Summary
Protokollen beskriver en teknikk for å studere evne til primære polyklonale menneskelige T celler å danne synaptic grensesnitt ved hjelp av Plane lipid bilayers. Vi bruker denne teknikken til å vise differensial synapse formasjon evnen til menneskelig primær T-celler avledet fra lymfeknuter og perifert blod.
Abstract
Den nåværende forståelsen av dynamikken og strukturfunksjonene T-celle synaptic grensesnitt er i stor grad bestemt bruk av glass-støttet ut bilayers og i vitro-avledet T-celle kloner eller linjer1,2 ,3,4. Hvordan disse resultatene gjelder de primære menneskelige T cellene isolert fra blod eller lymfoid vev er ikke kjent, delvis på grunn av betydelige vanskeligheter å skaffe et tilstrekkelig antall celler for analyse5. Her ta vi dette gjennom utvikling av en teknikk utnytte flerkanals flyt lysbilder for å bygge ut lipid bilayers som inneholder aktivere og vedheft molekyler. Den lave høyden flyt lysbildene fremmer rask celle sedimentering synkronisere celle: bilayer vedlegg, og dermed slik at forskere til å studere dynamiske av synaptic grensesnitt dannelse og the kinetics av granulater utgivelsen. Vi bruker denne tilnærmingen å analysere synaptic grensesnittet for så lite som 104 til 105 primære cryopreserved T celler isolert fra lymfeknuter (LN) og perifert blod (PB). Resultatene viser at romanen planar lipid bilayer teknikken muliggjør studiet av Biofysiske egenskapene for primær menneskelige T-celler avledet fra blod og vev i forbindelse med helse og sykdom.
Introduction
Vitenskapelig kunnskap om strukturfunksjonene T-celle immun synapser og deres link til den funksjonelle aktiviteten i T-celler er generert hovedsakelig fra studiet av linjer og kloner avledet fra PB. Til hvilken grad disse funnene knyttet til primær T-celler Hentet fra blod eller menneskelig lymfoid vev er fortsatt uklart, som synaptic grensesnittene av T-celler i lymfoide og andre vev ikke har analysert så langt. Viktigere, tyder nye data på at vev-resident og lymfoide organ-avledet T celler kan ha betydelige forskjeller i fenotypen og funksjonelle aktiviteten sammenlignet med de i PB6,7. Dette er ytterligere styrket behovet for å forstå funksjonene i T-celle synaptic grensesnittet i primær menneskelige T-celler.
Dette har vi utviklet en ny mini skala tilnærming utnytte lipid bilayers bygget i flerkanals flyt lysbilder slik at vi kan utføre avbilding av T-celle/bilayer grensesnitt med mindre enn 105 primære T celler isolert fra menneskelige PB og LN. Denne teknikken tillater studiet av Biofysiske egenskapene til primære menneskelige T-celle synaptic grensesnitt for å bedre modell og forstå i vivo celle-celle interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble gjennomført i henhold til erklæringen i Helsinki. Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakere, og blod-og lymfeknute anskaffet med godkjenning av institusjonelle gjennomgang styret ved University of Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Alle menneskelige fag var voksne. Ledningen blodprøver fotograferingen av arbeidskraft og levering av Institutt for obstetrikk og gynekologi ved Thomas Jefferson University. Alle prøvene var de identifiserte.
1. isolering av CD4+ T celler for en bildeanalyser
-
Tine en 1 mL aliquot som inneholder 107 frosset perifert blod mononukleære celler (PBMCs) eller lymfeknute mononukleære celler (LNMCs) fra innsamlede eksemplene. Legg de tinte cellene til 9 mL av RPMI med penicillin/streptomycin og glutamin i sterilt hette.
- Centrifugate celler for 10 min på 300 x g ved 4 ° C, Sug opp nedbryting, og resuspend cellene i 5 mL supplert RPMI inneholder 10% FBS (komplett medium). Inkuber cellene over natten i en CO2 inkubator på 37 ° C.
- Neste dag, rense CD4+ T celler av negative immunomagnetic sortere ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig utstyr i henhold til produsentens instruksjoner.
