. JOHANNAS mikroskopi udnytter en flygtige bølge for at belyse området omkring 100 nm ovenfor tolagede i volumen defineret som flygtige volumen, gør det muligt for at øge den lodrette opløsning af billeddannelse. Mærket antistof funktionelle luftrumsblokke, som diffuse meget hurtigt i den flygtige volumen ved 37 ° C, generer ikke en påviselig fluorescerende signal. Under membran fusion af specialiserede lysosomer indeholdende lytisk molekyler med cellemembranen, CD107a membran protein vises på T kontakt celler overflade i forskellige steder. De funktionelle luftrumsblokke få bundet til CD107s protein dengang. Knyttet til CD107a protein, danne fluorescerende-mærket Fab(s) immobile klynger, der genererer en lyse fluorescens kan påvises ved JOHANNAS mikroskopi, vejledende af T celle degranulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af R01AI118694 NIH tilskud til Michael R. Betts, som omfatter sub award 566950 til Yuri Sykulev. Vi takker de Sidney Kimmel kræft Center Bioimaging delt ressource for deres fremragende støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD4 T cell isolation kit, human Miltenyl Biotec 130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human Miltenyl Biotec 130-096-495
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
DOGS NTA Avanti Polar Lipids 790528C
Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids 870273C
Human Serum Albumin Octapharma USA NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4 ibidi 80608
Coverslips for sticky-Slides ibidi 10812
Bioptech FCS2 Chamber Bioptech 060319-2-03
anti-CD3 antibody Thermo Fisher Scientific 16-0037-81 OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody Genetex GTX14664 9.3 clone
Casein Sigma C5890
Biotin-PEO4-NHS Thermo Fisher Scientific 21329
DMSO Sigma D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10238
Amersham Cy5 NHS Ester GE Life Science PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors Thermo Fisher Scientific V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection ATCC 37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS Lonza 12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4 ATCC CRL1878 The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B Sigma-Aldrich C9142 Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator Cole-Parmer 77601-60 7592-40 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems Pall Laboratory FS002K10 OS010T12 FS005K10 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30210
Dialysis tubing Spectra/Por 131384
Papain from papaya latex Sigma P3125
mouse anti-human antibody against CD107a BD Bioscences 555798 Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves Fisher Scientific 19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps Thermo Fisher Scientific 6320-0010
Streptavidin ProZyme SA10
Confocal microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope Andor Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software Molecular devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
  3. Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
  4. Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
  5. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18, Unit 18 13 (2007).
  6. Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
  7. Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
  8. Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
  9. Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
  10. Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
  11. Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
  12. Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  13. Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
  14. Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
  15. Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
  16. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).

Tags

Immunologi og infektion sag 137 primære humane T celler perifert blod lymfeknuder planar lipid dobbeltlag struktur synaptic grænseflade
Vurdering af Synaptic grænsefladen af primære menneskelige T celler fra perifert blod og lymfoide væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steblyanko, M., Anikeeva, N.,… More

Steblyanko, M., Anikeeva, N., Buggert, M., Betts, M. R., Sykulev, Y. Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58143, doi:10.3791/58143 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter