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Immunology and Infection

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/58143
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 4
1Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 2Department of Microbiology and Institute for Immunology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital Huddinge, 4Departments of Microbiology and Immunology and Medical Oncology, Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

Summary

프로토콜 평면 지질 bilayers를 사용 하 여 시 냅 스 인터페이스를 형성 하는 기본 polyclonal 인간 T 세포의 기능을 연구 하는 기법을 설명 합니다. 우리 림프절과 주변 혈액에서 파생 하는 인간의 기본 T 세포의 차별 시 냅 스 형성 기능을이 기법을 사용 합니다.

Abstract

역학의 현재 이해 및 T-세포 시 냅 스 인터페이스의 구조 기능 지원 되는 유리 평면 bilayers 및 생체 외에서의 사용을 통해 주로 결정 되었습니다-파생 된 T-세포 복제 또는1,2 라인 ,,34. 이러한 연구 결과 혈액에서 격리 또는 림프 기본 인간 T 세포에 적용 하는 방법 조직은 모른다, 분석5셀의 충분 한 수를 취득에 상당한 어려움 때문에 부분적으로. 여기 우리가 구축 활성화 및 접착 분자를 포함 하는 평면 지질 bilayers 멀티 채널 흐름 슬라이드를 이용 하는 기술 개발을 통해이 해결 합니다. 흐름 슬라이드의 낮은 높이 시 냅 스 인터페이스 형성의 동적과 립 방출의 속도 론을 공부 하 고 연구 함으로써 셀: bilayer 첨부 파일을 동기화 하기 위해 빠른 셀 침전을 촉진 합니다. 우리는 10 몇의 시 냅 스 인터페이스를 분석에이 접근을 적용 105 주 cryopreserved T 세포 림프 노드 (LN) 및 말 초 혈액 (PB)에서 절연 된4 . 결과 공개 소설 평면 지질 bilayer 기술 기본 인간 T 세포에서 혈액과 조직 건강과 질병의 맥락에서 파생 된의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.

Introduction

T 세포의 기능 활동에 그들의 링크와 T 세포 면역 시 냅 스의 구조적 기능의 과학적 지식을 셀 라인의 연구에서 주로 생성 되 고 클론 PB에서 파생. 어느 정도 기본 T 세포에 관련 된 이러한 연구 결과에서 얻은에 혈액 또는 인간 림프 조직 남아 있다 불분명, 림프 및 다른 조직에서 T 세포의 시 냅 스 인터페이스는 지금까지 분석 되지. 중요 한 것은, 새로운 데이터 조직 상주와 림프 기관 파생 된 T 세포의 표현 형 및 PB6,7에 비해 기능 활동에 큰 차이가 있을 수 있습니다 것이 좋습니다. 이 추가 기본 인간 T 세포에서 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 기능을 더 잘 이해할 필요가 고형화 했다.

이 위해 악용 하는 멀티 채널 흐름 슬라이드를 T-셀/bilayer 인터페이스의 이미징 105 주 T 세포와 인간의 PB를 ln. 격리 수행에 내장 된 지질 bilayers 소설 미니 규모 접근 개발 했습니다. 이 새로운 기술은 더 나은 모델 하 고 vivo에서 세포 세포 상호 작용을 이해 하기 위해 기본 인간 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.

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Protocol

헬싱키의 선언에 따라 연구 되었다. 모든 참가자에 게 서 얻은 서 면된 동의 하 고 혈액과 림프 노드 샘플 펜실베니아 대학 (IRB #809316, IRB # 815056) 기관 검토 위원회의 승인으로 인수 했다. 모든 인간의 과목 성인 이었다입니다. 코드 혈액 샘플을 친절 하 게 노동과 학과의 산부인과 토마스 제퍼슨 대학에서의 납품에 의해 제공 되었다. 모든 샘플 드 확인 했다입니다.

