Summary
Intraluminal glødetrådens okklusion af den midterste cerebral arterie er den hyppigst anvendte i vivo model af eksperimentelle slagtilfælde i gnavere. En alternativ kirurgisk tilgang til at tillade fælles halspulsåren reparation udføres her, som tillader reperfusion af den fælles halspulsåren og en fuld reperfusion til den midterste cerebral arterie område.
Abstract
Iskæmisk slagtilfælde er en væsentlig årsag til voksen langsigtede handicap og dødsfald på verdensplan. De nuværende behandlinger er begrænset, med kun væv plasminogen aktivator (tPA) som et godkendt medicinsk behandling til at målrette iskæmisk slagtilfælde. Aktuel forskning inden for iskæmisk slagtilfælde fokuserer på bedre forståelse Patofysiologi af slagtilfælde, at udvikle og undersøge roman farmaceutiske mål. Pålidelige eksperimentelle slagtilfælde modeller er afgørende for udviklingen af mulige behandlinger. Den midterste cerebral arterie okklusion (MCAO) model er klinisk relevant og de hyppigst anvendte kirurgisk model af iskæmisk slagtilfælde i gnavere. Resultaterne af denne model, som læsion volumen, er dog forbundet med en høj grad af variabilitet, især i mus. Den alternative MCAO model beskrevet her tillader reperfusion af den fælles halspulsåren (CCA) og den øgede perfusion af den midterste cerebral arterien (MCA) område, ved hjælp af en væv pad med fibrinogen-baserede fugemasse til at reparere fartøjet, og den forbedrede velfærd i mus ved at undgå eksterne halspulsåren (ECA) ligatur. Dette reducerer afhængigheden af kredsen af Willis, som er kendt for at være yderst anatomisk variabel i mus. Repræsentative data viser, at bruge denne alternative kirurgisk tilgang falder variabilitet i læsion mængder mellem de traditionelle MCAO tilgang og den alternative fremgangsmåde beskrevet her.
Introduction
En væsentlig årsag til cerebral apopleksi er fokal iskæmi i området af den midterste cerebral arterie. Væv plasminogen aktivator (tPA) er det kun farmakologiske behandling med dokumenteret effekt, på trods af talrige kliniske lægemiddelforsøg målrettet til iskæmisk slagtilfælde1,2. Men på grund af sikkerhedsproblemer og et smalt terapeutisk vindue (< 4,5 h), kun ~ 15% af alle slagtilfælde patienter er berettiget til at modtage tPA, og recanalization priser kan være < 50%3,4.
Reproducerbare og klinisk relevante dyremodeller for slagtilfælde betragtes som væsentlige at informere udviklingen af nye og potentielle slagtilfælde terapeutiske behandlinger. På grund af bekymringer vedrørende konsistens og variation i resultaterne med dyremodeller er det imidlertid vigtigt at forfine eksisterende i vivo modeller for at forbedre oversættelse fra prækliniske undersøgelser til klinikken. Manglen oversættelse fra prækliniske eksperimentelle effekten af potentielle behandlinger til klinisk brug er en fortsat bekymring for slagtilfælde forskning5. Årsager til manglende oversættelse er tilbøjelige til at være flere og kan være relateret til for eksempel forsøgsdesign, behandling forsinkelser, kliniske slagtilfælde heterogenitet, og begrænsninger af de dyremodeller bruges6. En central udfordring for slagtilfælde forskning er fortsat udvikling af sikre og effektive behandlinger.
Midterste cerebral arterieokklusion (MCAO) af intraluminal glødetrådens indsættelse er den hyppigst anvendte i vivo gnaver model af eksperimentelle slagtilfælde. Denne model giver mulighed for restaurering af blodgennemstrømningen efter en iskæmi induktion, efterligne hændelser, som forekommer i menneskelige slagtilfælde7. Dog ske især i mus, heterogene læsion diskenheder med varieret standardafvigelser selvom defineret kirurgisk protokoller er anvendt8,9,10. Det er typisk at se en bimodal fordeling af små striatal og store striato-kortikale læsion bind11. For at fremkalde iskæmi, er glødetråden typisk indsættes gennem et snit i CCA eller ECA, der forbliver permanent sammenskrevne12. Den permanente ligatur af CCA forhindrer genoprettelsen af blodgennemstrømningen i den interne halspulsåren (ICA) og efterfølgende MCA område. Dette forårsager reperfusion at være afhængige af den sikkerhedsstillelse levering inden for kredsen af Willis (ko). Ko struktur har anatomiske variabiliteten mellem enkelte dyr, især i C57BL/6 mus-en stamme bruges typisk i i vivo slagtilfælde forskning13. En alternativ metode, af glødetrådens isætning gennem Revisionsretten, tillader den fortsatte perfusion gennem CCA, men denne metode kompromiser den arterielle forsyning ECA-område, som har været vist i rotter, at have en skadelig virkning på dyrets velvære14.
Afhængigheden af ko for sikkerhedsstillelse forsyning og reperfusion i den etablerede MCAO model kan delvis højde for læsion volumen variabilitet efter okklusion. Vi beskriver en alternative murine kirurgisk procedure, hvor Revisionsretten ligatur undgås og CCA indsnit er repareret, således tillader reperfusion gennem CCA, uafhængig af koen. Reparation af CCA snit har tidligere vist i rotter at resultere i en vellykket reperfusion gennem CCA15. Vi har anvendt denne fremgangsmåde med succes i mus11 og rapportere her den protokol, som resulterer i en reduceret variation i læsion volumen, Hovedresultatet måleenhed i eksperimentel slagtilfælde undersøgelser.
I denne protokol vise vi hvordan du kan foretage MCAO gennem CCA fartøj glødetrådens indsættelse efterfulgt af CCA fartøj reparation, som indebærer en væv pad og fugemasse ansøgning tillade reperfusion.
Protocol
Denne protokol og de indberettede oplysninger blev gennemført i overensstemmelse med loven om britiske dyr (videnskabelige procedurer), 1986 (projekt licens 60/4315) og efter institutionelle etisk godkendelse. Alle forsøg er rapporteret i overensstemmelse med den dyre forskning: rapportering af In Vivo forsøg (kommer) retningslinjer16.
1. forberedelse
- Stifte voksne mandlige C57BL/6 mus til postoperativ pleje (fx, miljø, sengetøj, recovery fødevarer) mindst 48 timer før operationen.
Bemærk: Post-MCAO dyr ofte har problemer med at spise og drikke efter operationen.- For at forhindre overdreven vægttab efter kirurgi, akklimatisere dyrene til enhver post-MCAO kost, for eksempel placere rehydrering gel, gel mad og gennemblødt/våd normal kost piller direkte på bur gulv.
- Ændre bur strøelse til postoperativ senge, som hvidbogen chip.
- Sterilisere alle kirurgiske værktøjer før begyndelsen kirurgisk set-up eller procedurer.
- Gøre dette ved autoklavering værktøjer (med et minimum af 121 ° C, 15 psi, for 15 min) eller ved hjælp af ethylenoxid (efter den korrekte brugsanvisningen, for 8-10 h).
- Desinficere alle overflader før opsætning af proceduren. Dække alle overflader med steril kirurgiske gardiner eller autoklaveres folie for varer, der kræver håndtering under operationen. Bruge aseptisk teknik for procedurens varighed.
Bemærk: Autoklaveres folie kan bruges til at dække de instrumenter eller udstyr, som skal afholdes under operationen. Bruger sterile handsker og teknikker, folien kan anvendes, og derefter varen kan placeres i den sterile felt. Efter denne, vil en steril handske ændring være påkrævet.
2. midt Cerebral arterie okklusion kirurgi
- Bruge voksne mandlige C57BL/6 mus vejer 24 – 31 g på tidspunktet for operationen. Fremkalde anæstesi ved hjælp af 5% isofluran i 2 L/min. O2, i en rød plastik anæstesi kammer.
- Efter induktion, reducere isofluran til at opretholde en tilstrækkelig anæstesi dybde for kirurgi(, 1.5 – 2% i 70% N2O2/30% O2),leveret af ansigtsmaske kombineret med en ådselsæder system til at sænke kirurgens eksponering for isofluran.
Bemærk: lattergas (N2O2) kan bruges i kombination med ilt (O2) til at reducere den nødvendige mængde af isofluran til en passende anæstesi dybde. - Administrere systemisk analgesi før indgrebet [carprofen, 10 mg/kg subkutant (sc.)] og lokal anæstesi til indsnittet site (bupivacaine, 2 mg/kg sc., fortyndes 1:10 i 0,9% saltvand) peri-operativt.
- Administrere væsker ved intraperitoneal (ip.) injektioner af 200 µL sterilt forvarmet 0,9% NaCl opløsning før indgrebet.
- Barbere pels af ret tidsmæssige regionen og ventrale halsregionen ved hjælp af små hårklippemaskiner for at udsætte huden. Desinficere området kirurgiske huden, ved hjælp af en 5% klorhexidin løsning i 3 min. Anvend okulær smøremiddel på begge øjne, der forhindrer dem i tørring under operationen.
Bemærk: Hvis det er påkrævet for puls oximetri målinger til at overvåge blod iltmætning, puls og vejrtrækning, bruge Hårfjerningscreme for at rydde bagben af hår. Påføring af cremen ved hjælp af ren bomuld knopper, og efter hårfjerning, vaske området med den fortyndede chlorhexidin løsning. Udføre dette trin i en præoperativ område at minimere risikoen for løs pels forurener den steril kirurgiske felt. Forskere måske foretrække at bruge andre operationsstedet forberedelser overensstemmelse med lokal praksis. - Overføre musen til det kirurgiske område og placere den i den liggende stilling på en varmblodet heat mat er omfattet af en steril drapere. Opretholde anesthesia via en næsen kegle. Indsæt en rektal sonde for at overvåge den mus kropstemperatur og vedligeholde det 37.0 ± 0,6 ° C.
- Forud for enhver kirurgisk snit, kontrollere bagben pote tilbagetrækning refleks og blinke refleks for at bekræfte anæstesi dybde.
- Vedhæfte en laser Doppler flowmetry (LDF) sonde for at optage blodtilførslen til MCA område.
- Brug en dissektion Stereoskopet, gøre et snit på < 1 cm ved midtpunktet mellem højre øje og øre på udsatte tidsmæssige huden ved hjælp af en skalpel nr. 15. Ligeud dissekere det underliggende væv der dækker kraniet, forsigtigt skrabe det væk fra knoglen og tørring overfladen med steril vatsvabere.