- Måle antall ferske renset CD4+ T celler, blande 5 µL av cellen suspensjon med en like volum av en trypan blå løsning. Laste inn en hemocytometer med en celle-trypan blå blanding og telle levende celler inne i 5 deler av hemocytometer.
- Ta gjennomsnittet av celle nummer og bestemme antall celler i den opprinnelige cellen suspensjonen: antall celler/1 mL = gjennomsnittlig antall x 2 x 104. Hvis antall isolerte cellene er for lite, kan du bruke cellene som er uten å telle.
- Sentrifuge cellene på 300 x g i 10 min og resuspend dem i en analysebuffer (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glukose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2og 1% menneskelige serum albumin) på 105 < /C13 > celler/50 µL eller mindre og holde cellene på 4 ° C (for 1-2 h) til klar til bruk i forsøkene.
- Kast alle biologisk avfall i henhold til relevante institusjonelle retningslinjer.
- Hvis ønskelig som en kontroll celle befolkningen, forberede aktivert CD8 T celler fra ledningen blod PBMC, 107 celler i 5 mL av komplett medium i en T25 kultur bolle dekket med en blanding av anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer 10 µg/mL og 1 µg/mL , henholdsvis.
- Neste dag, fjerne aktivert ledningen blodceller fra flasken, vask dem 1 x med friske fullføre medium og utvide cellene i nærvær av rekombinant IL-2 (100 U/mL) for 2 uker.
- Rense navlestrengsblod CD8+ T celler av negative immunomagnetic sortere ved hjelp av det kommersielt tilgjengelig utstyret i henhold til produsentens instruksjoner. Telle celler og utveksle media til analysen bufferen som beskrevet i trinn 1.3-1.6 for LN og PB CD8+ T celler.
2. komponenter for utarbeidelse av Plane Lipid-Bilayers
- Forberede 3 slags liposomer som beskrevet andre steder5: (a) 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine) liposomer, (b) 0.4 mM DOPC liposomer inneholder 33 mol % hunder-NTA (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (ammonium salt)) lipider, (c) 0.4 mM DOPC liposomer inneholder 4 mol % Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(cap biotinyl) (natrium salt)).
-
Forberede 5% kasein løsning som beskrevet tidligere5.
- Oppløse 5 g av kasein pulver i 100 mL ultrapure vann og legge til 350 µL av 10 M natriumhydroksid. Rør alt på en vanlig magnetisk rørestang i sakte fart etter tilgjengelige skalaen, ved romtemperatur for 2 h, og deretter overnatting på 4 ° C. Justere pH 7.3 og ultracentrifuge løsningen for 2t 100.000 x g på 4 ° C. Filtrere nedbryting med filtere 0.22 µm sterile og lagre løsningen i dele på-80 ° C.
FORSIKTIG: natriumhydroksid løsning kan forårsake kjemiske forbrenninger og kan forårsake permanent blindhet på øynene. Bruk gummihansker, sikkerhet klær og vernebriller ved håndtering av denne kjemiske eller sine løsninger.
- Oppløse 5 g av kasein pulver i 100 mL ultrapure vann og legge til 350 µL av 10 M natriumhydroksid. Rør alt på en vanlig magnetisk rørestang i sakte fart etter tilgjengelige skalaen, ved romtemperatur for 2 h, og deretter overnatting på 4 ° C. Justere pH 7.3 og ultracentrifuge løsningen for 2t 100.000 x g på 4 ° C. Filtrere nedbryting med filtere 0.22 µm sterile og lagre løsningen i dele på-80 ° C.
-
Etiketten anti-CD3 antistoff med biotin å produsere mono-bionylated antistoff molekyler med tidligere beskrevet tilnærming8.
- Forberede en løsning av Biotin-PEO4-NHS i dimethyl sulfoxide (DMSO) på 0,1 mg/mL. Legge til 3,7 µL av Biotin-PEO4-NHS løsning 1 mg av antistoff 0,5 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) som inneholder 100 mM natriumbikarbonat.