1. 절연 CD4의 이미지 분석에 대 한+ T 세포

  1. 107 냉동 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 림프 노드 단 세포 (LNMCs) 수집 된 샘플에서 포함 된 1 mL 약 수 동 살 균 후드에서 RPMI 페니실린/스와 글루타민 보충의 9 mL에 해 동된 셀을 추가 합니다.
    1. Centrifugate에서 4 ° C, 300 x g 에서 10 분 동안 셀 상쾌한, 발음 및 10%를 포함 하는 보충된 RPMI의 5 mL에 셀 resuspend FBS (완전 한 매체). 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어
  2. 다음 날, 정화 CD4 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬 하 여+ T 세포.
  3. 갓 순화 CD4 수를 측정 하기 위해+ T 세포, trypan 블루 솔루션의 동등한 볼륨 세포 현 탁 액의 5 µ L를 혼합. 로드 셀 trypan과 hemocytometer 혼합물을 블루와 hemocytometer의 5 섹션 안에 라이브 셀.
  4. 휴대폰 번호의 평균을가지고 고 원래 세포 현 탁 액에 있는 셀의 수를 결정: 셀/1 mL의 수 = 2 × 104x 평균 수. 고립 된 세포의 총 수 너무 작은 경우 셀 계산 하지 않고 그대로 사용 합니다.
  5. 10 분에 대 한 300 x g 에서 세포를 원심 및 105에 분석 결과 버퍼 (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2mm 나2HPO4, 5 m D-포도 당, 5 m KCl, 1 mM MgCl2m m, 2 m m CaCl2및 1% 인간 혈 청 알 부 민)에 그들을 resuspend < /c13 > 셀/50 µ L 이하로 실험에 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 (1-2 h) 세포를 유지 하 고.
  6. 관련 기관 지침에 따라 모든 생물 학적 폐기물의 처분.
  7. 원하는 경우 컨트롤 셀 인구로 서, 탯 줄 혈액 PBMC에서에서 CD8 T 세포 활성화를 준비, 10 µ g/mL 및 1 µ g/mL에서 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체의 혼합물으로 덮여 T25 문화 플라스 크에 완전 한 매체의 5 mL에 107 셀 장소 각각.
  8. 다음 날, 플라스 크에서 활성화 코드 혈액 세포를 제거 그들을 씻어 1 x 신선한 매체를 완료 하 고 재조합 일리노이-2의 셀 확장 (100 U/mL) 2 주 동안.
  9. 코드-혈액 CD8 정화+ T 세포의 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬. 셀을 계산 하 고 LN 및 PB CD8 1.3-1.6 단계에 설명 된 대로 분석 결과 버퍼에 미디어를 교환+ T 세포.

