Summary
Intraluminal glödtråden ocklusion av den mellersta cerebral artären är den vanligaste in-vivo -modellen för experimentell stroke hos gnagare. En alternativ kirurgisk metod att låta gemensamma halspulsådern reparation utförs här, vilket gör att reperfusion av den gemensamma halspulsådern och en full reperfusion mellersta cerebral artär territorium.
Abstract
Ischemisk stroke är en viktig orsak till vuxen långsiktiga invaliditets- och dödsfallsersättning i hela världen. De nuvarande behandlingarna som är tillgängliga är begränsade, med endast vävnad plasminogen activator (tPA) som godkända läkemedelsbehandling att rikta ischemisk stroke. Aktuell forskning inom området för ischemisk stroke fokuserar på att bättre förstå patofysiologin av stroke, att utveckla och undersöka nya farmaceutiska mål. Pålitlig experimentell stroke modeller är avgörande för utvecklingen av potentiella behandlingar. Den mellersta cerebral artär ocklusion (MCAO) modellen är kliniskt relevant och till de vanligaste kirurgiska modell av ischemisk stroke hos gnagare. Resultaten av denna modell, såsom lesion volym, är dock associerade med höga nivåer av variabilitet, särskilt hos möss. Den alternativa MCAO modellen beskrivs här tillåter reperfusion av den gemensamma halspulsådern (CCA) och ökad perfusionen i mellersta cerebral artär (MCA) territorium, med en vävnad pad med fibrinogen-baserade tätningsmedel för att reparera fartyget och den förbättrade välfärd för mössen genom att undvika yttre halspulsådern (ECA) ligatur. Detta minskar beroendet av Circle of Willis, som är kända för att vara mycket anatomiskt variabel hos möss. Representativa uppgifter visar att använda detta alternativ kirurgisk metod minskar variabiliteten i lesionen volymer mellan den traditionella MCAO-metoden och det alternativa tillvägagångssättet som beskrivs här.
Introduction
En viktig orsak till cerebral stroke är fokal ischemi i territorium av den mellersta cerebral artären. Tissue plasminogen activator (tPA) är endast farmakologisk behandling med bevisad effekt, trots många kliniska läkemedelsprövningar riktade till ischemisk stroke1,2. Men på grund av oro för säkerheten och ett smalt terapeutiskt fönster (< 4,5 h), endast ~ 15% av alla strokepatienter är berättigade till tPA och recanalization kan vara < 50%3,4.
Reproducerbar och kliniskt relevanta djurmodeller av stroke anses viktigt att informera utvecklingen av nya och potentiella stroke terapeutiska behandlingar. Dock på grund av oro för konsekvens och variabilitet i utfallen med djurmodeller, det är fortfarande viktigt att förfina befintliga in-vivo -modeller för att förbättra översättningen från prekliniska studier till kliniken. Bristen på översättning från prekliniska experimentella effekten av potentiella behandlingar till klinisk användning är en pågående oro för stroke forskning5. Felorsakerna översättning kan vara flera och kan relateras till, exempelvis rättegång design, behandling förseningar, kliniska stroke heterogenitet, och begränsningarna av djurmodeller används6. En viktig utmaning för stroke forskning fortfarande utvecklingen av säkra och effektiva behandlingar.