- Inkuber blandingen for 2 timer ved romtemperatur. Forberede en løsning av Alexa Fluor 488 NHS ester på 10 mg/mL i DMSO. Legg til Alexa Fluor 488 NHS ester løsningen antistoffer merket av Biotin-PEO4-NHS på en 10 ganger molar overflødig.
- Inkuber blandingen 1t ved romtemperatur med langsom stirring på en vanlig magnetisk rørestang. Skille ubundet fargestoff bruke størrelse-utestenging kromatografi.
- Bestemme konsentrasjonen antistoff ved å måle den optiske densitet for antistoff løsningen på 280 nm (en280). Måle den optiske densitet for merket antistoffer på 577 nm (en577).
- Finn fargestoff til antistoff forholdet hjelp av følgende ligning:
Merk: Finn flere detaljer i produsentens protokollen.
-
Uttrykke en rekombinant løselig ICAM-1 protein i et Drosophila uttrykk system som beskrevet tidligere3,4,9,10.
- Klone, med koding i cDNA ectodomain av ICAM-1 i Drosophila uttrykk vektor avdrag/V5-hans med en induserbart metallothionein selskapet å produsere et rekombinant protein lagt med en6 kode på hele C-terminalen.
- Co transfect S2 celler med den resulterende ICAM-1 inneholder plasmider og en G418 uttrykk vektor. Velg stabil transfectants med Schneider's Drosophila Media supplert med 10% fosterets kalv serum (FCS) og 0,5 mg/mL av G418 i 3 uker. Utvid cellene i serum-free insekt medium og indusere en protein uttrykk med 0,5 mM CuSO4 for 3 d.
- Konsentrere kultur supernatant 10 x og dialyze mot PBS via en tangentiell flyt konsentrator som beskrevet tidligere11.
- Bruker konsentrert kulturen supernatant i en kolonne som inneholder Sepharose med et covalently immobilisert anti-ICAM-1 monoklonalt antistoff og elute den bundne ICAM-1 med en 50 mM glysin buffer pH 3.0. Umiddelbart nøytralisere eluted ICAM-1 protein med en 2 M Tris buffer pH 8.0.
- Dialyze eluted materialet mot PBS, pH 8.0 og legge dialyzed materialet til en kolonne som inneholder Ni-NTA agarose. Elute løselig ICAM-1 med 200 mM imidazole, pH 8.0. Dialyze eluted materialet mot en PBS buffer pH 8.0.
- Merke det rensede ICAM-1 med Cy5 NHS ester i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Den beste endelige fargestoff-til-protein forholdet er 1:1.
- Produsere Fab fragmenter fra et anti-CD107a antistoff av papain fordøyelse og rense Fab fragmenter av ionebytte kromatografi som beskrevet tidligere3. Etikett Fab fragmenter med Alexa Fluor 568 NHS ester i henhold til produsentens instruksjoner.
3. dannelsen av Glass-støttet Planar Lipid Bilayers
- Utarbeide en fersk surt piranha løsning ved å blande 140 mL av konsentrert svovelsyre og 60 mL 30% hydrogenperoksid. Vask glass coverslips for flyt lysbildene ved å nyte dem i syre piranha løsningen for 30 min. Hold glass dekkglassvæske med polypropylen saks-type tang.
FORSIKTIG: Piranha løsning er en ekstremt sterk oksidant. Husk å Bruk vernebriller eller beskyttelsesbriller eller et hele skjold med tykk gummihansker når håndtere løsningen. Bare arbeide med piranha løsningen under avtrekksvifte. Unngå varme, transport eller riste den når som helst under bruk, som det kan eksplodere. Samle piranha avfall i en glassflaske med bly inneholder hull. Kontakt institusjonelle sikkerhet komiteen om riktig avfall utnyttelse. -
Skyll den vasket coverslips 7 x med ultrapure vann ved å overføre dem sekvensielt inn kanner med ferskvann. Sett de våte coverslips side å la de resterende vann ruller av ren glass, etterlot tørr glasset.
- Alternativt bruke en pipette tips knyttet til en vakuumpumpe nøye fjerne gjenværende vanndråpene fra coverslips.