2. 평면 지질 Bilayers의 준비에 대 한 구성 요소

  1. 5설명 되어 있는 대로 리의 3 종류 준비: (a) 0.4 m m DOPC (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 리, (b) 0.4 m m DOPC 리 33 mol % 개 NTA를 포함 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5- 아미노-1-carboxypentyl) iminodiacetic 산) succinyl] (염화 소금)) 지질, 4 mol %Biotinyl-모자-PE를 포함 하는 (c) 0.4 m m DOPC 리 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(모자 biotinyl) (나트륨 소금)).
  2. 앞에서 설명한55% 카 세 인 솔루션을 준비 합니다.
    1. 초순의 100 mL에 카 세 인 분말의 5 g을 녹이 고 수산화 나트륨 10 M의 350 µ L을 추가. 2 시간, 실 온에서 사용할 수 있는 규모에 따라 느린 속도로 일반 자력에 모든 것을 저 어 하 고 4 ° c.에서 하룻밤 7.3 및 ultracentrifuge에서 4 ° c.에 100000 x g 2 h에 대 한 솔루션에 pH를 조정 0.22 μ m 살 균 필터는 상쾌한 필터링 및 솔루션-80 ° c.에 aliquots에 저장
      주의: 수산화 나트륨 용액 화학 화상을 일으킬 수 있습니다 하 고 눈과의 접촉에 따라 영구적인 실명을 일으킬 수 있습니다. 이 화학 제품 또는 그것의 솔루션을 다룰 때 고무 장갑, 안전 복과 눈 보호를 사용 합니다.
  3. 앞에서 설명한 방법은8모노-bionylated 항 체 분자를 생산 하기 위해 biotin과 레이블 안티-CD3 항 체.
    1. 0.1 mg/mL에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 Biotin PEO4 NHS의 솔루션을 준비 합니다. 0.5 ml의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 100 mM 탄산수 소 나트륨을 포함 하는 항 체의 1 밀리 그램 Biotin PEO4 NHS 솔루션의 3.7 µ L를 추가 합니다.
    2. 실 온에서 2 h에 대 한 혼합물을 품 어. 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 DMSO에 10 mg/mL에서의 솔루션을 준비 합니다. 10 어 금 니 과잉에 Biotin PEO4 보 건국에 의해 표시 된 항 체에 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 솔루션을 추가 합니다.
    3. 정기적으로 자력에 느린 교 반으로 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 품 어. 크기 배제 크로마토그래피를 사용 하 여 언바운드 염료를 구분 합니다.
    4. 280에서 항 체 용액의 광학 밀도 측정 하 여 항 체 농도 결정 nm (280). 577에서 레이블이 지정 된 항 체의 광학 밀도 측정 nm (577).
    5. 다음 수식을 사용 하 여 염료를 항 체 비율을 확인 합니다.
      Equation
      참고: 제조업체의 프로토콜에서 추가 세부 정보를 찾을.
  4. 앞에서 설명한3,4,,910 초파리 식 시스템에서 재조합 형 수용 성 ICAM-1 단백질을 표현 한다.
    1. 복제, cDNA 인코딩으로 초파리 식으로 ICAM-1의 ectodomain pMT/V5-그는 그의 추가 재조합 단백질을 생산 하는 유도할 수 있는 metallothionein 모터와 벡터 C 터미널 끝에6 태그.
    2. 공동 transfect S2 셀 결과 ICAM-1 포함 플라스 미드와 G418 식 벡터. 안정적인 transfectants 슈나이더의 초파리 미디어 3 주 동안 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 0.5 mg/mL G418의 보충을 사용 하 여 선택 합니다. 혈 청 무료 곤충 매체에 셀을 확장 하 고 0.5 m m CuSO4 3 d와 단백질 발현을 유도.
    3. 문화 표면에 뜨는 배를 집중 하 고 앞에서 설명한11로 접선 흐름 집중 장치를 통해 PBS에 대 한 dialyze.
    4. Covalently 고정된 안티-ICAM-1 단일 클론 항 체와 Sepharose를 포함 하는 열을 표면에 뜨는 집중된 문화를 적용 하 고 50mm 글리신 버퍼, pH 3.0으로 바인딩된 ICAM-1을 elute. 즉시 2 M Tris 버퍼, pH 8.0 eluted ICAM-1 단백질을 무력화.
    5. PBS, pH 8.0에 대하여 eluted 물자 dialyze 고 열 포함 Ni NTA agarose를 dialyzed 자료를 추가 합니다. 녹는 ICAM-1 200 mM 이미, pH 8.0 elute PBS 버퍼, pH 8.0에 eluted 소재 dialyze
    6. 레이블을 Cy5 NHS 에스테 르 제조 업체의 지시에 따라 정화 ICAM-1.
      참고: 최고의 마지막 염료 단백질 비율은 1:1입니다.
  5. 팹 생산 papain 소화에 의해 안티-CD107a 항 체에서 조각 하 고 팹 정화 이온 교환 크로마토그래피3위에서 설명한 대로 의해 조각. 레이블 제조업체의 지시에 따라 알 렉 사 Fluor 568 NHS 에스테 르는 팹 조각.