Bemærk: Pleje skal tages ikke at beskadige temporalis musklen. - Tag fat om 0,7 mm, fleksibel fiberoptisk enkeltsonde knyttet til LDF skærm, skære sin afslutning ved hjælp af en skarp skalpel til at få en flad kant, presse dette igennem doughnut-formet sonde indehaveren og placere en lille mængde af optiske matchende gel for enden af fiber.
- Placer en lille mængde af vandtæt super-klæbende lim omkring den nederste kant af sonden indehaveren; tillade, at denne delvis tørre og blive tacky.
- Tørre kraniet ovenfor den tidsmæssige knoglen og placere en lille mængde af aktuel væv lim i en cirkel på knoglen, lige nok til indehaveren af sonden.
- Sæt holderen sonde med fiber optik sonde allerede på plads på dette område (6 mm lateral og 2 mm distale fra bregma).
- Give tid til limen tørrer; Når tør og vedhæftede, begynde at optage LDF data.
- Brug en dissektion Stereoskopet, gøre et snit på < 1 cm ved midtpunktet mellem højre øje og øre på udsatte tidsmæssige huden ved hjælp af en skalpel nr. 15. Ligeud dissekere det underliggende væv der dækker kraniet, forsigtigt skrabe det væk fra knoglen og tørring overfladen med steril vatsvabere.
- Forsigtigt slå dyret over til en liggende stilling, at tage sig at støtte laser Doppler sonden og forhindre sin udstationering. Forsigtigt tape de to forepaws ned med Mikroporøs medicinsk tape, glider et par af bomuld knopper (eller noget lignende, som lukkede pincet) under halsen for at løfte området og skabe spænding. Dække mus med en steril drapere at opretholde aseptisk dækning.
- Begynde dissektion og eksponering af CCA.
- Gøre en 1,5 cm midterlinjen snit på udsatte ventrale halsen ved hjælp af en No. 15 skalpel klinge.
- Brug blide stump dissektion teknikker, forsigtigt trække spytkirtlerne til siderne, udsætter luftrøret.
- Bruger stump dissektion, dissekere CCA gratis fra de omkringliggende væv og vagus nerve.
Bemærk: Undgå at berøre den vagale nerve direkte, som skader den vagus nerve kan forringe mobilitet, fodring, og vejrtrækning.
- Pass to små (2 cm) dele af en ikke-opløselige 6-0 sutur nedenfor CCA, dorsal til fartøjet og ventral at den vagale nerve. Tegne en silke slips tættere til kirurgen og binde det stramt omkring CCA (proksimale slips). Løst binde den anden silke slips (distale slips) mod tvedeling af ICA/ECA.
- Til at begynde at isolere en del af CCA, anvende en mikrovaskulære klippet lige over den distale slips men ikke hindre tvedeling. Brug mikro markriyor saks, lave et lille hul i CCA.
Bemærk: Revisionsretten skal forblive patent på alle tidspunkter. CCA snit skal ikke mere end 40% af bredden af fartøjet og i en lettilgængelig ventrale holdning; Dette vil spille en vigtig rolle i fartøjet reparation stage post-MCAO. - Indsæt en 7-0 silikone-belagt monofilamenter i CCA, rykkede mod mikrovaskulære klippet.
Bemærk: Glødetrådens størrelse skal fastsættes baseret på musens vægt forud for kirurgi; henvise til producentens retningslinjer.- Spænd den distale slips, nok til at fastgøre glødetråden på plads uden at beskadige den. Fjerne mikrovaskulære klippet ved hjælp af klip indehavere.
Bemærk: Ingen blodtab bør ses på dette punkt. Hvis der er en tilbagestrømning af blod, er slips holding glødetråden ikke stramme nok.
- Spænd den distale slips, nok til at fastgøre glødetråden på plads uden at beskadige den. Fjerne mikrovaskulære klippet ved hjælp af klip indehavere.
- Forhånd glødetråden i ICA.
- Sikre glødetråden forbliver i ICA og ikke går ind i pterygopalatine arterie (PPA). Gøre dette ved lidt løft og trække CCA, ved hjælp af de silke bånd, til den udvendige side af dyrets krop, og styre glødetråden bøje forbi den internt vendende åbning i LBPF.
Bemærk: Når avancerede til MCA gren oprindelse, vil en dråbe i relative blodtilførslen til den medfølgende område være synlig på LDF værdier; Dette bekræfter glødetrådens placering.
- Sikre glødetråden forbliver i ICA og ikke går ind i pterygopalatine arterie (PPA). Gøre dette ved lidt løft og trække CCA, ved hjælp af de silke bånd, til den udvendige side af dyrets krop, og styre glødetråden bøje forbi den internt vendende åbning i LBPF.
- Sikre glødetråden i sted med den distale silke slips, binde det strammere. Lad det i stedet for varigheden af okklusion tidsperiode.
Bemærk: Afhængig af om individuelle protokoller, dyret kan være flyttet til et opsving bur, følgende sår sutur for at inddrive, eller forblive under anæstesi for varigheden af perioden okklusion. I sidstnævnte tilfælde skal sikre, at såret er forhindret i at udtørre ved hjælp af steril forvarmet 0,9% NaCl saltvand.
3. efter okklusion
- Ultimo perioden MCAO straks trække glødetråden indtil hvid glødetrådens hoved er klart synlige.
- Derefter, løsne den distale CCA binde lige nok til at fjerne glødetråden hoved det meste af vejen ud af fartøjet.