Mellersta cerebral artärocklusion (MCAO) av intraluminal glödtråden införande är den vanligaste i vivo gnagare modellen av experimentell stroke. Denna modell tillåter återställande av blodflödet efter en ischemi induktion, härma de händelser som inträffar i mänskliga stroke7. Men uppstå i synnerhet hos möss, heterogena lesion volymer med varierad standardavvikelser även om definieras kirurgiska protokoll är tillämpad8,9,10. Det är typiskt att se en bimodal fördelning av små striatum och stora striato-kortikala lesion volymer11. För att inducera ischemi, sätts glödtråden oftast genom ett snitt av CCA eller revisionsrätten som sedan förbli permanent sammanskrivna12. Den permanenta ligering av CCA förhindrar ren-establishment av blodflödet i den inre halspulsådern (ICA) och därefter MCA territorium. Detta orsakar reperfusion vara beroende av säkerheter leverans inom den Circle of Willis (Ko). Den ko strukturen har anatomiska variationer mellan enskilda djur, särskilt i C57BL/6 möss-en stam används vanligtvis i vivo stroke forskning13. En alternativ metod, att glödtråden införande genom revisionsrätten, tillåter fortsatt perfusionen genom CCA, men denna metod kompromisser den arteriella försörjningen till ECA territorium, som har visat, råttor, att ha en skadlig effekt på djurets välbefinnande14.
Beroendet av kon säkerheter leverans och reperfusion i etablerade MCAO modellen kan delvis står för lesionen volym variabiliteten efter ocklusion. Vi beskriver en alternativ murina kirurgisk procedur där revisionsrätten ligering undviks och CCA snittet repareras, således tillåter reperfusion genom CCA, oberoende av ko. Reparation av CCA snittet har visats tidigare i råttor att resultera i en framgångsrik reperfusion genom de CCA15. Vi har tillämpat denna metod framgångsrikt i möss11 och rapportera här protokollet vilket resulterar i en minskad variabilitet i lesionen volym, viktigaste resultatet måttenheten i experimentell stroke studier.
I detta protokoll visar vi hur du genomför MCAO genom CCA fartyget glödtråden införande följt av CCA fartyget reparation, vilket innebär en vävnad pad och tätningsmedel för att tillåta reperfusion.
Protocol
Detta protokoll och de rapporterade uppgifterna genomfördes enligt lagen om UK djur (vetenskapliga förfaranden), 1986 (projektet licens 60/4315) och efter institutionella etiskt godkännande. Alla experiment redovisas enligt den forskning som djur: rapportering av In Vivo experiment (ankomst) riktlinjer16.
1. beredning
- Bekanta vuxna manliga C57BL/6 möss till postoperativ vård (t.ex., miljö, sängkläder, återhämtning foods) minst 48 h innan operationen.
Obs: Post-MCAO djur har ofta svårigheter att äta och dricka efter operationen.- För att förhindra överdriven viktminskning efter operation, acklimatisera sig djuren till någon post-MCAO diet, till exempel att placera rehydrering gel, gel mat och indränkt Våt normal kost pellets direkt på bur golvet.
- Ändra den bur bedding till postoperativ sängkläder, såsom vitboken chip.
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg innan du börjar den kirurgiska set-up eller förfaranden.
- Göra detta genom autoklavering verktyg (med minst 121 ° c, 15 psi, för 15 min) eller med hjälp av etylenoxid (efter rätt tillverkarens instruktioner, för 8 – 10 h).
- Desinficera alla ytor före inrättandet av förfarandet. Täcka alla ytor med sterila kirurgiska draperier eller autoklaveras folie för artiklar som kräver hantering under operationen. Använd aseptisk teknik för varaktigheten av förfarandet.
Obs: Ånghärdad folie kan användas för att täcka de instrument eller utrustning som behöver hållas under operationen. Med hjälp av sterila handskar och tekniker, folien kan tillämpas och, då artikeln kan placeras in i det sterila fältet. Efter detta har kommer en steril handske förändring att krävas.
2. mitten Cerebral artär ocklusion kirurgi
- Använd vuxna manliga C57BL/6 möss väger 24 – 31 g vid tidpunkten för operationen. Inducera anestesi med 5% isofluran i 2 L/min för O2, i en röd plast anestesi kammare.
- Efter induktion, minska den isofluran att upprätthålla en adekvat anestesi djup för operationen (t.ex., 1,5 – 2% i 70% N2O2/30% O2), levereras av ansiktsmask kombinerat med en gatsopare system till lägre kirurgens exponering för isofluran.