- Utføre fortynninger av ulike lipider å produsere liposome blanding for å gjøre bilayers steril panseret. Først kombinere 37 µL av DOPC liposomer og 3 µL av Biotinyl-Cap-PE liposomer. Andre, bland 14 µL av DOPC liposomer og 15 µL av hundene-NTA liposomer. Tredje legge til 1 µL av første miksen 29 µL av andre mix å dikte siste liposome blandingen.
-
I sterilt panseret, sette opp et arbeidsområde med tørr coverslips like ved. Aliquot 2 µL av siste liposome blandingen (se trinn 3.3) nettopp i midten av en selvklebende lysbildet kanal. Umiddelbart og meget presist justere en ren og tørr dekkglassvæske lysbilde og forsiktig lavere dekkglassvæske på den selvklebende siden av lysbildet.
- Hvis forbereder flere lysbilder, arbeide på ett lysbilde om gangen siden liposome blandingen fordamper raskt. Snu lysbildet og bruke den ytre ringen av polypropylen saks-type tang til et lett trykk gjelder perifer kontakt av dekkglassvæske lysbilde, sørge for at slip er tett knyttet til lysbildet å utelukke lekkasje.
Merk: Ikke trykk mot kanaler for lysbildet å unngå å bryte eller sprengning i dekkglassvæske. - Slå lysbildet igjen og plassering av det dannet bilayer, som ser ut som en dråpe mellom dekkglassvæske og kanal lysbildet med tegning 4 prikker med en permanent penn rundt bilayer på eksterne lysbildet side av samlingen.
- Hvis forbereder flere lysbilder, arbeide på ett lysbilde om gangen siden liposome blandingen fordamper raskt. Snu lysbildet og bruke den ytre ringen av polypropylen saks-type tang til et lett trykk gjelder perifer kontakt av dekkglassvæske lysbilde, sørge for at slip er tett knyttet til lysbildet å utelukke lekkasje.
- Før første injeksjon av en væske inn i kanalen, angi én port av kanalen som oppføringen havnen og den andre som Avslutt port og opprettholde denne betegnelsen hele eksperimentet.
- For å unngå danner bobler, stikk enden av Pipetter spissen direkte til oppføringen porten på kanalen. Sakte fylle kanaler for lysbildet med 50 µL av varme (minst romtemperatur) analysebuffer (se trinn 1.5 for bufferen sammensetning).
- Forberede en 0,5 M nickel(II) chloride løsning. Tine en 2 mL aliquot av kasein løsning i et vannbad på 37 ° C i 30 min og supplere det med en nikkel chloride løsning på en siste konsentrasjon av 200 µM.
- Vask bilayers ved først sprøytebruk 100 µL av kasein løsningen i oppføringen havnen i kanalen og deretter umiddelbart fjerne 100 µL av Avslutt porten på lysbildet ved pipettering. Blokkere bilayers med den samme løsningen ved å injisere 100 µL av kasein løsningen i oppføringen havnen i hver kanal og rugende av lysbildet, 45 min ved romtemperatur.
- Tine dele Cy5-ICAM-1-hans6 og streptavidin proteiner. Kombinere proteiner i analysebuffer ved siste konsentrasjonen av 2 µg/mL hver. Sentrifuge løsningen for 30 min på 20.000 x g og 4 ° C fjerne noen aggregater.
- Fjerne resten av blokkering løsningen fra exit porten på lysbildet kanalen ved pipettering. Sette inn 100 µL av løsningen som inneholder ICAM-1 og streptavidin til posten porten.
- Inkuber av lysbildet, 45 min ved romtemperatur. Fjern overflødig protein løsningen fra exit-porten. Vask bilayer 2 x ved først sprøytebruk 100 µL av analysebuffer i oppføringen havnen i kanalen og deretter umiddelbart fjerne 100 µL av Avslutt porten.
- Fortynne en Alexa-Fluor-488-merket anti-CD3 antistoff med analysebuffer i en siste konsentrasjon av 2 µg/mL. Injisere 100 µL av antistoff løsningen i ankomststed lysbildet og ruge det for 45 min ved romtemperatur. Fjern overflødig protein løsningen fra exit-porten. Vask bilayer 2 x med 100 µL av analysebuffer i trinn 3.11.