Bemærk: Glødetråden kan være fuldt fjernet på dette tidspunkt hvis kirurgen er fortrolig med hastighed til at binde den distale slips for at forhindre blodtab af. - Placere en mikrovaskulære multimedieklip i en vandret position mod CCA tvedeling ved siden af den distale slips. Løsn den distale slips og fjerne glødetråden fuldt ud. Tilføje en anden mikrovaskulære klippet nedenfor den proksimale CCA uafgjort mod kirurgen.
Bemærk: Sikre, at fartøjet er langt nok ind i tænderne af klemme til at forhindre en glidning. Placeringen af klippene er afgørende at sikre klip flyttefirma nem adgang under senere trin. Klippene kan bruges til at hjælpe løfte fartøj til at give en bedre frihøjde og placeringen af væv patch, placere udklippene vandret på tværs af de omkringliggende muskler. - Forsigtigt fjerne begge silke bånd ved hjælp af Dumont #5 pincet eller mikro markriyor saks og tørre området ved hjælp af steril vatpinde.
Bemærk: Pleje skal tages ikke til at skære igennem/i fartøjet. - I en steril petriskål, tilføje fibrinogen og thrombin fugemasse løsninger 1 og 2 (Se Tabel af materialer), at sikre de to stoffer bo separat, klar til at blande senere.
Bemærk: Kun meget små mængder af agenterne er påkrævet (< 0,25 mL hver). At holde løsningerne separat forhindrer en tidlig reaktion mellem de to bestanddele. For fælles landbrugspolitik erstattes på samme måde som det er blevet fjernet for at undgå krydskontaminering af de to sprøjter, som ville forårsage agent til at reagere og ligger i sprøjten. Før brug, gemme løsninger ved-20 ° C. Når det er påkrævet for den første operation, tø fugemasse til stuetemperatur. Ikke genfryses fugemasse; Det skal forblive ved stuetemperatur og kan opbevares på denne måde. Sprøjten kan anvendes på tværs af flere operationer at gøre det omkostningseffektivt; Vi anbefaler dog ikke at bruge den samme hætteglas til længere end 1 uge til at forhindre forurening. - Bruge stump dissektion langs musklen med Dumont 5 pincet og mikro markriyor saks til at opnå en tynd ventrale skive af sternocleidomastoideus musklen til at bruge til væv pad, at sikre, at udsnittet er ikke mere end 1 mm tyk og løber langs den øverste fibre af musklen.
Bemærk: Ikke skære gennem/over musklen, som dette væsentligt vil forringe dets funktion. Vævet skal være stor nok til at dække CCA indsnit komfortabelt. - Brug Dumont #5 pincet, tage væv pad og bland vævet jævnt på tværs af de to fibrinogen og thrombin fugemasse løsninger, danner en kanal mellem de to reagenser. Koagulering vil opstå hurtigt; så snart koaguleringen begynder, fjerne væv pad til CCA snit. Placer væv pad fladt ned med en mellemlang fast tryk og åbne pincet.
- Hurtigt fjerne den distale mikrovaskulære klip, mens du stadig forsigtigt holde væv puden på plads.
Bemærk: Dette giver mulighed for nogle tilbagestrømning af blod til yderligere aktivere fibrinogen og thrombin fugemasse reagenser. Lige nok pres er nødvendigt at holde puden på plads, men ikke helt blokere fartøjet. - Langsomt mindske presset fra væv pad, at tillade blodet at flyde under området indsnit. Nu, langsomt og forsigtigt frigive trykket fra den proksimale mikrovaskulære klip og helt fjerne.
- Bemærk: For at sikre, at skibet bliver fuldt patent, placeringen af væv pad og fjernelse af mikrovaskulære klippene skal foretages hurtigt for at forhindre forsegling væv pad til indersiden af CCA. Men hvis der er en lille mængde blod lækage, igen placere nogle let tryk på væv puden til at give yderligere tid for koageldannelse og forsegling til at opstå. Hvis blod lækage er væsentlig eller væv pad synes ikke at være forsegling, opretholde presset for at forhindre blodtab af og erstatte begge CCA mikrovaskulære klip for at isolere indsnittet og forhindre yderligere blodtab af.
- Hurtigt fjerne den distale mikrovaskulære klip, mens du stadig forsigtigt holde væv puden på plads.
- I tilfælde af væv pad ikke forsegle fartøj, kan et andet forsøg foretages, efter trin 3.3 – 3.7.3.
- Når fartøjet er forseglet, sutur såret ved hjælp af opløselige 6-0 sutur. Hvis LDF optagelse blev videreført i hele kirurgi, fjerne LDF fra kraniet og sutur sår ved hjælp af opløselige 6-0 sutur.
4. postoperativ pleje
- Placere dyret i en forvarmet recovery bur (beliggende på et opvarmet hylde/mat ved 35 ° C, eller inden for et opvarmet kammer).
Bemærk: Forskere måske foretrække at bruge andre temperaturer og varigheder overensstemmelse med lokal praksis. - Give alle dyr med 200 µL forvarmet 0,9% NaCl saltvand sc. umiddelbart efter operationen, på 4 timer efter operationen, og 2 x dagligt i 72 timer.
