Summary
Intraluminale gloeidraad occlusie van de middelste cerebrale slagader is het meest gebruikte in vivo model van experimentele beroerte in knaagdieren. Een alternatieve chirurgische benadering om gemeenschappelijke halsslagader reparatie gebeurt hier, waardoor de reperfusie van de gemeenschappelijke halsslagader en een volledige reperfusie naar het grondgebied van de middelste cerebrale slagader.
Abstract
De ischemische beroerte is een belangrijke oorzaak van volwassen langdurige invaliditeit en dood wereldwijd. De huidige behandelingen beschikbaar zijn beperkt, met alleen tissue plasminogen activator (tPA) als een goedgekeurd geneesmiddel behandeling te richten van ischemische beroerte. Huidige onderzoek op het gebied van ischemische beroerte richt zich op meer inzicht te krijgen in de pathofysiologie van beroerte, te ontwikkelen en nieuwe farmaceutische doelstellingen onderzoeken. Betrouwbare experimentele beroerte modellen zijn cruciaal voor de voortgang van mogelijke behandelingen. Het middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) model is klinisch relevante en de meest gebruikte chirurgische model van ischemische beroerte in knaagdieren. De resultaten van dit model, zoals het volume van de laesie, zijn echter geassocieerd met een hoge mate van variabiliteit, met name in muizen. De alternatieve MCAO model hier beschreven staat de reperfusie van de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) en de toegenomen perfusie van het grondgebied van de middelste cerebrale slagader (MCA), met behulp van een weefsel pad met afdichtmiddel fibrinogeen gebaseerde om te herstellen van het schip, en de verbeterde welzijn van de muizen door het vermijden van externe halsslagader (ECA) afbinding. Dit vermindert de afhankelijkheid van de cirkel van Willis, die bekend staat als zeer anatomisch variabele in muizen. Representatieve gegevens blijkt dat de variabiliteit in de laesie volumes tussen de traditionele benadering van de MCAO en de alternatieve benadering die hier beschreven met behulp van deze alternatieve chirurgische aanpak vermindert.
Introduction
Een belangrijke oorzaak van cerebrale beroerte is focal ischemie op het grondgebied van de middelste cerebrale slagader. Tissue plasminogen activator (tPA) is het alleen farmacologische behandeling beschikbaar met bewezen werkzaamheid, ondanks talrijke klinische drug tests gericht op ischemische beroerte1,2. Echter, als gevolg van bezorgdheid over de veiligheid en een smalle therapeutische venster (< 4.5 h), slechts ~ 15 procent van alle beroerte-patiënten komen in aanmerking voor tPA, en de recanalization-tarieven kunnen < 50%3,4.
Reproduceerbaar zijn en klinisch relevante dierlijke modellen van een beroerte als essentieel om de ontwikkeling van nieuwe en potentiële beroerte therapeutische behandelingen worden beschouwd. Als gevolg van bezorgdheid over de samenhang en de variabiliteit in de resultaten met diermodellen blijft het echter belangrijk voor het verfijnen van bestaande in vivo modellen ter verbetering van de vertaling van preklinische studies naar de kliniek. Het ontbreken van vertaling van de preklinische experimentele werkzaamheid van potentiële behandelingen naar klinische gebruik is een voortdurende zorg voor beroerte onderzoek5. Redenen voor het mislukken van de vertaling zijn waarschijnlijk meerdere en kunnen worden gerelateerd aan, bijvoorbeeld, de proefopzet, vertraging van de behandeling, klinische beroerte heterogeniteit, en de beperkingen van de dierlijke modellen gebruikt6. Een belangrijke uitdaging voor beroerte onderzoek blijft de ontwikkeling van veilige en effectieve behandelingen.
Middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) door intraluminale gloeidraad opneming is de meest gebruikte in vivo knaagdier model van experimentele beroerte. Dit model kunnen het herstel van de bloedtoevoer na een ischemie inductie, het nabootsen van de gebeurtenissen die zich in menselijke lijn7 voordoen. Echter, in het bijzonder in muizen, heterogene laesie volumes met gevarieerde standaarddeviaties ook optreden als gedefinieerd chirurgische protocollen zijn toegepaste8,9,10. Het is tekenend dat een bimodaal verdeling van kleine striatale en grote striato-corticale laesie volumes11. Om te induceren ischemie, wordt meestal de gloeidraad ingebracht via een snede van de CCA of ECA die vervolgens blijven permanent ligaturen12. De permanente Afbinding van de CCA voorkomt het opnieuw opzetten van de bloedstroom in de interne halsslagader (ICA) en vervolgens het MCA grondgebied. Hierdoor reperfusie zijn afhankelijk van de collaterale levering binnen de cirkel van Willis (CoW). De structuur van de koe heeft anatomische variabiliteit tussen de individuele dieren, met name in C57BL/6 muizen-a stam meestal gebruikt in in-vivo onderzoek lijn13. Een alternatieve methode, van de gloeidraad inbrengen via de ECA, laat de voortdurende perfusie via het CCA, maar deze methode compromissen de arteriële toevoer naar het grondgebied van de Europese Rekenkamer, waarvan is aangetoond, bij ratten, hebben een nadelig effect op het dier welzijn14.
De afhankelijkheid van de koe voor bijkomende leveringen en reperfusie in de gevestigde MCAO model kan gedeeltelijk verantwoordelijk voor de laesie volume variabiliteit na occlusie. We beschrijven een alternatieve lymfkliertest chirurgische procedure waar ECA Afbinding wordt vermeden en de CCA-incisie is gerepareerd, dus mooi reperfusie via de CCA, onafhankelijk van de koe. De reparatie van de incisie CCA is eerder aangetoond in ratten leiden tot een succesvolle reperfusie via de CCA-15. Wij hebben deze aanpak succesvol in muizen11 toegepast en verslag hier het protocol wat in een verminderde variabiliteit in laesie volume, de belangrijkste resultaat maatregel gebruikt in experimentele lijn studies resulteert.
In dit protocol, laten we zien hoe ertoe MCAO via CCA vaartuig gloeidraad invoeging gevolgd door CCA vaartuig reparatie, waarbij een weefsel pad- en afdichtmassa toepassing zodat reperfusie.
Protocol
Dit protocol en de ingediende gegevens zijn overeenkomstig de Akte van het UK dieren (wetenschappelijke Procedures), 1986 (Project licentie 60/4315) en na institutionele ethische goedkeuring verlopen. Alle experimenten worden gerapporteerd in overeenstemming met het dier onderzoek: rapportage van In Vivo experimenten (aankomen) richtsnoeren16.
1. voorbereiding
- Vertrouwd volwassen mannelijke C57BL/6 muizen tot post-operatieve zorg (bijvoorbeeld, milieu, dekbed(den) aanwezig, herstel voedsel) ten minste 48 uur vóór de operatie.
Opmerking: Post-MCAO dieren hebben vaak moeite met eten en drinken na chirurgie.- Om te voorkomen dat buitensporige gewichtsverlies na de operatie, acclimatiseren de dieren aan een dieet van de post-MCAO door, bijvoorbeeld, rehydratie gel, gel voedsel en gedrenkt/NAT normaal dieet pellets rechtstreeks op de vloer van de kooi plaatsen.
- De kooi beddengoed tot post-operatieve beddengoed, zoals Witboek chip wijzigen
- Alle chirurgische instrumenten steriliseren voordat u begint met de chirurgische set-up of procedures.
- Hiervoor in autoclaaf de hulpmiddelen (met een minimum van 121 ° C, 15 psi, gedurende 15 minuten) of door het gebruik van ethyleenoxide (na instructies van de juiste fabrikant, gedurende 8-10 uur).
- Desinfecteer alle oppervlakken voorafgaand aan de procedure instellen. Betrekking hebben op alle oppervlakken met steriele afdeklakens of gesteriliseerde met autoclaaf folie voor artikelen waarvoor behandeling tijdens de operatie. Aseptische techniek gebruikt voor de duur van de procedure.
Opmerking: Gesteriliseerde met autoclaaf folie kan worden gebruikt ter dekking van de instrumenten of apparatuur die moeten worden gehouden tijdens de operatie. Met behulp van steriele handschoenen en technieken, de folie kan worden toegepast en, vervolgens, het item kan worden geplaatst in het steriel veld. Daarop zal een steriele handschoen verandering nodig zijn.
2. middelste cerebrale slagader occlusie chirurgie
- Het gebruik van volwassen mannelijke C57BL/6 muizen met een gewicht van 24 – 31 g ten tijde van de operatie. Induceren anesthesie met 5% Isofluraan in 2 L/min voor O2, in een rode plastic anesthesie-kamer.
- Na de inductie, verminderen de Isofluraan om de diepte van een voldoende verdoving voor de operatie (b.v., 1,5 – 2% in 70% N2O2/30% O2), geleverd door gezichtsmasker gecombineerd met een straatveger systeem te verlagen van de chirurg blootstelling aan Isofluraan.
Opmerking: distikstofoxide (lachgas) (N2O2) kan worden gebruikt in combinatie met zuurstof (O2) ter vermindering van het vereiste bedrag van Isofluraan voor een voldoende verdoving diepte. - Beheren van systemische analgesie pre-operatively [carprofen, 10 mg/kg subcutaan (sc.)] en plaatselijke verdoving aan de incisie site peri-operatief (bupivacaine, 2 mg/kg sc., verdunde 1:10 in een zoutoplossing 0,9%).
- Pre-operatively beheren van vloeistoffen door intraperitoneaal (IP-.) injecties van 200 µL van steriele voorverwarmde 0.9% NaCl-oplossing.
- Scheren van de vacht van het recht temporele en ventrale nek regio met behulp van kleine Tondeuses bloot van de huid. Desinfecteer de chirurgische huidgebied, met behulp van een 5% chloorhexidine oplossing voor 3 min. toepassen oogbeschadigingen en/of smeermiddel op beide ogen, om te voorkomen dat het drogen tijdens de operatie.
Opmerking: Indien nodig voor pols oxymetrie lezingen te monitor bloed zuurstof saturatie, harttarief, ademhalingstarief, gebruik haar verwijdering room om te wissen van de achterpoot van haar. Toepassing van de crème met behulp van schone katoenen ontluikt en, na de verwijdering van het laserhaar, was het gebied met de verdunde chloorhexidine oplossing. Voer deze stap op een pre-operatieve gebied om te minimaliseren van het risico van losse bont besmetten de steriele chirurgische veld. Onderzoekers kunnen verkiezen te gebruiken andere chirurgische site preparaten volgens plaatselijke gewoonten. - De muis overbrengen in het chirurgische gebied en plaats deze in de vatbaar positie op een warmbloedig warmte mat vallende een steriele draperen. Handhaven verdoving via een neus kegel. Invoegen van een rectale sonde om te controleren van de muis lichaamstemperatuur en handhaven bij 37.0 ± 0,6 ° C.
- Voorafgaand aan een chirurgische incisies, Controleer de achterste poot terugtrekking reflex en knipperen van de reflex om te bevestigen de diepte van de verdoving.
- Bevestig een laser Doppler flowmetrie (LDF) sonde om vast te leggen van de bloedtoevoer naar het grondgebied van MCA.
- Met behulp van een stereoscoop dissectie, maak een incisie < 1 cm op het middelpunt tussen het rechter oog en oor op de blootgestelde temporele huid met behulp van een scalpel No. 15. Bot ontleden de onderliggende weefsel die betrekking hebben op de schedel, voorzichtig afschrapen dit uit de buurt van het bot en het drogen van het oppervlak met steriel katoenen wissers.