3. 지원 되는 유리 평면 지질 Bilayers의 대형

  1. 집중된 한 황산과 과산화 수소 30%의 60 mL 140 mL를 혼합 하 여 신선한 산 성 피 솔루션을 준비 합니다. 몸을 담글 하 여 그들 30 분 대기에 대 한 산 성 피 솔루션에 유리 coverslip 폴 리 프로필 렌가 위 형 집게와 흐름 슬라이드 유리 coverslips 세척.
    주의: 피 솔루션은 매우 강한 산화 제. 솔루션을 처리 하는 동안 항상 착용 안전 유리 또는 고글 또는 두꺼운 고무 장갑 함께 들고 방패를 기억 하십시오. 증기 두건에서 피 솔루션 에서만 작동 합니다. 폭발 수 있습니다으로 난방, 수송, 또는 언제 든 지 사용 하는 동안 그것을 동요 하는 하지 마십시오. 포함 하는 리드 구멍 유리 병에 고생 폐기물을 수집 합니다. 문의 적절 한 폐기물 활용에 대 한 제도적 인 안전 위원회.
  2. 린스 세척된 coverslips 7 초순 순차적으로 신선한 물을 포함 하는 비 커에 그들을 전송 하 여 x. 설정 옆으로 물이 남아 있도록 젖은 coverslips 롤 건조 유리를 남겨두고 깨끗 한 유리 합니다.
    1. 또는, 진공 펌프에 연결 된 피 펫 팁을 사용 하 여 신중 하 게는 coverslips에서 나머지 물방울을 제거.
  3. 살 균 후드에서 희석 다양 한 지질 bilayers 만들기 위한 liposome 믹스를 생산 하기 위해 수행 합니다. 첫째, DOPC 리의 37 µ L 3 µ L Biotinyl-모자-PE 리의 결합. 둘째, DOPC 리의 14 µ L 고 개-NTA 리의 15 µ L를 혼합. 셋째, 결승전 liposome 혼합물을 조작 하는 두 번째의 29 µ L를 첫 번째 믹스 1 µ L를 추가 합니다.
  4. 살 균 후드 작업 공간 가까이 의해 건조 coverslips로 설정 합니다. 결승전 liposome 혼합물의 aliquot 2 µ L (단계 3.3 참조) 접착 슬라이드 채널의 중심에 정확 하 게. 즉시 고 매우 정확 하 게 정렬 깨끗 하 고 건조 coverslip 슬라이드 및 슬라이드의 끈 적 한 면에 coverslip 부드럽게.
    1. 하나 이상의 슬라이드를 준비 하는 경우 한 슬라이드에 한 번에 이후 작동 liposome 혼합물 빠르게 증발. 슬라이드를 뒤집어 놓고 형 폴 리 프로필 렌가 위 집게의 외부 반지를 사용 하 여 슬라이드, 슬립 누설을 방해 하기 위해 슬라이드에 단단히 연결 되어 있는지 확인 하는 coverslip의 주변 접촉에 부드러운 압력을 적용 합니다.
      참고: 깨고 나는 coverslip 크래킹을 피하기 위해 슬라이드의 채널에 대 한 누르지 마십시오.
    2. 다시 슬라이드를 설정 하 고 어셈블리의 외부 슬라이드에 bilayer 주위 영구 표시와 함께 그리기 4 점으로 coverslip 사이의 채널 슬라이드 드롭 처럼 보이는 형성된 된 bilayer의 위치를 표시 합니다.
  5. 채널에는 액체의 첫 번째 주입, 전에 엔트리 포트와 출구 포트 다른 채널의 한 포트를 지정 하 고 실험을 통해이 지정을 유지 합니다.
  6. 거품 형성을 방지 하려면 채널의 엔트리 포트에 직접 피펫으로 팁의 끝을 삽입 합니다. 천천히 따뜻한의 50 µ L를 채울 슬라이드의 채널 (적어도 룸 온도) 분석 결과 버퍼 (버퍼 구성에 대 한 1.5 단계 참조).
  7. 0.5 M nickel(II) 염화 물 솔루션을 준비 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 물 욕조에 카 세 인 솔루션의 2 mL 약 수를 녹여 하 고 그것 200 µ M의 최종 농도에 니켈 염화 물 솔루션을 보완.
  8. 먼저 채널의 엔트리 포트에서 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 즉시 pipetting으로 슬라이드에 출구 포트에서 100 µ L을 제거 하 여 있는 bilayers 워시. 각 채널의 입력 포트에 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드 배양 하 여 동일한 솔루션 bilayers 차단.
  9. Aliquots Cy5-ICAM-1-그의6 와 streptavidin 단백질의 해빙 각 2 µ g/m l의 최종 농도에 분석 결과 버퍼에 단백질을 결합 한다. 20000 x g 및 모든 집계 제거 하 4 ° C에서 30 분 동안 솔루션 원심
  10. Pipetting으로 슬라이드 채널의 출구 포트에서 차단 솔루션의 나머지 부분을 제거 합니다. ICAM-1와 streptavidin 엔트리 포트에 포함 된 솔루션의 100 µ L를 주사.
  11. 실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. 씻어 bilayer 2 채널의 입력 포트에 분석 결과 버퍼의 100 µ L를 먼저 주입 하 고 출구 포트에서 100 µ L를 즉시 제거 하 여 x.
  12. 2 µ g/mL의 최종 농도에 분석 결과 버퍼와 알 렉 사-형 석-488-셔 서 반대로 CD3 항 체 희석. 슬라이드의 엔트리 포트에 항 체 솔루션의 100 µ L를 주사 하 고 실 온에서 45 분 동안 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. Bilayer 2 세척 단계 3.11에서와 같이 분석 결과 버퍼의 100 µ L x.