Bemærk: Administration af forvarmet 0,9% NaCl er dyr førte. Hvis mere er påkrævet, kan mere væske gives for at sikre en god bedring. - I opsving bur, give dyr ubegrænset adgang til klamme kost piller, tørre kost piller, rehydrering gel og gel mad, sammen med ad libitum adgang til vand.
- Gentag sc. carprofen injektion på 24 timer efter operationen (Se trin 2.3).
Bemærk: Alle dyr modtaget den samme dosis af carprofen; eventuelle neuroprotektive virkning forventes at være ubetydelig. - Med jævne mellemrum for 48 h, udføre post-op mus grimasse scoring17 for at vurdere smerte niveauer for at støtte beslutningen om at administrere yderligere analgesi.
- Veje dyr umiddelbart før operationen og derefter dagligt efter proceduren. Udføre daglige observationer og komplet velfærd ark til at overvåge deres mad og vandindtag og kliniske tegn.
- Foretage funktionelle observationer på 24 og 48 timer efter operationen. Vurdere mus på skalæn fokale underskud. Evaluere deres krop symmetri, obligatorisk cirkling, gangart, 45° gitter klatring, kredser adfærd, forreste lemmer asymmetri og bakkenbart touch svar18,19,20.
5. Magnetic Resonance Imaging og billedbehandling
- Måle læsion volumen (LV) ved hjælp af strukturelle magnetisk resonans imaging (MR).
Bemærk: Alternative metoder, såsom histologiske farvning med triphenyltetrazolium chlorid (TTC), har tidligere været brugt og korrelere til strukturelle Mr data. Denne metode kan dog kun bruges på slutpunktet af en undersøgelse og ikke på langs. Med langsgående MR scanning vil reducere antallet af dyr, der kræves for en undersøgelse.- Efter 48 timer, efter induktion af MCAO, bedøver mus med isofluran (5% isofluran i 1 L/min O2 for induktion), 1.5 – 2% isofluran for vedligeholdelse.
- Overføre musen til Mr vugge, placere den på respiration sensor for at overvåge sin vejrtrækning, og implantat rektal temperatur sonde for at overvåge dens temperatur under scanningen. Sted 2-kanals mus-hjerne RF modtage coil over hjernen for et signal og sted vugge i en 9,4 T horisontale bore scanner.
Bemærk: Her, en volumen spole med en indre diameter på 72 mm blev brugt til RF-transmission. - Erhverve T2-vægtede scanninger ved hjælp af en hurtig spin-ekko sekvens. Angiv gentagelse tid (TR) til 3,000 ms og echo tid (TE) til 40 ms. brug 18 mm x 18 mm som field of view (FOV), og få et 256 x 256 erhvervelse matrix med skiver af 18 mm x 0,8 mm og tre signal gennemsnit i ca 10 min.
- Erhverve diffusion tensor billeder (DTI) ved hjælp af en hurtig spin-ekko sekvens. Indstille TR til 1,730 ms, TE til 35 ms, FOV til 20 mm x 20 mm, og opnå en 128 x 128 erhvervelse matrix med skiver af 16 mm x 1 mm, to signal gennemsnit, 14 diffusion kodning retninger og en maksimal b-værdi på 1.024 s/mm2.
- Måle LV på T2-vægtede billeder ved hjælp af en visning og måle softwarepakke. Måle den lesioned område, sammenholde værdierne sammen for at beregne den samlede læsion volumen under hensyntagen til Mr skive tykkelse (angivet under MR-scanning).
- Tage hensyn enhver hævelse og procentdelen af området læsion diskenheder mens måling den fulde kontralaterale og ipsilaterale halvkugle. Korrekt for enhver hjernen hævelse på grund af ødem efter en indirekte metode til at måle læsion volumen som beskrevet tidligere21,22. Kun omfatte udsnit, der indeholder cortex væv og ikke frontallappen eller lillehjernen væv ifølge en standardmus hjernen atlas til at undgå overcorrection.
- Måle læsion diffusion parametre og få de kerne og penumbra regioner af interesse.
- Generere tilsyneladende diffusion koefficient (ADC) og fraktioneret anisotropy (FA) kort fra diffusion tensor billeder ved hjælp af passende Mr analyse software.
- Juster DTI billeder med T2-vægtede billeder ved hjælp af passende billede analyse software i stand til at udføre en lineær registrering af billeder. Efter registrering, skal du trække diffusion-vægtede læsion masker (iskæmiske kerne) fra T2-vægtede læsioner masker (iskæmiske kerne og penumbra) til at anslå penumbra regionen. Anvende de resulterende masker (core og penumbra) til ADC og FA kortene til at kvantificere diffusion parametrene inden for kerne og penumbra.
- Oversætte ipsilaterale kernen og penumbra maskerne om hjernen midterlinjen for at få de kontralaterale ADC og FA værdier for sammenligning.
Representative Results
I alt 24 voksne mandlige C57BL/6 mus, vejer mellem 24 – 31 g på tidspunktet for kirurgi, blev anvendt i undersøgelsen. Et dyr døde efter midt cerebral arterieokklusion (MCAO) og en blev udelukket på grund af kirurgiske komplikationer. De data præsenteres her er taget fra en tidligere offentliggjort arbejde af forfatterne. Disse blev brugt til at illustrere effekten af fartøjet reparation på MCAO resultater11. Alle data er udtrykt som thr gennemsnit ± standardafvigelse. Dataene var statistisk vurderes for normale tilstande ved hjælp af D'Agostino-Pearson omnibus normalitet test. Parametriske data blev sammenlignet ved hjælp af Student's t-test (for to middelværdier) og en-vejs ANOVA med Sidak test (flere midler). Non-parametriske data blev sammenlignet ved hjælp af Mann-Whitney U test. Variation af parametriske data blev vurderet ved hjælp af en F-test, og ikke-parametriske data variation blev vurderet ved hjælp af Levene's test.