Opmerking: Moet oppassen niet te beschadigen de musculus temporalis. - Houden van de 0.7 mm, flexibele één sonde van de glasvezel aangesloten op de monitor van LDF, knip het uiteinde gebruiken om een scherpe scalpel te krijgen van een platte rand, duw dit via de sonde donut-vormige houder, plaats een kleine hoeveelheid optische overeenkomende gel aan het einde van de vezel.
- Plaats een kleine hoeveelheid waterdichte Super Lijm lijm rond de onderrand van de sonde houder; laten gedeeltelijk droog en plakkerig worden.
- Droog de schedel boven het temporale bot en plaats een kleine hoeveelheid van actuele weefsel lijm in een cirkel tot op het bot, net genoeg voor de houder van de sonde.
- Plaats de houder van de sonde met de sonde fiber optic al in plaats, op dit gebied (laterale van 6 mm en 2 mm distale uit de bregma).
- Voldoende tijd voor de lijm drogen; Zodra het droog en bijgevoegde, beginnen met het opnemen van de LDF-gegevens.
- Met behulp van een stereoscoop dissectie, maak een incisie < 1 cm op het middelpunt tussen het rechter oog en oor op de blootgestelde temporele huid met behulp van een scalpel No. 15. Bot ontleden de onderliggende weefsel die betrekking hebben op de schedel, voorzichtig afschrapen dit uit de buurt van het bot en het drogen van het oppervlak met steriel katoenen wissers.
- Zachtjes draai het dier naar een liggende positie, verzorgen ter ondersteuning van de laser Doppler sonde en voorkomen zijn detachement. Zachtjes tape de twee forepaws naar beneden met microporeuze medische tape, glijden van een paar van katoen knoppen (of iets dergelijks, zoals gesloten verlostang) onder de nek om te heffen van het gebied en maken van spanning. Dekking van de muis met een steriele gordijn te handhaven aseptische dekking.
- Beginnen de dissectie en de blootstelling van de CCA.
- Maak een middellijn-incisie van 1,5 cm op de blootgestelde ventrale nek met behulp van een No. 15 scalpel blad.
- Met behulp van zachte botte dissectie technieken, zachtjes trekken de speekselklieren aan de zijkanten, bloot de luchtpijp.
- Met behulp van botte dissectie, ontleden de CCA vrij van het omliggende weefsel en de vagale zenuwen.
Opmerking: Raak de vagale zenuwen direct, zoals schade aan de vagale zenuwen kan afbreuk doen aan mobiliteit, voeding en ademhaling.
- Pass twee secties van de kleine (2 cm) van een niet-oplosbaar hechtdraad van de 6-0 onder de CCA, dorsal naar het schip en de ventrale aan de vagale zenuwen. Tekenen van één zijde stropdas dichter naar de chirurg en bind het strak rond de CCA (proximale tie). Losjes binden de tweede zijde stropdas (distale ex aequo) richting de bifurcatie van de ICA/ECA.
- Om te beginnen aan het isoleren van een deel van het CCA, toepassing een microvasculaire clip net boven de distale gelijkspel maar niet belemmeren de bifurcatie. Maak een klein gaatje in de CCA met micro Vannas schaar.
Opmerking: De ECA octrooi moet blijven te allen tijde. De CCA-incisie moet niet meer dan 40% van de breedte van het schip en in een gemakkelijk toegankelijke ventrale plaats; Dit zal een belangrijke rol spelen in het vaartuig reparatie fase post-MCAO. - Een 7-0 siliconen beklede monofilamenten in de CCA, bevorderen naar de microvasculaire clip invoegen.
Opmerking: De grootte van de gloeidraad moet worden vastgesteld op basis van het gewicht van de muis voorafgaand aan de operatie; verwijzen naar de richtlijnen van de fabrikant.- Draai de distale gelijkspel, genoeg vastmaken van de gloeidraad op zijn plaats zonder deze te beschadigen. Verwijder de microvasculaire clip met behulp van de houders van de clip.
Opmerking: Geen bloedverlies moet worden gezien op dit punt. Als er een terugvoer van bloed, is de band die houdt van de gloeidraad niet strak genoeg.
- Draai de distale gelijkspel, genoeg vastmaken van de gloeidraad op zijn plaats zonder deze te beschadigen. Verwijder de microvasculaire clip met behulp van de houders van de clip.
- Vooraf de gloeidraad in de ICA.
- Zorgen de gloeidraad blijft binnen de ICA en doet niet verloop in de slagader van de pterygopalatine (PPA). Doe dit door iets tillen en trekken de CCA, met behulp van een van de zijden dassen, aan de buitenzijde van het lichaam van het dier, en sturen van de gloeidraad te buigen langs de intern geconfronteerd met opening van de PPA.
Opmerking: Advanced eenmaal naar de oorsprong van de tak MCA, zal een daling van de relatieve bloedtoevoer naar het meegeleverde grondgebied worden zichtbaar op de LDF-waarden; Dit bevestigt de plaatsing van de gloeidraad.
- Zorgen de gloeidraad blijft binnen de ICA en doet niet verloop in de slagader van de pterygopalatine (PPA). Doe dit door iets tillen en trekken de CCA, met behulp van een van de zijden dassen, aan de buitenzijde van het lichaam van het dier, en sturen van de gloeidraad te buigen langs de intern geconfronteerd met opening van de PPA.
- Beveiligen van de gloeidraad in plaats met de distale zijde stropdas, koppelverkoop dit strakker. Laat het staan voor de duur van de occlusie periode.
Opmerking: Afhankelijk op individuele protocollen, het dier kan worden verplaatst naar een herstel-kooi, volgende wond wordt, om te herstellen, of blijven onder verdoving voor de duur van de periode van de occlusie. In het laatste geval voorkomen de wond is met behulp van steriele voorverwarmde 0.9% NaCl zoutoplossing uitdroogt.
3. na occlusie
- Aan het einde van de periode MCAO, onmiddellijk worden ingetrokken de gloeidraad totdat het wit gloeidraad hoofd duidelijk zichtbaar is.
- Vervolgens binden Elegance de distale CCA net genoeg om het verwijderen van de gloeidraad hoofd allermeest naar de uitweg van het vaartuig.