4. 평면 Bilayer와 T 세포 상호 작용의 이미징

  1. 무대와 confocal 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경의 목표 온도 37 ° c.에 equilibrated 때까지 예 열 열띤된 무대에는 bilayer(s)와 함께 슬라이드를 설정 합니다. 잉크 자국에 따라 적절 한 위치에 무대를 이동 하 고 사 셔 서 ICAM-1 분자의 형광을 채용 하는 bilayer에 초점.
    1. Confocal 현미경에 대 한 61 X 목표 또는 100 X 목표를 사용 하 여 적절 한 필터 설정으로 TIRF 현미경에 대 한.
  2. 과 립에 대 한 이미징 TIRF 현미경 분리, 알 렉 사 Fluor-568-표시 된 안티-CD107a를 추가 엔트리 포트에 세포를 주입 하기 전에 4 µ g/mL의 최종 농도에 세포 현 탁 액에 항 체 Fab 조각.
    1. 준비 된 CD4 resuspend+ T 세포 선 또는 PB 또는 코드에서 격리 혈액 및 슬라이드 채널을 포함 하는 bilayer의 엔트리 포트에 세포 현 탁 액의 50 µ L를 주입.
  3. 주사 후 필드의 원하는 숫자와 30 분 동안 2 분 마다 x 각 필드 1의 이미지를 기록을 선택 합니다.
  4. 밝은 분야, 반사 빛, 및 형광 채널 (알 렉 사 488와 Cy5)는 이미지 공초점 현미경의 이용. TIRF 모드를 사용 하 여 알 렉 사-형 석-488와 알 렉 사-형 석-568 형광와 Cy5 형광, 뿐만 아니라 밝은 필드 이미징, TIRF 현미경에 widefield.

5. 이미지 분석

  1. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지 분석. 전송 된 가벼운 이미지와 제외 클러스터와 눈에 띄게 손상 또는 apoptotic 세포 분석에서 셀 형태를 관찰 합니다. 생산적 bilayer 표면 (즉, 인터페이스에 알 렉 사-형 석-488 형광 (안티-CD3 항 체)를 축적 하는 세포)와 상호 작용 하는 셀에만 분석에 포함 됩니다.
  2. 셀 bilayer 상호 작용의 개시 후 20 분에 셀 접착 영역의 크기를 결정 합니다.
    참고: 접착 지역 방해 반사 현미경 (IRM) 이미지에 셀 bilayer 인터페이스에서 개발 된 어두운 영역이입니다.
  3. 셀 bilayer 인터페이스에서 차별 Cy-ICAM-1 분자 Cy5-ICAM-1 형광의 어떤 축적과 링 접합의 형성을 관찰 합니다. 누적된 ICAM-1 분자 두 개 이상의 연속 이미지에 접착 링 접합 형성, 세포는 주변 supramolecular 활성화 클러스터 (pSMAC)12개발로 같은 셀을 지정 합니다.
  4. 셀에 가까운 근접에서 연락처 영역 밖에 배경 형광에 T 세포 bilayer 인터페이스에 알 렉 사-형 석-568 형광 강도 측정 하 여과 립 자료를 평가 합니다. Degranulating 셀 셀 배경의 알 렉 사-형 석-568 신호-를-적어도 1.3의 비율을 지정 합니다.