Obs: lustgas (N2O2) kan användas i kombination med syre (O2) att minska mängden isofluran för en adekvat anestesi djup. - Administrera systemisk smärtlindring före ingreppet [karprofen, 10 mg/kg subkutant (sc.)] och lokalbedövning till snittet webbplats (bupivakain, 2 mg/kg sc., utspädd 1:10 i 0,9% saltlösning) peri-operativt.
- Administrera vätskor av intraperitoneal (ip.) injektioner av 200 µL sterilt förvärmd 0,9% NaCl lösning före ingreppet.
- Raka päls av rätt temporal och ventrala hals-region med små hårklippningsmaskiner för att exponera huden. Desinficera området kirurgisk hud, med en 5% klorhexidin lösning för 3 min. Använd okulär smörjmedel på båda ögonen, för att hindra dem från att torka under operationen.
Obs: Om så krävs för avläsningar pulsoximetri att övervaka blod syremättnad, puls och andning, Använd hårborttagningskräm för att rensa hind benet av hår. Tillämpa den kräm som med hjälp av ren bomull knoppar och, efter hårborttagning, tvätta området med utspädda klorhexidin lösning. Utför det här steget om du i en preoperativ område för att minimera risken för lös päls kontaminerande fältet sterila kirurgiska. Forskare kanske föredrar att använda andra operationsområdet preparat enligt lokal praxis. - Flytta musen till det kirurgiska området och placera den i liggande läge på en homeothermic Värme matta omfattas av en steril draperi. Underhålla anestesi via en Kona. Infoga en rektal sond för att övervaka musens kroppstemperatur och underhålla det på 37,0 ± 0,6 ° C.
- Före eventuella kirurgiska snitt, kontrollera hind tass tillbakadragande reflexen och blinka reflex för att bekräfta anestesi djupet.
- Bifoga en laser Doppler flowmetry (LDF) sond för att spela in blodflödet till MCA territorium.
- Använder en dissektion stereoskop, gör ett snitt av < 1 cm vid mittpunkten mellan höger öga och öra på exponerade temporal huden med en nr 15 skalpell. Rakt på sak dissekera den underliggande vävnaden som täcker skallen, försiktigt skrapa detta från benet och torka ytan med sterila tops.
Obs: Måste vara försiktig för att inte skada temporalis muskeln. - Ta tag i den 0,7 mm, flexibla enda fiberoptiska sonden bifogas LDF bildskärmen, klippa sitt slut med en vass skalpell för att få en platt kant, driva igenom donut-formade sondhållaren och placera en liten mängd optiska matchande gel i slutet av fiber.
- Placera en liten mängd vattentät Super klister runt den nedre kanten av sondhållaren; tillåta att delvis torka och bli klibbig.
- Torka skallbasen ovan tinningbenet och placera en liten mängd aktuell vävnad lim i en cirkel på benet, bara tillräckligt för sondhållaren.
- Lägg sondhållaren, med fiber optic sonden redan på plats, på detta område (6 mm i sidled och 2 mm distalt från bregma).
- Ge tid för limmet torka; När torr och bifogade, börja spela in LDF data.
- Använder en dissektion stereoskop, gör ett snitt av < 1 cm vid mittpunkten mellan höger öga och öra på exponerade temporal huden med en nr 15 skalpell. Rakt på sak dissekera den underliggande vävnaden som täcker skallen, försiktigt skrapa detta från benet och torka ytan med sterila tops.
- Vrid försiktigt djuret till ryggläge, ta hand att stödja laser Doppler sonden och förhindra dess lösgörande. Tejpa försiktigt de två framtassarna ner med mikroporös medicinsk tejp, glidande ett par bomull knoppar (eller något liknande, såsom stängt pincett) under halsen för att lyfta området och skapa spänning. Täcka musen med en steril draperi att upprätthålla aseptisk täckning.
- Börja dissektion och exponering av CCA.