Opmerking: De gloeidraad kan worden volledig verwijderd op dit punt als de chirurg zeker met snelheid te binden de distale stropdas om te voorkomen dat bloedverlies is. - Plaats één microvasculaire clip in een horizontale positie naar de CCA bifurcatie naast de distale stropdas. De distale band los en verwijder de gloeidraad volledig. Voeg een andere microvasculaire clip hieronder de proximale CCA stropdas naar de chirurg.
Opmerking: Zorg ervoor dat het schip is ver genoeg in de uitsteeksels van de klem om te voorkomen dat eventuele ontsporing. De plaatsing van de clips is essentieel om clip verhuizers gemakkelijke toegang tijdens latere stappen. De clips kunnen worden gebruikt om te helpen met het tillen van het vaartuig zodat een betere mijnen en plaatsing van de patch weefsel, de clips horizontaal kant van de omliggende spieren te plaatsen. - Zorgvuldig verwijderen van beide zijden dassen met Dumont #5 pincet of micro Vannas schaar en droog het gebied met behulp van steriele wattenstaafjes.
Opmerking: Moet oppassen niet te snijden door/in het schip. - Toevoegen in een steriele petrischaal, fibrinogeen en trombine Afdichtmiddelen oplossingen 1 en 2 (Zie de Tabel van materialen), ervoor te zorgen de twee stoffen blijven afzonderlijke, klaar voor het mengen van later.
Opmerking: Slechts zeer kleine hoeveelheden van de agenten zijn vereist (< 0,25 mL elk). De oplossingen apart houden voorkomt een voortijdige reactie tussen de twee bestanddelen. Zorgen dat het GLB de dezelfde manier wordt vervangen wanneer deze werd verwijderd om te voorkomen dat de kruisbesmetting van de twee spuiten, wat zou leiden tot de agent om te reageren en ingesteld binnen de spuit. Voorafgaand aan het gebruik, het opslaan van de oplossingen bij-20 ° C. Wanneer dit nodig is voor de eerste operatie, ontdooien het afdichtmiddel tot kamertemperatuur. Niet refreeze het afdichtmiddel; het moet blijven bij kamertemperatuur en op deze manier kan worden opgeslagen. De spuit kan worden gebruikt over veelvoudige chirurgie waardoor het kosteneffectieve; Wij raden echter aan om geen gebruik van de dezelfde flacon langer dan 1 week om verontreiniging te voorkomen. - Botte dissectie langs de spier met Dumont 5 pincet en micro Vannas schaar gebruikt te bereiken een dun plakje ventrale sternocleidomastoideus spier te gebruiken voor het pad van weefsel, zorgen voor het segment is niet meer dan 1 mm dik en loopt langs de bovenste vezels van de spier.
Opmerking: Niet dwars door/de spier, zoals dit zal aanzienlijk afbreuk doen aan haar functie. Het weefsel moet groot genoeg zijn ter dekking van de incisie CCA comfortabel. - Dumont #5 pincet gebruikt, neem het weefsel stootkussen en Vermeng het weefsel gelijkmatig over de twee fibrinogeen en trombine Afdichtmiddelen oplossingen, vorming van een kanaal tussen de twee reagentia. Stolling treedt snel; Zodra coagulatie begint, verwijdert het weefsel aanvullen tot de CCA-incisie. Plaats de pad weefsel plat neer met een gemiddelde stevige druk en open pincet.
- Snel verwijderen de distale microvasculaire clip terwijl nog voorzichtig die het weefsel stootkussen op zijn plaats.
Opmerking: Dit maakt het mogelijk sommige terugvoer van bloed verder activeren de fibrinogeen en trombine sealant reagentia. Net genoeg druk is vereist voor de pad op zijn plaats houden maar niet voor het volledig blokkeren van het vaartuig. - Langzaam verlichten de druk van het weefsel pad, waardoor het bloed stromen onder de insnijding gebied. Nu, langzaam en zachtjes laat de druk van de proximale microvasculaire clip en volledig te verwijderen.
- Opmerking: Om ervoor te zorgen dat het schip wordt volledig octrooi, de plaatsing van het stootkussen van het weefsel en de verwijdering van de microvasculaire clips moeten gebeuren snel om te voorkomen dat het weefsel stootkussen afdichting aan de binnenkant van de CCA. Echter, als er een kleine hoeveelheid bloed lekkage, opnieuw plaatst enige lichte druk op het weefsel stootkussen dat verdere tijd voor clot vorming en afdichting optreden. Of de lekkage van de bloed is aanzienlijk, maar de weefsel pad lijkt niet te worden afdichten, druk ter voorkoming van bloedverlies en vervanging van beide clips CCA microvasculaire om te isoleren van de incisie en voorkoming van verdere bloedverlies blijven.
- Snel verwijderen de distale microvasculaire clip terwijl nog voorzichtig die het weefsel stootkussen op zijn plaats.
- In het geval de weefsel pad doet niet aan het vaartuig zegel, kan een tweede poging worden gemaakt, na stappen 3.3 – 3.7.3.
- Zodra het vaartuig is verzegeld, suture de wond met behulp van hechtingen oplosbaar 6-0. Als LDF opname werd voortgezet in de hele operatie, verwijdert u de LDF van de schedel en hechtdraad wond met behulp van oplosbaar hechtdraad 6-0.
4. post-operatieve zorg
- Plaats het dier in een voorverwarmde herstel kooi (gelegen op een verwarmde plank/mat bij 35 ° C, of in een verwarmde kamer).
Opmerking: Onderzoekers kunnen verkiezen te gebruiken andere temperaturen en de duur volgens de plaatselijke gewoonten. - Voorzien van alle dieren 200 µL voorverwarmde 0.9% NaCl zoute sc. onmiddellijk na bewerking, 4 h na operatie en 2 x dagelijks gedurende 72 uur.