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Representative Results

첫째, 우리는 활성화 코드 혈액 파생 CD8에 의해 형성 된 시 냅 스 인터페이스의 구조를 비교+ T 세포 지질 bilayers에 노출 내장 중에서 전통적인 대규모 흐름 전지 시스템 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조)1 ,2,,34 또는 멀티 채널 흐름 슬라이드. bilayers 포함 된 형광 표시 된 안티-CD3 ICAM-1 50 분자 / µ m2 와 300 분자 / µ m2, 각각. CD8+ T 세포 인간 코드 혈액에서 파생 된 플레이트-바인딩 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체13,14와 자극에 의해 활성화 되었다. CD8 사이 차이가 없었다+ T 세포는 형성된 클래식 면역학 시 냅 스 흐름 셀 또는 멀티 채널 흐름 슬라이드 (그림 1)에 내장 된 지질 bilayers에. 다른 모든 실험 지질 bilayers 멀티 채널 흐름 슬라이드에서 수행 했다.

다음, 우리는 인간의 CD4 PB와 LN 파생의 능력 검사 평면 지질 bilayers에 있는 시 냅 스 인터페이스 및과 립 출시+ T 세포. 우리는 TIRF 현미경 셀 degranulating 시각을 립 방출의 속도 론 평가 T 세포 bilayer 인터페이스에 수직 해상도 최대화 하기 위해 악용. 우리 모두는 LN PBMC 파생 CD4 세포의 4 그룹 관찰+ T 세포: 몇몇 T 세포 성숙 면역 시 냅 스를 설립 했지만 하나 또는 알갱이 발표 하지 않았다, 다른 T 세포 성숙 시 냅 스의 형성 없이 립 출시 여전히 다른 T 세포 시 냅 스 형성도 립 (그림 2)7을 발표 했다. LN와 PBMC 파생 CD4의 차이+ T 세포과 립 방출의 속도 론 평가 되었다 때 분명해. PBMC 파생 CD4+ T 세포과 립 LN 파생 CD4 거의 두 배나 빨리 공개를 시작 수 있었다+ 세포 (그림 3)7. 전반적으로, 데이터 LN PBMC 파생 CD4의이 질에도 불구 하 고 그를 보여주는+ T 세포, 후자 포함 된 T의 일부 세포 degranulation 급속 한 수.