- Gör en 1,5 cm mittlinjen snitt på exponerade ventrala halsen med hjälp av en nr 15 skalpell blad.
- Använda mild trubbig dissektion tekniker, försiktigt att dra tillbaka de saliv-körtlarna åt sidorna, utsätta luftstrupen.
- Med trubbig dissektion, dissekera CCA fri från den omgivande vävnaden och vagusnerven.
Obs: Undvik att vidröra vagusnerven direkt, eftersom varje skada på vagusnerven kan försämra rörlighet, utfodring, och andas.
- Passera två liten (2 cm) delar av en icke-dissolvable 6-0 sutur nedanför CCA, dorsala till fartyget och ventrala till vagusnerven. Rita en sidenslips närmare till kirurgen och knyta det tätt runt CCA (proximala slips). Löst knyt den andra sidenslips (distala slips) mot bifurkation av ICA/revisionsrätten.
- Att börja isolera en del av CCA, tillämpa ett mikrovaskulära klipp strax ovanför den distala slipsen men inte hindrar bifurkation. Med micro Vännäs sax, göra ett litet hål i CCA.
Obs: Revisionsrätten måste förbli patent på alla gånger. CCA snittet måste vara mer än 40% av bredden på fartyget och på en lättåtkomlig ventrala plats; Detta kommer att spela en viktig roll i den fartyget reparera scenen post-MCAO. - Infoga en 7-0 silikon-belagd monofilamentgarn i CCA, avancera mot mikrovaskulära klippet.
Obs: Glödtråden storlek måste fastställas baserat på musens vikt före operationen; hänvisning till tillverkarens riktlinjer.- Dra åt den distala slipsen, nog för att fästa glödtråden på plats utan att skada den. Ta bort mikrovaskulära klippet använder clip hållare.
Obs: Ingen blodförlust bör ses på denna punkt. Om det finns en återflödet av blod, är slips holding glödtråden inte tillräckligt tät.
- Dra åt den distala slipsen, nog för att fästa glödtråden på plats utan att skada den. Ta bort mikrovaskulära klippet använder clip hållare.
- Förväg glödtråden till ICA.
- Säkerställa att glödtråden förblir inom ICA och inte klarar i pterygopalatine artär (PPA). Gör detta genom något lyfta och dra CCA, använda en av de siden band, till den yttre sidan av djurets kropp, och styra glödtråden att böja förbi internt inför öppnandet av PPA.
Obs: Avancerad en gång till MCA gren ursprung, kommer en droppe i relativa blodflödet till medföljande territorium att synas på de LDF-värdena; Detta bekräftar Glödtrådens placering.
- Säkerställa att glödtråden förblir inom ICA och inte klarar i pterygopalatine artär (PPA). Gör detta genom något lyfta och dra CCA, använda en av de siden band, till den yttre sidan av djurets kropp, och styra glödtråden att böja förbi internt inför öppnandet av PPA.
- Säkra glödtråden i placera med den distala sidenslips, kopplingsförbehåll detta hårdare. Lämna det på plats under ocklusion tidsperiod.
Obs: Beroende på individuella protokoll, djuret kan flyttas till en återhämtning bur, följande sår suturering, återhämta sig, eller förbli under anestesi under hela perioden ocklusion. I det senare fallet, se till att såret är förhindrad uttorkning med hjälp av steril förvärmd 0,9% NaCl saltlösning.
3. efter ocklusion
- I slutet av perioden MCAO, omedelbart återkalla glödtråden tills vita glödtråden huvudet syns tydligt.
- Sedan, lossa den distala CCA knyta precis tillräckligt för att ta bort glödtråden huvud de flesta av vägen ut ur kärlet.