Opmerking: Het beheer van voorverwarmde 0.9% NaCl is dier geleid. Als meer vereist is, kunnen meer vloeistoffen worden toegediend om te zorgen voor een goed herstel. - In de kooi van herstel, door de dieren onbeperkte toegang te geven tot drassige dieet pellets, droge voeding pellets en rehydratie gel gel voedsel, naast ad libitum toegang tot water.
- Herhaal de sc. carprofen injectie op 24u na operatie (zie stap 2.3).
Opmerking: Alle dieren ontvangen dezelfde dosisniveaus van carprofen; eventuele neuroprotectieve effect is waarschijnlijk te verwaarlozen. - Uitvoeren post-op muis grimas scoren17 om te beoordelen van pijn niveaus steun van het besluit tot verdere analgesie beheren met regelmatige tussenpozen gedurende 48 uur.
- Weeg de dieren onmiddellijk voorafgaand aan chirurgie en vervolgens dagelijks de procedure te volgen. Het uitvoeren van dagelijkse waarnemingen en volledige welzijn bladen te controleren hun voeding en wateropname en klinische symptomen.
- Verbinden zich ertoe de functionele waarnemingen na 24 uur en 48 h na operatie. Beoordelen van de muizen op een schaal van focal tekort. Het evalueren van hun lichaam symmetrie, de verplichte cirkelen, de gang, de 45° raster klimmen, cirkelen gedrag, asymmetrie van de voorste ledematen en friemeltje touch antwoord18,19,20.
5. Magnetic Resonance Imaging- en beeldverwerking
- Meet het volume (LV) van de laesie met behulp van structurele magnetische resonantie beeldvorming (MRI).
Opmerking: Alternatieve methoden, zoals histologische kleuring met triphenyltetrazolium chloride (TTC), hebben eerder gebruikt en correleren aan MRI Landeninformatie. Deze methode kan echter alleen worden gebruikt aan het eindpunt van een studie en niet overlangs. Met behulp van longitudinaal MRI scan zal het verminderen van het aantal dieren dat nodig is voor een studie.- Na 48 uur, na de inductie van de MCAO, anesthetize de muis met Isofluraan (5% Isofluraan in 1 L/min. van O2 voor inductie), 1,5 – 2% Isofluraan voor onderhoud.
- Overdracht van de muis op de MRI-houder, plaatst u deze op de sensor van de ademhaling voor het toezicht op de ademhalingstarief en implantaat de rectale temperatuursonde voor het toezicht op de temperatuur tijdens het scannen. Plaats de RF 2-kanaals muis-hersenen ontvangen spoel via de hersenen een signaal en plaats de houder in een 9.4 T horizontale droeg scanner.
Opmerking: Hier, de spoel van een volume met een inwendige diameter van 72 mm werd gebruikt voor de RF-transmissie. - Verwerven T2-gewogen scans met behulp van een snelle spin-echo-reeks. Stel de tijd van de herhaling (TR) 3000 ms en de echo-tijd (TE) om 40 ms. gebruik 18 mm x 18 mm als het beeldveld (FOV), en verkrijgen van een matrix van 256 x 256 overname met plakjes van 18 x 0,8 mm en drie signaal gemiddelden in ongeveer 10 minuten.
- Verwerven van diffusie tensor afbeeldingen (DTI) met behulp van een snelle spin-echo-reeks. Stel de TR 1,730 MS, de TE 35 MS, de FOV 20 mm x 20 mm, en het verkrijgen van een matrix van 128 x 128 overname met plakjes 16 mm x 1 mm, twee signaal gemiddelden, 14 diffusie coderen routebeschrijvingen en een maximale b-waarde van 1024 s/mm2.
- Het meten van de LV op de T2-gewogen opnamen met behulp van een beeldweergave en het meten van softwarepakket. Meten van het lesioned gebied, vergelijken de waarden samen voor het berekenen van het volume van de totale laesie rekening houdend met de dikte van de MRI-segment (ingesteld tijdens de MRI-scan).
- Rekening houden met enige zwelling en het percentage van ruimte laesie volumes tijdens het meten van de volledige contralaterale en ipsilaterale hemisferen. Eerder beschreven correct is voor elke zwelling door oedeem met behulp van een indirecte methode voor het meten van het volume van de laesie als hersenen21,22. Alleen bevatten segmenten die cortex weefsel en niet frontale kwab of cerebellum weefsel volgens een standaardmuis hersenen atlas te vermijden overcorrection bevatten.
- Meten van de laesie diffusie parameters en het verkrijgen van de kern- en halfschaduw regio's van belang.
- Het genereren van de schijnbare diffusie coëfficiënt (ADC) en fractionele anisotropie (FA) kaarten van de diffusie tensor afbeeldingen met behulp van de juiste software van de analyse van de MRI.
- Hiermee lijnt u de DTI-beelden met de T2-gewogen opnamen met behulp van software van de analyse van het juiste beeld staat uit te voeren van een lineaire registratie van beelden. Na de registratie, kunt u de diffusie-gewogen laesie maskers (ischemische kern) aftrekken door de T2-gewogen laesie maskers (ischemische kern- en halfschaduw) te schatten de halfschaduw-regio. De resulterende maskers (kern- en halfschaduw) toepassen op de ADC en VA-kaarten te kwantificeren van de diffusie-parameters binnen de kern- en halfschaduw.
- Vertalen de ipsilaterale kern en de bijschaduw maskers over de middellijn van de hersenen om te bekomen van de contralaterale ADC en VA-waarden voor de vergelijking.