Typisk i MCAO procedurer, occluding glødetråden er indsat i CCA og Revisionsretten er forbundet for at forhindre denne glødetråden i at passere ind i Revisionsretten snarere end ICA. En undgåelse af ECA ligatur og tilsætning af analgesi viste en tendens i retning af reduceret vægttab på 48 h post-MCAO, sammenlignet med data fra tidligere undersøgelser foretaget af den samme kirurg for samtidig MCAO bruger Revisionsrettens ligatur med ingen analgesi, hvorimod LV syntes upåvirket, se figur 1.
Mus undergik en 60 min MCAO-induceret iskæmi efterfulgt af reperfusion med CCA fartøj reparation eller med den typiske ligatur af CCA tilgang. En skematisk af den sammenskrevne og unligated repareret CCA er vist i figur 2.
Laser Doppler flowmetry blev brugt til at bekræfte blod flow perfusion område af MCA på MCAO, før og efter CCA fartøj reparation. Figur 3 viser, at 5 min efter glødetrådens fjernelse, regional cerebral blood flow (rCBF) steg betydeligt i regionen hjernen af MCA. Perfusion blev opretholdt indtil fartøjet reparation, med en stigning i perfusion MCA område vist efter CCA fartøj reparation, tyder på, at CCA reparation tilladt en øget blodgennemstrømning perfusion iskæmiske område i forhold til afhængighed på i kredsen af Willis alene.
T2-vægtet Mr blev brugt til at bestemme den samlede LV, og DTI scanninger blev brugt til at bestemme core LV, 48 timer efter MCAO. Figur 4A viser ingen signifikant forskel i den samlede eller core LV mellem reparation og sammenskrevne procedure grupper. Imidlertid data variation for både samlet og core LV, vurderet ved hjælp af Lavene's test for ikke-parametrisk eller F-test for parametriske data, blev markant reduceret i gruppen CCA reparation. Den samlede LV var opdelt i kortikale og subkortikale LV, som vist i figur 4B. Den kortikale del var betydeligt mindre variabel i gruppen CCA reparation mens den sub kortikale del af læsionen var upåvirket mellem de to proceduremæssige grupper.
En power analyse viste, at færre dyr pr. behandling gruppe ville være forpligtet til at påvise en 30% reduktion i LV efter MCAO ved hjælp af CCA reparation kontra den typiske CCA-forbundet procedure, se tabel 1. En overtagelse af magten 1-β = 0,8 og signifikansniveau α = 0,05 og en forudsigelse af 30% reduktion i LV mellem hypotetiske kontrol og test grupper blev anvendt til analysen af magten. Derudover blev en ens varians antaget mellem grupperne. Tabel 1 viser antallet af dyr, der kræves til test og kontrolgrupper når bruges enten den typiske CCA-forbundet metode eller den opdaterede CCA reparation metode, som beskrevet her, bruges. Bemærk, at testgruppen refererer til en hypotetisk behandlede gruppe af dyr og kontrolgruppen refererer til en hypotetisk kontrolgruppe; begge grupper vil gennemgå MCAO.
Figur 1: kombineret analgesi behandling og udeladelsen af ECA ligatur på resultater efter MCAO. (A) kropsvægt, vist som en procentdel af pre-MCAO vægt, faldt den første 2 d efter MCAO for begge grupper. Gruppen ECA-unligated (analgesi-behandlet med ingen ECA ligatur på MCAO) viste en tendens i retning af reduceret vægttab på den anden dag efter MCAO. (B) dette panel viser læsion volumen (mm3) målt ved standard triphenyltetrazolium chlorid (TTC) farvning 48 timer efter MCAO. De viste data er gennemsnit ± standardafvigelse. ECA forbundet: n = 17, ECA unligated: n = 10. Dette tal er blevet ændret fra Trotman-Lucas et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk viser den standard CCA-metoden og de alternative CCA reparere metode efter MCAO. (A) denne skematiske skildrer en permanent sammenskrevne CCA ved hjælp af ikke-opløselige suturer anvendes på begge sider af CCA indsnit, hvilket resulterer i den permanente ligatur af den rigtige CCA. (B) denne skematiske skildrer den alternative CCA reparation metode. En lille væv pad belagt med fibrinogen og thrombin fugemasse bruges til at dække CCA indsnit, forsegling for at give den fuld perfusion af højre CCA. Dette tal er blevet ændret fra Trotman-Lucas et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Regional cerebral blood flow (rCBF) parametre efter MCAO. RCBF ændret 5 min efter MCAO glødetrådens fjernelse for begge CCA-forbundet og CCA-repareret grupper (post-MCAO), i forhold til rCBF målt under MCAO. Dette panel viser rCBF data umiddelbart før CCA fartøj reparation (før reparation) og 5 min efter CCA reparation (efter reparation). Betydelige stigninger