Obs: Glödtråden kan tas bort helt på denna punkt om kirurgen är trygg med hastighet att knyta den distala slipsen för att förhindra blodförlust. - Placera ett mikrovaskulära klipp i horisontellt läge mot CCA bifurkation bredvid distala slips. Lossa den distala slipsen och avlägsna glödtråden fullständigt. Lägga till ett annat mikrovaskulära klipp nedan proximala CCA slips mot kirurgen.
Anmärkning: Se till att fartyget är tillräckligt långt in i stiften av klämman att förhindra någon slirning. Placeringen av klippen är nödvändigt att säkerställa klipp removers enkel åtkomst under senare steg. Klippen kan användas för att lyfta fartyget för att möjliggöra en bättre clearance och placering av vävnad patch, placera klippen horisontellt över omgivande muskler. - Ta försiktigt bort båda siden band som använder Dumont #5 pincett eller micro Vännäs sax och torra området använder sterila bomullspinnar.
Obs: Måste vara försiktig inte att skära genom/i fartyget. - I en steril petriskål, lägga till fibrinogen och trombin tätningsmedel lösningar 1 och 2 (se Tabell för material), se till att de två ämnena bo separat, redo för att blanda senare.
Obs: Endast mycket små volymer av agenterna är krävs (< 0,25 mL). Lösningarna förhindrar separat en tidig reaktion mellan de två beståndsdelarna. Se till att den gemensamma jordbrukspolitiken skall ersättas på samma sätt som det togs bort för att förhindra korskontaminering av två sprutor, vilket skulle orsaka agenten att reagera och ställa in i sprutan. Före användning, lagra lösningarna vid-20 ° C. När krävs för den första operationen, Tina tätningsmedlet att rumstemperatur. Inte frysas tätningsmedlet; Det måste förbli i rumstemperatur och kan vara lagras på detta sätt. Sprutan kan användas över flera operationer vilket gör den kostnadseffektiv; Vi rekommenderar dock att inte använda samma injektionsflaskan längre än 1 vecka för att förhindra kontaminering. - Använd trubbig dissektion längs muskeln med Dumont nr 5 pincett och micro Vännäs sax för att få en tunn ventrala skiva av sternocleidomastoideus att använda för vävnad pad, säkerställa slice är inte mer än 1 mm tjocka och löper längs den övre fibrer i muskeln.
Obs: Skär inte igenom/över muskeln, eftersom detta kommer att avsevärt försämrar dess funktion. Vävnaden måste vara tillräckligt stor för att täcka CCA snittet bekvämt. - Använda Dumont #5 pincett, ta vävnad pad och blanda vävnaden jämnt över två fibrinogen och trombin tätningsmedel lösningar, bildar en kanal mellan de två reagenserna. Koagulering sker snabbt; så snart koagulering börjar, ta bort den vävnad pad CCA inferiort om snittet. Sätt kudden som vävnad platt ner med en medellång fast tryck och öppna tången.
- Ta snabbt bort distala mikrovaskulära klippet samtidigt försiktigt hålla vävnad dynan på plats.
Obs: Detta tillåter vissa återflödet av blod till ytterligare aktivera fibrinogen och trombin tätningsmedel reagenserna. Bara tillräckligt tryck krävs håller dynan på plats men inte helt blockera fartyget. - Långsamt lindra trycket från vävnad pad, så att blodet kan flöda under området snitt. Nu, långsamt och försiktigt släppa trycket från proximala mikrovaskulära klippet och helt ta bort.
- Obs: För att säkerställa att fartyget blir fullt patent, placeringen av vävnad pad och avlägsnande av mikrovaskulära klippen måste ske snabbt för att förhindra att vävnad pad tätning på insidan av CCA. Om det finns en liten mängd blod läckage, åter placera några lätta trycket på vävnad pad att ge ytterligare tid för koagelbildning och tätning förekommer. Om blod läckage är betydande eller vävnad pad verkar inte vara tätning, upprätthålla trycket för att förhindra blodförlust och ersätta båda CCA mikrovaskulära klippen för att isolera snittet och förhindra ytterligare blodförlust.