Representative Results
Een totaal van 24 volwassen mannelijke C57BL/6 muizen, met een gewicht van 24 – 31 g ten tijde van de operatie, werden gebruikt in de studie. Één dier stierf na middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) en één werd uitgesloten als gevolg van chirurgische complicaties. De hier gepresenteerde gegevens zijn afkomstig uit een eerder gepubliceerde werk door de auteurs. Deze werden gebruikt ter illustratie van het effect van schip reparatie op MCAO resultaten11. Alle gegevens zijn uitgedrukt in thr gemiddelde ± standaardafwijking. De gegevens zijn statistisch beoordeeld voor normaliteit met behulp van de test van de omnibus normaliteit D'Agostino-Pearson. Parametrische gegevens werden vergeleken met behulp van de Student t-test (voor twee middelen) en one-way ANOVA met de Sidak test (meerdere betekent). Niet-parametrische gegevens werden vergeleken met behulp van de Mann-Whitney U test. De variabiliteit van de parametrische gegevens werd beoordeeld met behulp van een F-test, en niet-parametrische gegevens variabiliteit werd beoordeeld met behulp van Levene test.
Meestal in de MCAO de procedures, de occluding gloeidraad wordt ingevoegd de CCA en de Europese Rekenkamer is afgebonden om te voorkomen dat deze gloeidraad passeren in de ECA in plaats van de ICA. Een ECA afbinding te vermijden en de toevoeging van analgesie toonde een tendens naar beperkte gewichtsverlies op 48 h post-MCAO, wanneer vergeleken met gegevens uit eerdere studies, genomen door de dezelfde chirurg voor MCAO tegelijkertijd ECA afbinding met geen Analgesie, overwegende dat de LV verscheen onaangetast, Zie Figuur 1.
Muizen onderging een 60 min MCAO-geïnduceerde ischemie gevolgd door reperfusie met CCA vaartuig reparatie of met de typische Afbinding van de CCA-aanpak. Een schematische voorstelling van de ligaturen en unligated gerepareerde CCA is afgebeeld in Figuur 2.
Laser Doppler flowmetrie werd gebruikt voor het bevestigen van de bloed stroom perfusie op het grondgebied van de MCA in MCAO, vóór en na de CCA vaartuig reparatie. Figuur 3 laat zien dat 5 min na de afschaffing van de gloeidraad, de regionale cerebrale doorbloeding (rCBF) aanzienlijk verhoogd in de regio van de hersenen van de MCA. De perfusie werd gehandhaafd tot de reparatie van het vaartuig, met een toename van de perfusie naar het grondgebied van de MCA komt te staan na de CCA vaartuig reparatie, wat suggereert dat de CCA reparatie toegestaan een verhoogde bloedverspreiding naar het ischemische grondgebied in vergelijking tot afhankelijkheid op de cirkel van Willis alleen.
MRI T2-gewogen werd gebruikt om te bepalen van de totale LV en DTI scans werden gebruikt om te bepalen van de kern LV, 48 h na de MCAO. Figuur 4A toont geen significant verschil in de totale of core LV tussen de reparatie en ligaturen procedure groepen. Echter, de variabiliteit van de gegevens voor beide totaal en core LV, zoals beoordeeld met behulp van de Lavene test voor niet-parametrische of de F-test voor parametrische gegevens, werd binnen de CCA reparatie groep aanzienlijk verminderd. De totale LV was onderverdeeld in corticale en subcorticale LV, zoals weergegeven in figuur 4B. De corticale gedeelte was aanzienlijk minder variabele in de CCA reparatie groep, terwijl de sub-corticale gedeelte van de laesie onaangetast tussen de twee procedurele groepen.
Een power-analyse aangegeven dat minder dieren per behandeling groep zouden moeten tonen een daling van 30% van de LV MCAO met CCA reparatie ten opzichte van de typische CCA-afgebonden procedure na, Zie tabel 1. Een machtsovername 1-β = 0,8 en significantieniveau α = 0,05 en een voorspelling van 30% reductie van de LV tussen de hypothetische controle en test groepen werden gebruikt voor de analyse van de macht. Bovendien werd een gelijke variantie tussen de fracties aangenomen. Tabel 1 toont het aantal dieren dat nodig is voor de test en de controlegroepen wanneer beide de typische CCA-afgebonden methode wordt gebruikt of de bijgewerkte CCA reparatie methode, zoals hier beschreven, wordt gebruikt. Merk op dat de testgroep naar een hypothetische testgroep van dieren en de controlegroep verwijst verwijst naar een hypothetische controlegroep; beide groepen zou MCAO ondergaan.
Figuur 1: gecombineerde analgesie behandeling en de weglating van ECA afbinding op resultaten na MCAO. (A) lichaamsgewicht, weergegeven als een percentage van het gewicht van de pre-MCAO, daalde de eerste 2 d na de MCAO voor beide groepen. De ECA-unligated groep (analgesie behandeld met geen ECA afbinding op MCAO) bleek een tendens naar beperkte gewichtsverlies op de tweede dag na de MCAO. (B) dit deelvenster bevat de laesie volume (mm3) gemeten door standaard triphenyltetrazolium chloride (TTC) kleuring van 48 h na de MCAO. De gegevens die worden weergegeven zijn de gemiddelde ± standaardafwijking. ECA afgebonden: n = 17, ECA unligated: n = 10. Dit cijfer is gewijzigd van Trotman-Lucas et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematisch weergegeven: de standaardmethode van de CCA en de alternatieve CCA reparatie methode na MCAO. (A) dit schema toont een permanent ligaturen CCA met behulp van niet-oplosbaar hechtingen toegepast aan beide zijden van de CCA incisie, resulterend in de permanente Afbinding van de juiste CCA. (B) dit schema toont de alternatieve CCA reparatie methode. Een kleine weefsel pad bekleed met fibrinogeen en trombine afdichtmiddel wordt gebruikt ter dekking van de incisie CCA, afdichten zodat de volledige