Figure 1
그림 1: 비교 흐름 슬라이드 시스템 및 기존의 흐름 챔버의. 멀티 채널 흐름 슬라이드 6 유리 지원 평면 지질 bilayers의 조립 허용 (A)이이 패널 표시 합니다. 각 bilayer 배달 및 출구 포트에 연결 되어 있습니다. 1 x 10 보다 작은5 셀 분석에 대 한 충분 한 있습니다. (B)이이 패널 1 유리 지원 평면 지질 bilayer의 조립 수 있도록 기존의 흐름 챔버 시스템을 보여 줍니다. 2 x 106 세포는 분석 필요 합니다. 다른 패널 표시 (C 및 D) 대표 TIRF 현미경 및 (E 와 F) 간섭 반사 현미경으로 confocal (IRM) 이미지에 의해 개발 된 인터페이스의 코드 혈액 파생 CD8 T 세포 활성화. 세포는 기존에 지질 bilayer ICAM-1 (300 분자/μ m2) 및 안티-CD3 항 체 (50 분자/μ m2) 인수 (C , E) 흐름 슬라이드 또는 (D 와 F)에 노출 됐다 비슷한 조건에서 흐름 시스템입니다. TIRF 현미경 검사 법 그리고 confocal irm 이미지는 각각 100 X 및 60 배율 목표 X를 사용 하 여 촬영. 성숙한 형태는 bilayers에 synapses T 세포의 비율 중 흐름 슬라이드에 내장 또는 기존의 흐름 챔버는 매우 유사 하지만 실험 75%에서 90% 사이 변화 한다. 모든 이미지, Cy 5 개 ICAM-1 분자 파란색; 표시 됩니다. 알 렉 사 Fluor-488-표시 된 안티-CD3 항 체; 녹색으로 표시 됩니다. 알 렉 사 Fluor-568-표시 된 안티-CD107a 항 체 CD107a에 바인딩된 빨간색; 표시 됩니다. 녹청;에 IRM 이미지 표시 됩니다. 그리고 스케일 바는 10 µ m 길이에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: T 세포-bilayer 인터페이스의 구조와 degranulation 림프절 및 주변 장치의 패턴 혈액 단 CD4+ T 세포. LNMC 또는 PBMC 파생 된 셀 정렬 했다 CD4 별도의+ T 세포 50 안티-CD3 항 체의 분자 / µ m2 및 ICAM-1 단백질의 300 분자 / µ m2 bilayers에 노출 됐다. 전지와 bilayers 간의 인터페이스는 TIRF 현미경 검사 법에 의해 몇 군데. 눈금 막대는 5 µ m. (A) T 세포-bilayer 인터페이스의 이러한 대표 이미지 T 세포-bilayer 인터페이스와 degranulation 패턴의 구조를 보여 줍니다. (B) 이러한 다이어그램 표시 LNMC PBMC 파생 CD4 표현+ T 세포 시 냅 스 인터페이스의 다른 구조와과 립 방출의 패턴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: T 세포-bilayer 인터페이스의 구조와 림프절 및 주변 degranulation의 활동의 동적 변화 혈액 단 CD4+ T 셀. (A)이이 패널 출시 알갱이의 모양과 T 세포-bilayer 인터페이스의 쇼 시간에 따라 변경 됩니다. 스케일 바는 5 µ m. (B)이이 패널 표시 LN 파생 CD4 하 여과 립 출시의 활동의 정량+ T 세포 (폐쇄 원형) 및 PBMC 파생 CD4+ T 세포 (오픈 원). 각 개별 원은 개별 셀에 의해 감지과 립 방출의 초연의 시간을 나타냅니다. 중간값과 IQR (interquartile 범위) 모든 분산형 플롯에 대 한 표시 됩니다. 맨-휘트니 테스트 T 셀의 지정 된 그룹 간의 차이점을 비교를 수행 했다. P < 0.05, * * P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

여기에 설명 된 소설 기법 기존의 흐름 셀5 평면 bilayers 구축 하는 데 필요한 유사한 시 약을 활용 하 고 수행 기본 인간 T 세포-bilayer 인터페이스3,4의 이미징에 성공적으로 적용 될 수 있습니다. ,15. 기술은 형광 분자 사용법에 있는 뜻깊은 감소를 제공 하며 10-20는 흐름 셀 시스템5, 혈액 및 다른 조직에서 기본 인간 T 세포를 분석 하는 기회를 만들기에 비해 적은 T 세포 배.

이 연구에 사용 된 삽입 된 셀의 수를 사용 하 여 이미지 이미징 60 X 목표 필드 당 약 50 셀 수 있었습니다. 더 큰 농도 결과 셀 집계, 분석에 적합 하는 셀의 수를 감소. 우리 더 10-50 x, 삽입 된 셀의 수를 줄일 수 있지만 휴대폰 번호에의 한 셀이, 이미징 분야의 수 및 실험 설계를 따라 다릅니다. 일부 조사는 이전 bilayers 분석16셀의 유사한 수를 요구 하는 유리 바닥 오픈 챔버를 내장을 사용 했다. 그러나, 설명, 채널 높이 0.1-0.4 m m의 닫힌된 시스템 동기화 셀 첨부 파일 및 액체 증발의 위험 없이 T 세포 응답의 분석을 빠른 셀 침전 수 있습니다. 스티커 슬라이드 시스템 추가 채널 당 최대 3 개의 bilayers의 대형을 허용합니다. 따라서, 동일한 셀 샘플 물질로의 다른 성분과 독특한 bilayers에 셀 행동의 분석, 접착, 및 costimulatory 분자 사용 될 수 있습니다.