- Ta snabbt bort distala mikrovaskulära klippet samtidigt försiktigt hålla vävnad dynan på plats.
- I händelse av vävnad pad inte försegla till fartyget, göras ett andra försök, följande steg 3.3 – 3.7.3.
- När fartyget är förseglad, sutur såret med dissolvable 6-0 suturer. Om LDF inspelningen fortsatte under hela operationen, ta bort LDF från skallen och sutur sår med dissolvable 6-0 sutur.
4. postoperativ vård
- Placera djuret i en förvärmd återhämtning bur (ligger på en uppvärmd hylla/matta vid 35 ° C, eller inom en uppvärmd kammare).
Obs: Forskare kanske föredrar att använda andra temperaturer och varaktighet enligt lokal praxis. - Förse alla djur med 200 µL av förvärmd 0,9% NaCl saltlösning sc. omedelbart efter operation, vid 4 h efter operationen, och 2 x dagligen för 72 h.
Obs: Administrering av förvärmd 0,9% NaCl är djur ledde. Om mer krävs, kan mer vätskor ges för att säkerställa en bra återhämtning. - I recovery buren, ge djur obegränsad tillgång till blöt kost pellets, torr kost pellets, rehydrering gel och gel mat, tillsammans med ad libitum tillgång till vatten.
- Upprepa sc. karprofen injektionen vid 24 h efter operationen (se steg 2.3).
Obs: Alla djur fick samma dos av karprofen; någon nervskyddande effekt är sannolikt att vara försumbar. - Med jämna mellanrum för 48 h, utföra post-op mus grimas scoring17 för att bedöma smärta nivåer för att underlätta beslutet att administrera ytterligare smärtlindring.
- Väga djuren omedelbart före operationen och sedan dagligen efter förfarandet. Utföra dagliga observationer och komplett välfärd ark att övervaka deras mat och vattenintag och kliniska tecken.
- Åtar sig funktionsobservationerna på 24 h och 48 h efter operationen. Bedöma möss i focal underskott skala. Utvärdera deras kropp symmetri, obligatoriska cirklande, gånganalys, 45° grid klättring, kretsande beteende, främre extremiteterna asymmetri och morrhår touch svar18,19,20.
5. magnetisk resonanstomografi och bildbehandling
- Mät volymen lesion (LV) med strukturell magnetkamera (MRI).
Obs: Alternativa metoder, såsom histologisk färgning med triphenyltetrazolium chloride (TTC), tidigare har använts och korrelera till strukturella MRI data. Denna metod kan dock endast användas vid slutpunkten av en studie och inte longitudinellt. Med längsgående MRI-skanning kommer att minska antalen djur som krävs för en studie.- Efter 48 h, följande induktion av MCAO, söva musen med isofluran (5% isofluran i 1 L/min O2 för induktion), 1,5 – 2% isofluran för underhåll.
- Flytta musen till MRI vaggan, placera den på andning sensorn för att övervaka dess andningsfrekvens och implantat rektaltemperatur sonden för att övervaka dess temperatur under skanning. Plats 2-kanals mus-hjärnan RF får spolen över hjärnan för en signal och plats vaggan i en 9,4 T horisontella födde scanner.
Obs: Här, en volym spole med en 72 mm innerdiameter användes för RF överföring. - Förvärva T2-vägd genomsökningar använder en snabb spinn-eko sekvens. Ange upprepning tiden (TR) till 3.000 ms, och echo (TE) till 40 ms. användning 18 mm x 18 mm synfält (FOV) och få en 256 x 256 förvärv matris med skivor av 18 x 0,8 mm och tre signal medelvärden i ca 10 min.
- Förvärva diffusion tensor bilder (DTI) med hjälp av en snabb spinn-eko sekvens. Ställa in TR till 1.730 ms, TE till 35 ms, FOV till 20 mm x 20 mm, och få en 128 x 128 förvärv matris med skivor av 16 mm x 1 mm, två signal medelvärden, 14 diffusion kodning vägbeskrivningar och en maximal b-värdet 1 024 s/mm2.