i rCBF er vist 5 min efter glødetrådens fjernelse (post-MCAO) i begge grupper. En yderligere stigning i rCBF er vist efter CCA reparation (efter reparation) i gruppen CCA reparation. Ingen forskel i rCBF er vist mellem 5 min post-MCAO og før reparation. De viste data er fortættet fra den analyserede tidsforløb data rapportering centrale tidspunkter, her som gennemsnit ± standardafvigelse. CCA forbundet: n = 10, CCA repareret: n = 10; P < 0,01, ***P < 0,001, ns: ikke-væsentlig. Dette tal er blevet ændret fra Trotman-Lucas et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: analyse af læsion volumen opnås ved Mr teknikker. (A) dette panel viser læsion volumen (LV; mm3) på 48 timer efter MCAO, samlede LV taget fra T2-vægtet Mr billeder (samlede LV) og kerne LV taget fra DTI scanninger og analyse (Core LV). Repræsentative billeder viser den samlede læsion diskenhed fra en T2 scan skive billede med DTI core læsion volumen masken anvendes. Variation inden for grupperne var væsentligt reduceret for begge samlede LV (P = 0,015, CCA reparation: n = 10, CCA forbundet: n = 10, F-test) og kerne LV (P = 0.043, CCA reparation: n = 9, CCA forbundet: n = 6, Lavene's test), vurderet ved hjælp af en F-test for parametriske data eller Levene's test for ikke-parametriske data. (B) dette panel viser LV på 48 timer efter MCAO, taget fra T2-vægtet Mr billeder og opdelt i kortikale og subkortikale læsion områder. CCA reparation betydeligt reduceret data variation (P = 0,03, F-test) i den kortikale del af læsion, men ingen effekt på dataene variabilitet i den subkortikale del af læsion blev vist. CCA reparation: n = 10, CCA forbundet: n = 10. De viste data er gennemsnit ± standardafvigelse. # P < 0,05 (F-test), xP < 0,05 (Lavene's test). Dette tal er blevet ændret fra Trotman-Lucas et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Tilgang | Læsion volumen (LV; mm3; gennemsnit ± SD) |
Magt | Signifikansniveau | Anticiapted forskel | Gruppestørrelse kræves |
| CCA forbundet (traditionel tilgang) | 94.08 ± 53.79 | 0,8 | 0,05 | 30% | n = 58 |
| CCA repareret (ny metode) | 51.73 ± 22.78 | 0,8 | 0,05 | 30% | n = 35 |
Tabel 1: repræsentative magt analyse sammenligne traditionel CCA ligatur med alternativet CCA reparere metode forklares her. Denne tabel viser de power analyse for at beregne den forventede Gruppestørrelse forpligtet til at påvise en signifikant forskel i LV mellem en kontrolgruppe, den traditionelle eller alternative (nye) tilgang og en testgruppe (forventet). Tabellen viser gruppen størrelser som kræves hvis en strøm af 0,8 antages, et signifikansniveau på 0,05 er anvendt, og hvis forudsagte test-gruppe viser en forskel på 30% i LV sammenlignet med kontrolgruppen. Tabellen viser resultaterne for begge MCAO tilgange (CCA-forbundet og CCA-repareret) til at afgøre, om der er en forskel i antallet af dyr, der kræves for at få en 30% forskel i LV. For begge metoder antages en ens varians mellem testen og kontrolgruppen. Dette tal er blevet ændret fra Trotman-Lucas et al. 11.
Discussion
Glødetrådens induktion af forbigående MCAO i gnavere er den hyppigst anvendte eksperimentelle slagtilfælde model, da det giver mulighed for reperfusion til det ramte område, efterligne forekomsten af begivenhederne efter klinisk iskæmisk slagtilfælde7. Rapporteret her er en alternativ kirurgisk tilgang til den traditionelle metode med glødetråd-induceret forbigående MCAO i mus. Den alternative tilgang, der involverer analgesi behandling, ECA ligatur undgåelse og CCA indsnit reparation, resulterer i en reduceret LV variabilitet når vurderet ved hjælp af både Mr og histologiske farvning metoder11.
Traditionelle metoder til at fremkalde MCAO i høj grad stole på transection, eller på mindst ligatur af Revisionsretten, som har været vist i rotter, at påvirke drikkevaner og en stigning i kroppen vægttab efter MCAO14. Den protokol, der er defineret her, i mus, med undgåelse af ECA ligatur og analgesi tilsætning, foreslog en reduktion i kroppen vægttab efter MCAO med ingen effekt på læsion volumen. Brugen af smertestillende midler er undgået, eller i det mindste ikke rapporteret i størstedelen af eksperimentelle slagtilfælde undersøgelser, på grund af mulige forstyrrende virkninger på det eksperimentelle resultat. Men undgå analgesi helt er ikke altid begrundet og der er behov for at skabe balance mellem dyrenes velfærd behov med de videnskabelige mål.