스티커 슬라이드와 성공적인 bilayer 형성에 대 한 coverslips의 조립 하는 동안 몇 가지 예방 조치를 취해야 한다. 특히,는 coverslips는 완전히 건조, 유리 표면 세척 절차 bilayer 동안 누설에 발생할 수는 작은 양의 액체에 왼쪽으로. 중요 한 것은, (3.4.1 단계에서와 같이) 누설을 피하기 위해 폴 리 프로필 렌가 위 형 집게의 외부 반지와 접촉의 가장자리에 연결 된 coverslip도 필수적 이다. 그것은 또한 모든 채널의 엔트리 포트에 버블링 하지 않도록 하는 것이 중요입니다. 어떤 거품 채널 입력, 그들은 거의 제거 하 고 채널에서 bilayer를 망칠 수 없습니다. 마찬가지로, 그것은 어떤 빠른 pipetting, 때문에 액체의 난 류 수 있습니다 채널에 거품을 소개 하 고는 bilayer를 손상 하지 않도록 하는 것이 중요.

Cytolytic 알갱이의 릴리스는 T 세포 bilayer 인터페이스에서 CD107a의 외관에 의해 감지 됩니다. 알 렉 사 Fluor-568-표시 된 안티-CD107a 항 체의 fab 지구는 bilayers에 로드 하기 전에 CD8 T 세포에 추가 됩니다. TIRF 현미경 이용 지역 약 100를 밝히는 사라져 웨이브는 영상의 수직 해상도 증가 시킬 수 있도록 사라져 볼륨으로 정의 된 볼륨에서 bilayer 위의 nm. 37 ° C에서 사라져 볼륨 내에서 매우 빠르게 확산, 항 체 Fab 분류 감지 형광 신호를 생성 하지 않습니다. CD107a 막 단백질은 T에 나타납니다 용균성 분자와 세포 막에 포함 된 특수 리소좀의 막 융합 중 셀 문의 고유 위치에 표면. 팹 받을 당시에 CD107s 단백질에 바인딩됩니다. CD107a 단백질에 부착 된 형광 표시 Fab(s) TIRF 현미경 검사 법, T 세포 degranulation의 지표에 의해 밝은 형광 탐지를 생성 하는 움직이지 클러스터 형성.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작업을 지원 했다 마이클 R. Betts에 R01AI118694 NIH 교부 금에 의해 하위 수상 566950 유리 Sykulev 포함. 우리는 Sidney Kimmel 암 센터 Bioimaging 공유 리소스 그들의 탁월한 지원 위한 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD4 T cell isolation kit, human Miltenyl Biotec 130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human Miltenyl Biotec 130-096-495
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
DOGS NTA Avanti Polar Lipids 790528C
Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids 870273C
Human Serum Albumin Octapharma USA NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4 ibidi 80608
Coverslips for sticky-Slides ibidi 10812
Bioptech FCS2 Chamber Bioptech 060319-2-03
anti-CD3 antibody Thermo Fisher Scientific 16-0037-81 OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody Genetex GTX14664 9.3 clone
Casein Sigma C5890
Biotin-PEO4-NHS Thermo Fisher Scientific 21329
DMSO Sigma D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10238
Amersham Cy5 NHS Ester GE Life Science PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors Thermo Fisher Scientific V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection ATCC 37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS Lonza 12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4 ATCC CRL1878 The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B Sigma-Aldrich C9142 Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator Cole-Parmer 77601-60 7592-40 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems Pall Laboratory FS002K10 OS010T12 FS005K10 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30210
Dialysis tubing Spectra/Por 131384
Papain from papaya latex Sigma P3125
mouse anti-human antibody against CD107a BD Bioscences 555798 Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves Fisher Scientific 19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps Thermo Fisher Scientific 6320-0010
Streptavidin ProZyme SA10
Confocal microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope Andor Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software Molecular devices

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References

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면역학 그리고 감염 문제 137 기본 인간 T 세포 말 초 혈액 림프절 평면 지질 bilayers 구조 시 냅 스 인터페이스
말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가
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Steblyanko, M., Anikeeva, N., Buggert, M., Betts, M. R., Sykulev, Y. Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58143, doi:10.3791/58143 (2018).

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