perfusie van het recht CCA. Dit cijfer is gewijzigd van Trotman-Lucas et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: regionale cerebrale stroom (rCBF) bloedparameters na MCAO. De rCBF gewijzigd 5 min na de verwijdering van de gloeidraad MCAO voor zowel de CCA-afgebonden en CCA-gerepareerd groepen (post-MCAO), ten opzichte van de rCBF tijdens MCAO gemeten. Dit paneel toont de gegevens van de rCBF onmiddellijk vóór de CCA vaartuig reparatie (pre reparatie) en 5 min na de reparatie van de CCA (na reparatie). Aanzienlijke stijging van de rCBF staan 5 min na de verwijdering van de gloeidraad (post-MCAO) in beide groepen. Een extra verhoging van de rCBF wordt weergegeven na de reparatie van de CCA (na reparatie) in de CCA reparatie groep. Geen verschil in de rCBF wordt weergegeven tussen 5 min post-MCAO en pre reparatie. De gegevens die worden weergegeven zijn gecondenseerd uit de geanalyseerde tijdsverloop gegevensrapportage belangrijke tijdstippen, hier als de gemiddelde ± standaardafwijking. CCA afgebonden: n = 10, CCA gerepareerd: n = 10; P < 0,01, ***P < 0.001, ns: niet-significant. Dit cijfer is gewijzigd van Trotman-Lucas et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: analyse van het volume van de laesie verkregen door MRI technieken. (A) dit paneel bevat het volume van de laesie (LV, mm3) bij 48 h na MCAO, de totale LV ontleend aan MRI T2-gewogen beelden (totale LV) en de kern LV onttrokken DTI scans en analyse (Core LV). Representatieve beelden tonen het volume van de totale laesie uit een T2 scan segment afbeelding met het DTI kern laesie volume masker toegepast. De variabiliteit binnen de fracties werd aanzienlijk teruggebracht voor zowel het totale LV (P = 0,015, CCA reparatie: n = 10, CCA afgebonden: n = 10, F-test) en de kern LV (P = 0,043, CCA reparatie: n = 9, CCA afgebonden: n = 6, Lavene de test), geschat aan de hand van een F-test voor parametrische gegevens of Levene de test voor niet-parametrische gegevens. (B) dit paneel toont de LV op 48 h na MCAO, ontleend aan MRI T2-gewogen beelden en corticale en subcorticale laesie gebieden verdeeld. De CCA reparatie aanzienlijk verminderd de variabiliteit van de gegevens (P = 0,03, F-test) in de corticale gedeelte van de laesie, maar geen invloed op de gegevens bleek de variabiliteit in de subcorticale gedeelte van de laesie. CCA reparatie: n = 10, CCA afgebonden: n = 10. De gegevens die worden weergegeven zijn de gemiddelde ± standaardafwijking. # P < 0.05 (F-test), xP < 0.05 (Lavene de test). Dit cijfer is gewijzigd van Trotman-Lucas et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Aanpak | Volume van de laesie (LV, mm3; gemiddelde ± s.d.) |
Macht | Significantieniveau | Anticiapted verschil | De grootte van de groep vereist |
| CCA afgebonden (traditionele benadering) | 94.08 ± 53.79 | 0.8 | 0,05 | 30% | n = 58 |
| CCA gerepareerd (nieuwe benadering) | 51.73 ± 22.78 | 0.8 | 0,05 | 30% | n = 35 |
Tabel 1: analyse van het vergelijken van de traditionele CCA afbinding met het alternatief representatieve macht, CCA reparatie methode uitgelegd hier. Deze tabel toont de analyse van de macht om de groepsgrootte van de verwachte nodig voor de detectie van een significant verschil in de LV tussen een groep besturingselementen, de traditionele of alternatieve (nieuwe) aanpak en een testgroep (voorspelde) te berekenen. De tabel ziet u de grootte van de groep als vereist als een macht van 0.8 is verondersteld, een significantieniveau van 0,05 wordt toegepast, en als de voorspelde testgroep toont een verschil van 30% in de LV in vergelijking met de controlegroep. De tabel toont de resultaten voor beide benaderingen van de MCAO (de CCA-afgebonden en het CCA-gerepareerd) om te bepalen of er een verschil in het aantal dieren moet krijgen van een verschil van 30% in de LV. Voor beide methoden, is uitgegaan van een gelijke variantie tussen de test en de controlegroep. Dit cijfer is gewijzigd van Trotman-Lucas et al. 11.
Discussion
Gloeidraad inductie van voorbijgaande MCAO in knaagdieren is de meest gebruikte experimentele beroerte model, aangezien het reperfusie aan het getroffen gebied, het nabootsen van het vóórkomen van gebeurtenissen na klinische ischemische beroerte7toestaat. Gemeld hier is een alternatieve chirurgische benadering naar de traditionele methode van voorbijgaande MCAO gloeidraad-geïnduceerd in muizen. De alternatieve aanpak, analgesie behandeling, ECA afbinding vermijden en CCA incisie reparatie, resulteert in een verminderde variabiliteit van de LV wanneer beoordeeld met behulp van zowel de MRI als de histologische kleuring methoden11.
Traditionele benaderingen voor het opwekken van MCAO grotendeels vertrouwen op het transect, of ten minste afbinding, van de Rekenkamer, waarvan is aangetoond, bij ratten, beïnvloeden van gedrag drinken en een toename van de lichaam gewichtsverlies na de MCAO14. Het protocol hier, gedefinieerd in muizen, met het vermijden van ECA afbinding en analgesie toevoeging, stelde een afname van de lichaam gewichtsverlies na de MCAO met geen effect op het volume van de laesie. Het gebruik van analgesie is vermeden, of in ieder geval niet gemeld, in de meeste studies van de experimentele lijn, als gevolg van mogelijke storende effecten op de experimentele resultaten. Echter, volledig vermijden van analgesie niet altijd gerechtvaardigd is en er is een noodzakelijke evenwicht tussen enerzijds de behoeften van de welzijn van de dieren en de verwezenlijking van de wetenschappelijke doelstellingen.