Forskelle i dyrenes størrelse, stamme og cerebrovaskulær anatomi, ud over glødetråden størrelse og type variationer, er alle foreslået for at påvirke slagtilfælde resultater23,24. Den alternative metode beskrevet her undgår afhængigheden af koen under reperfusion, dermed reducere, i det mindste i en del, variabiliteten set mellem dyr i læsion volumen. Ko anatomi er meget varierende i mus, navnlig i C57BL /6 stamme, som ofte bruges i eksperimentel slagtilfælde undersøgelser. 90% af C57BL/6 mus har en ufuldstændig ko på grund af et varieret posteriore kommunikere arterie (PcomA) passage, som kan have en effekt på omfanget af iskæmisk skade på grund af den utilstrækkelige perfusion af strukturer uden for MCA område13, 25. reparation CCA i mus, som vist her, resultater i genindførelsen af blod flyde via CCA til iskæmisk område, som tidligere beskrevet i rotter15. De repræsentative data viser, at reparation af CCA øger reperfusion, selvom blodgennemstrømningen i CCA ikke var direkte måles. Det er dog muligt for kirurgen at visualisere CCA reperfuse med blod efter reparation fartøj, som det vender tilbage til en pulserende og fuld tilstand hele stammen, proksimale og distale til reparation placering. Denne visuel bekræftelse, sammen med laser Doppler flowmetry aflæsninger af området iskæmisk kan bruges til at bekræfte den vellykket reparation af fartøjet. Tiden mellem væv pad anbringelse og fjernelse af fartøj klip fra CCA kan indvirke på den deraf følgende passage af CCA, som at reducere tiden mellem væv pad ansøgning og klip fjernelse vil forhindre væv pad i fastholdelsen af o pposite side af CCA. Selv om teknisk udfordrende, kræver den alternative MCAO procedure forklares her ikke nogen yderligere kvalifikationer end dem, der kræves for at udføre kirurgisk induktion af MCAO i mus.
Traditionelt forbindes med en høj variabilitet i statusmålinger, kan eksperimentelle slagtilfælde undersøgelser have en tendens til at være underdimensioneret. Etik og velfærd krav i kombination med økonomiske og praktiske bekymringer kan bidrage til undersøgelser er underdimensioneret. Ved at reducere variabiliteten i resultatet, og derfor producerer mere ensartet læsion resultater på tværs af en eksperimentel musikgruppe, kan mere effektiv power beregninger udføres med det endemål at undersøgelser at være passende drevet.
Afslutningsvis, dette alternativ CCA reparationsprocedure, i mus, resulterer i mindre variation i læsion volumen efter eksperimentel slagtilfælde og giver mindre eksperimentelle grupper at være forpligtet til at teste en behandling virkning når passende magt beregninger der bruges.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Centre for udskiftning, raffinement og reduktion af dyr i forskning (NC3Rs; NC/M000117/1 til CG). Forfatterne takke personalet i afdelingen for biomedicinsk Services, University of Leicester, for deres pleje af forsøgsdyr og Maria Viskaduraki for hendes statistisk rådgivning. De repræsentative resultater er tilpasset med tilladelse fra sygdomsmodeller & mekanismer11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
| 7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
| 9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
| Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
| Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
| C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
| Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
| Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
| Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
| Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
| dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
| Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
| dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
| Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL |
| Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
| Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
| Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
| LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
| micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
| Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
| microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
| MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
| no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
| Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
| Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
| Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
| Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
| Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
| Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
| Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
| sterile Petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required. |
| Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
| Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
| White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |
References
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 Experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for Ischaemic Stroke: Translation from the Bench to the Bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Reeves, M. J., et al. Acute Stroke Care in the US: Results from 4 Pilot Prototypes of the Paul Coverdell National Acute Stroke Registry. Stroke. 36 (6), 1232-1240 (2005).
- Wardlaw, J. M., Murray, V., Berge, E., del Zoppo, G. J. Thrombolysis for acute ischaemic stroke. Cochrane Database of Systematic Reviews. (7), CD000213 (2014).
- Pangalos, M. N., Schechter, L. E., Hurko, O. Drug development for CNS disorders: strategies for balancing risk and reducing attrition. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (7), 521-532 (2007).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathologica. 47 (3), 213-227 (2009).
- Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-289 (1992).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRX. 2 (3), 396-409 (2005).
- Dirnagl, U. Bench to Bedside: The Quest for Quality in Experimental Stroke Research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (12), 1465-1478 (2006).
- Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6, 21086 (2016).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research - advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Research. 997 (1), 15-23 (2004).
- Trueman, R. C., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Translational Stroke Research. 2 (4), 651-661 (2011).
- Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Experimental Neurology. 195 (2), 372-378 (2005).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. Plos Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-479 (2010).
- Orsini, F., et al. Targeting Mannose-Binding Lectin Confers Long-Lasting Protection With a Surprisingly Wide Therapeutic Window in Cerebral Ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Simoni, M. G. D., et al. Neuroprotection by Complement (C1) Inhibitor in Mouse Transient Brain Ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (2), 232-239 (2003).
- Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline Treatment for Experimental Intracerebral Hemorrhage in Mice. Stroke. 29 (10), 2136-2140 (1998).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of Brain Edema on Infarct Volume in a Focal Cerebral-Ischemia Model in Rats. Stroke. 24 (1), 117-121 (1993).
- Loihl, A. K., Asensio, V., Campbell, I. L., Murphy, S. Expression of nitric oxide synthase (NOS)-2 following permanent focal ischemia and the role of nitric oxide in infarct generation in male, female and NOS-2 gene-deficient mice. Brain Research. 830 (1), 155-164 (1999).
- Connolly, E. S., Winfree, C. J., Stern, D. M., Solomon, R. A., Pinsky, D. J. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse Strain Differences in Susceptibility to Cerebral Ischemia are Related to Cerebral Vascular Anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral Ischemia after Bilateral Carotid Artery Occlusion and Intraluminal Suture Occlusion in Mice: Evaluation of the Patency of the Posterior Communicating Artery. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