4. imaging T celler samhandlingen med ut Bilayer
-
Forvarm scenen og målet med AC confocal eller total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskop til temperaturen er equilibrated på 37 ° C. Konfigurere lysbildet med bilayer(s) på oppvarmet scenen. Flytte scenen til riktig posisjon etter blekk merkene og fokus på bilayer ansette fluorescens Cy-merket ICAM-1 molekyler.
- Bruke en 61 X målsetting for AC confocal mikroskopet, eller et 100 X mål for TIRF mikroskopet, med riktige innstillinger.
-
For granule løslate bildebehandling ved TIRF mikroskopi, legge til Alexa-Fluor-568-merket anti-CD107a antistoff Fab fragmenter til celle suspensjon i en siste konsentrasjon av 4 µg/mL før injisere cellene til portene på oppføring.
- Resuspend forberedt CD4+ T celler isolert fra LN eller PB eller ledningen blod og injisere 50 µL av cellen suspensjon i oppføringen havnen i lysbildet kanalen som inneholder bilayer.
- Velg ønsket antall felt og ta bilder av hvert felt 1 x hver 2 min i 30 min etter injeksjon.
- Utnytte lyse-feltet, reflektert lys og fluorescerende kanaler (Alexa 488 og Cy5) av AC confocal mikroskopet bildene. Bruke TIRF modus for Alexa-Fluor-488 og Alexa-Fluor-568 fluorescens og widefield for Cy5 fluorescens, samt lyse-feltet bildebehandling, på TIRF mikroskopet.
5. bildeanalyser
- Analysere ervervet bildene ved hjelp av riktig programvare. Observere celle morfologi i overføres lett bilder og utelukke gruppert og synlig skadet eller apoptotisk celler fra analysen. Inkludere i analysen bare celler som produktivt samhandler med bilayer overflaten (dvs., celler samler Alexa-Fluor-488 fluorescens (anti-CD3 antistoffer) på grensesnittet).
- Bestemme størrelsen på området celle vedheft på 20 min etter initiering av celle-bilayer interaksjon.
Merk: Vedheft området er mørke området utviklet på celle-bilayer grensesnittet på forstyrrelser refleksjon mikroskopi (IRM) bilder. - Observere en opphopning av Cy5-ICAM-1 fluorescens og en formasjon av ringen krysset av segregerte Cy-ICAM-1 molekyler på celle-bilayer grensesnittet. Hvis akkumulert ICAM-1 molekyler dannet et vedheft ring kryss på minst to påfølgende bilder, angi slike celler som cellene utvikle en ekstern supramolecular aktivering klynge (pSMAC)12.
- Evaluere granule utgivelsen ved å måle Alexa-Fluor-568 fluorescens intensiteten på T celle-bilayer grensesnittet over bakgrunnen fluorescens utenfor kontakt i nærheten cellen. Angi celler med forholdet Alexa-Fluor-568 signal-til-bakgrunn av minst 1,3 som degranulating celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Først vi sammenlignet strukturen i synaptic grensesnittet dannet av aktivert ledningen blod-avledede CD8+ T celler utsatt for lipid bilayers bygget enten i tradisjonelle store flyt celle systemer (se Tabell for materiale for detaljer)1 ,2,3,4 eller flerkanals flyt lysbilder. Bilayers inneholdt fluorescerende-merket anti-CD3 og ICAM-1 på 50 molekyler/µm2 og 300 molekyler/µm2, henholdsvis. CD8+ T celler avledet fra menneskelige ledningen blod ble aktivert ved en stimulering med plate-bundet anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer13,14. Det var ingen forskjell mellom CD8+ T celler som dannet klassisk immunologiske synapser på lipid bilayers bygget i på flyt eller flerkanals flyt lysbildet (figur 1). Alle andre eksperimenter ble utført med lipid bilayers gjort i flerkanals flyt lysbildene.