Verschillen in de grootte van de dieren, stam en cerebrovasculaire anatomie, naast gloeidraad grootte en type variaties, worden alle voorgesteld om de invloed van beroerte resultaten23,24. De hier beschreven alternatieve aanpak vermijdt de afhankelijkheid van de koe tijdens reperfusie, waardoor, ten minste gedeeltelijk de variabiliteit tussen de dieren in de laesie volume gezien. Koe-anatomie is zeer variabel in muizen, met name in de C57BL /6 stam, die vaak wordt gebruikt in experimentele lijn studies. 90% van de C57BL/6 muizen hebben een onvolledige koe als gevolg van een gevarieerde posterieure communicerende slagader (PcomA) bij, die een effect op de hoeveelheid ischemische schade als gevolg van de ontoereikende perfusie van structuren buiten het MCA grondgebied13, hebben kan 25. repareren het CCA in muizen, zoals hier wordt weergegeven, resulteert in het opnieuw opzetten van bloed stromen via het CCA aan het ischemische gebied, zoals hiervoor is beschreven in ratten15. De representatieve gegevens hier is gebleken dat de reparatie van de CCA reperfusie uitbreidt, hoewel de bloedstroom in de CCA was niet direct gemeten. Het is echter mogelijk dat de chirurg te visualiseren de CCA-reperfuse met bloed na de reparatie van het vaartuig, als het terugkeert naar een pulserende en volledige staat langs de stam, proximale en distale naar de locatie van de reparatie. Deze visuele bevestiging, samen met laser Doppler flowmetrie lezingen van de ischemische ruimte, kan worden gebruikt ter bevestiging van de succesvolle reparatie van het schip. De tijd tussen de toepassing van de pad weefsel en de verwijdering van de clip van het vaartuig van de CCA kan een invloed hebben op de resulterende bij van het CCA, voor het verminderen van de tijd tussen de toepassing van de pad weefsel en de clip verwijderen voorkomt u dat de weefsel pad vast te houden aan de o pposite kant van de CCA. Hoewel technisch uitdagende, vereist de alternatieve MCAO procedure uitgelegd hier geen geen extra vaardigheden dan die welke vereist zijn voor het uitvoeren van de chirurgische inductie van MCAO in muizen.
Traditioneel geassocieerd met een hoge variabiliteit in resultaat maatregelen, kunnen experimentele lijn studies hebben de neiging om worden ondermaatse. Ethische en sociale eisen in combinatie met economische en praktische zorgen kunnen bijdragen aan studies worden ondermaatse. Door het verminderen van de variabiliteit in de uitkomst, en daarom, het produceren van meer consistente resultaten van de laesie in een experimentele groep, kunnen doeltreffender macht berekeningen worden uitgevoerd met het uiteindelijke doel van studies op de juiste wijze wordt aangedreven.
Kortom, deze alternatieve CCA-herstelprocedure, bij muizen, resulteert in minder variabiliteit in laesie volume na experimentele beroerte en maakt het mogelijk kleinere experimentele groepen nodig zijn voor het testen van een effect van de behandeling indien nodig power berekeningen worden gebruikt.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het nationaal centrum voor de vervanging, verfijning en vermindering van dieren in het onderzoek (NC3Rs; NC/M000117/1 naar CG). De auteurs danken het personeel van de afdeling van biomedische diensten, Universiteit van Leicester, voor hun verzorging van de proefdieren en Maria Viskaduraki voor haar statistische advies. De representatieve resultaten worden aangepast met toestemming van ziekte modellen & mechanismen11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
| 7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
| 9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
| Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
| Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
| C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
| Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
| Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
| Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
| Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
| dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
| Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
| dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
| Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL |
| Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
| Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
| Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
| LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
| micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
| Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
| microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
| MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
| no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
| Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
| Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
| Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
| Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
| Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
| Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
| Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
| sterile Petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required. |
| Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
| Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
| White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |
References
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 Experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for Ischaemic Stroke: Translation from the Bench to the Bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Reeves, M. J., et al. Acute Stroke Care in the US: Results from 4 Pilot Prototypes of the Paul Coverdell National Acute Stroke Registry. Stroke. 36 (6), 1232-1240 (2005).
- Wardlaw, J. M., Murray, V., Berge, E., del Zoppo, G. J. Thrombolysis for acute ischaemic stroke. Cochrane Database of Systematic Reviews. (7), CD000213 (2014).
- Pangalos, M. N., Schechter, L. E., Hurko, O. Drug development for CNS disorders: strategies for balancing risk and reducing attrition. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (7), 521-532 (2007).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathologica. 47 (3), 213-227 (2009).
- Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-289 (1992).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRX. 2 (3), 396-409 (2005).
- Dirnagl, U. Bench to Bedside: The Quest for Quality in Experimental Stroke Research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (12), 1465-1478 (2006).
- Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6, 21086 (2016).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research - advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Research. 997 (1), 15-23 (2004).
- Trueman, R. C., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Translational Stroke Research. 2 (4), 651-661 (2011).
- Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Experimental Neurology. 195 (2), 372-378 (2005).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. Plos Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-479 (2010).
- Orsini, F., et al. Targeting Mannose-Binding Lectin Confers Long-Lasting Protection With a Surprisingly Wide Therapeutic Window in Cerebral Ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Simoni, M. G. D., et al. Neuroprotection by Complement (C1) Inhibitor in Mouse Transient Brain Ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (2), 232-239 (2003).
- Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline Treatment for Experimental Intracerebral Hemorrhage in Mice. Stroke. 29 (10), 2136-2140 (1998).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of Brain Edema on Infarct Volume in a Focal Cerebral-Ischemia Model in Rats. Stroke. 24 (1), 117-121 (1993).
- Loihl, A. K., Asensio, V., Campbell, I. L., Murphy, S. Expression of nitric oxide synthase (NOS)-2 following permanent focal ischemia and the role of nitric oxide in infarct generation in male, female and NOS-2 gene-deficient mice. Brain Research. 830 (1), 155-164 (1999).
- Connolly, E. S., Winfree, C. J., Stern, D. M., Solomon, R. A., Pinsky, D. J. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse Strain Differences in Susceptibility to Cerebral Ischemia are Related to Cerebral Vascular Anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral Ischemia after Bilateral Carotid Artery Occlusion and Intraluminal Suture Occlusion in Mice: Evaluation of the Patency of the Posterior Communicating Artery. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