Neste, vi undersøkte evne til PB - og LN-avledet menneskelige CD4+ T celler å danne synaptic grensesnitt med planar lipid bilayers og slipp granulat. Vi utnyttet TIRF mikroskopi for å maksimere den vertikale oppløsningen på T celle-bilayer grensesnittet visualisert degranulating celler og evaluere the kinetics av granule utgivelsen. Vi observerte 4 grupper av celler for både den LN - og PBMC-avledet CD4+ T celler: noen T-celler etablert modne immunsystemet synapser, men enten har eller ikke slipper granulater, andre T-celler utgitt granulater uten en formasjon av modne synapser, og fortsatt andre T-celler dannet synapser verken utgitt granulater (figur 2)7. Forskjellen mellom LN - og PBMC-avledet CD4+ T celler ble tydelig da the kinetics av granule utgivelsen ble evaluert. PBMC-avledet CD4+ T celler kunne begynne å slippe granulater nesten dobbelt så raskt som LN-avledet CD4+ celler (Figur 3)7. Samlet data viser at til tross for en heterogenitet LN - og PBMC-avledet CD4+ T celler, sistnevnte inneholdt en brøkdel av T celler i stand til rask omfatter degranulering.
Figur 1: sammenligning av lysbildet med system og konvensjonelle flow chamber. (A) dette panelet viser flerkanals flyten Skyv tillater en forsamling av 6 glass-støttet planar lipid bilayers. Hver bilayer er koblet til levering og utgang portene. Mindre enn 1 x 105 celler er tilstrekkelig for analyse. (B) dette panelet viser konvensjonelle flow chamber systemet tillater en forsamling av 1 glass-støttet planar lipid bilayer. 2 x 106 celler kreves for analysen. Andre paneler Vis (C og D) representant TIRF mikroskopi og (E og F) AC confocal med forstyrrelser refleksjon mikroskopi (IRM) bilder av grensesnittet utviklet av aktivert ledningen blod-avledede CD8 T celler. Cellene ble utsatt for en lipid bilayer som inneholder ICAM-1 (300 molekyler/µm2) og anti-CD3 antistoffer (50 molekyler/µm2) ervervet (C og E) i flyt lysbilder eller (D og F) i en konvensjonell med system under like forhold. TIRF mikroskopi og AC confocal IRM bilder er tatt med 100 X og 60 X forstørrelse mål, henholdsvis. Prosentandelen av T-celler som skjemaet modne synapser på bilayers bygget i enten flyt lysbildet eller konvensjonelle flow chamber var svært likt men varierer mellom eksperimenter fra 75% til 90%. Alle bilder vises Cy-5-merket ICAM-1 molekyler i blått. Alexa-Fluor-488-merket anti-CD3 antistoffer vises i grønne; Alexa-Fluor-568-merket anti-CD107a antistoffer bundet til CD107a vises i rødt; IRM-bilder vises i cyan; skala barer er 10 µm i lengde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Strukturen av en T celle-bilayer grensesnitt og mønster av omfatter degranulering av lymfeknute og perifere blod mononukleære CD4+ T celler. LNMC - eller PBMC-avledet celler er sortert skille CD4+ T celler som ble utsatt for bilayers som inneholder 50 molekyler/µm2 av anti-CD3 antistoffer og 300 molekyler/µm2 ICAM-1 protein. Grensesnittet mellom cellene og bilayers ble fotografert av TIRF mikroskopi. Skala stolpene har 5 µm. (A) disse representant bilder av en T-celler - bilayer grensesnitt viser strukturen av T celle-bilayer grensesnitt og omfatter degranulering mønster. (B) disse diagrammene viser en representasjon av LNMC - og PBMC-avledet CD4+ T celler med en annen struktur av synaptic grensesnitt og bruksmønstre granule utgivelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Dynamiske endringer i strukturen i et T celle-bilayer grensesnitt og the kinetics av en omfatter degranulering lymfeknute og perifere blod mononukleære CD4+ T celler. (A) dette panelet viser tidsavhengige endringer av en T celle-bilayer grensesnitt og utseendet på utgitt granulat. Skala stolpene har 5 µm. (B) dette panelet viser en kvantifisering av the kinetics av en granule utgivelse av LN-avledet CD4+ T celler (lukket sirkler) og PBMC-avledet CD4+ T celler (åpne sirklene). Hver individuelle sirkel angir tidspunktet for den første opptreden av en detectable granule utgivelse av individuelle celler. Median og IQR (interquartile rekkevidde) vises for alle scatter tomter. Mann-Whitney tester ble utført for å sammenligne forskjeller mellom de angitte gruppene av T-celler. P < 0,05, ** P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken beskrevet her benytter lignende reagenser kreves for å bygge ut bilayers i konvensjonelle flyt celle5 og kan bli brukt for å utføre avbilding av primære menneskelige T celle-bilayer grensesnitt3,4 ,15. Teknikken tilbyr en betydelig reduksjon i fluorescerende molekyler bruken og krever 10-20 x færre T celler i forhold til en flyt cellen systemet5, skape mulighet til å analysere primære menneskelige T celler fra blod og andre vev.
Antall injisert celler brukt i denne studien tillot oss å image 50 celler per imaging feltet med en 60 X-målet. En større konsentrasjon resulterte i cellen aggregering, redusere antall celler egnet for analyse. Vi kan ytterligere redusere antall injisert celler 10-50 x, men den nedre grensen til celle nummer avhenger på cellen heterogenitet på antall tenkelig felt og på eksperimentell design. Noen etterforskere har tidligere brukt bilayers bygget i en åpen kammer med glass bunn som krevde et tilsvarende antall celler analyse16. Imidlertid gir lukket system beskrevet her, med en kanal høyde på 0,1 - 0,4 mm, rask celle sedimentering å synkronisere celle vedlegg og analyse av T-celle respons uten risiko for flytende fordampning. Det klebrige lysbildet systemet tillater dannelse av opptil tre bilayers per kanal. Dermed kan samme celle prøven brukes for analyse av cellen atferd på forskjellige bilayers med en annen sammensetning av stimulerende, vedheft og costimulatory molekyler.
Forholdsregler bør tas under montering av klissete lysbilder og coverslips for en vellykket bilayer-formasjonen. Spesielt coverslips bør være helt tørr, så selv en liten mengde væske igjen på glassplaten kan resultere i lekkasje under bilayer vask prosedyren. Viktigere er det viktig å selv den vedlagte dekkglassvæske på kantene av kontakten med den ytre ringen av polypropylen saks-type tang for å unngå (som beskrevet i trinn 3.4.1). Det er også viktig å unngå noen bobler i oppføringen portene på kanalene. Hvis bobler angir en kanal, er nesten umulig å fjerne og ødelegge bilayer i kanalen. Tilsvarende er det viktig å unngå noen rask pipettering, siden turbulente flyten av væske kan innføre bobler i kanalen og skade på bilayer.
En versjon av cytolytic granulater oppdages av utseendet på CD107a på T celle-bilayer grensesnittet. Fab regioner av Alexa-Fluor-568-merket anti-CD107a antistoffer legges til CD8 T celler før lasting på bilayers. TIRF mikroskopi utnytter en flyktige bølgen for å belyse området ca 100 nm over bilayer i volumet definert som evanescent volum, slik at for å øke den vertikale oppløsningen avbilding. Merket antistoff produksjonslokaler både, som diffus svært raskt i evanescent volumet på 37 ° C, Generer ikke en detectable fluorescerende signal. Under membranen fusjon av spesialiserte lysosomer som inneholder lytisk molekyler med cellemembranen, CD107a membran protein vises på T kontakte celler overflaten på forskjellige steder. De produksjonslokaler både få bundet til CD107s protein på den tiden. Knyttet til CD107a protein, danner lysstoffrør-merket Fab(s) immobile klynger som genererer en lyse fluorescens detectable av TIRF mikroskopi, indikativ av T celle omfatter degranulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av R01AI118694 NIH stipend til Michael R. Betts, som inkluderer sub pris 566950 til Yuri Sykulev. Vi takker Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging delte ressursen for deres utmerket støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
References
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
- Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
- Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18, Unit 18 13 (2007).
- Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
- Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
- Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
- Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
- Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
- Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
- Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
- Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