- Mäta LV på T2-viktade bilder med en bildvisning och mäta programpaket. Mäta området bort sortera värdena tillsammans för att beräkna den totala lesion volymen samtidigt beaktas MRI slice tjocklek (anges under MRI scan).
- Ta hänsyn till någon svullnad och andelen området lesion volymer samtidigt mäta full kontralaterala och ipsilaterala halvkloten. Rätt för någon hjärna svullnad på grund av ödem med en indirekt metod för att mäta volymen lesion som beskrivs tidigare21,22. Endast omfatta skivor som innehåller cortex vävnad och inte frontalloben eller lillhjärnan vävnad enligt en standardmus hjärnan atlas att undvika overcorrection.
- Mäter lesion diffusion parametrarna och få regionerna core och penumbra av intresse.
- Generera den skenbara diffusion koefficient (ADC) och fraktionerad anisotropi (FA) kartor från diffusion tensor bilderna med lämplig MRI analys programvara.
- Anpassa DTI bilderna med T2-viktade bilder med lämplig bild analys programvara kan utföra en linjär registrering av bilder. Efter registrering, subtrahera diffusion-viktade lesion masker (ischemisk core) från T2-vägd lesion masker (ischemisk core och penumbra) för att uppskatta regionen penumbra. Applicera de resulterande maskerna (core och penumbra) till ADC och FA kartor att kvantifiera diffusion parametrarna inom core och halvskuggan.
- Översätt ipsilaterala kärnan och penumbra masker om hjärnan mittlinjen för att erhålla kontralaterala ADC och FA värden för jämförelse.
Representative Results
Sammanlagt 24 vuxna manliga C57BL/6 möss, väger mellan 24 – 31 g vid tidpunkten för kirurgi, användes i studien. Ett djur dött efter mitten cerebral artärocklusion (MCAO) och en uteslöts på grund av kirurgiska komplikationer. De data som presenteras här är hämtade från ett tidigare publicerade verk av författarna. Dessa användes för att illustrera effekten av fartyget reparation på MCAO resultat11. Alla data är uttryckta som thr medelvärde ± standardavvikelse. Uppgifterna bedömdes statistiskt för normalitet i D'Agostino-Pearson omnibus normalitet test. Parametriska data jämfördes med Student's t-test (för två betyder) och envägs ANOVA med Sidak test (flera betyder). Icke-parametriska data jämfördes med Mann-Whitney U test. Variabilityen av parametriska data bedömdes med hjälp av ett F-test, och icke-parametriska data variabilitet bedömdes med hjälp av Levene's test.
Vanligtvis i MCAO förfaranden, ockluderande glödtråden är isatt i CCA och revisionsrätten är sammanskrivna för att förhindra detta glödtråden från passerande i revisionsrätten i stället för ICA. En undvikande av ECA ligering och tillägg av analgesi visade en trend mot minskad vikt förlust på 48 h post-MCAO, jämfört med data från tidigare studier som genomförts av samma kirurgen för MCAO samtidigt med ECA ligering med ingen analgesi, medan LV dök upp opåverkad, se figur 1.
Möss genomgick en 60 min MCAO-inducerad ischemi följt av reperfusion med CCA fartyget reparation eller med den typiska ligering av metoden CCA. En schematisk bild av sammanskrivna och unligated reparerade CCA visas i figur 2.
Laser Doppler flowmetry användes för att bekräfta den flöde blodgenomströmning i territorium av MCA på MCAO, före och efter CCA fartyget reparation. Figur 3 visar att 5 min efter glödtråden avlägsnande, de regionalt cerebralt blodflöde (rCBF) ökat avsevärt i hjärnregionen av MCA. Perfusionen upprätthölls upp till fartyget reparation, med en ökning av perfusionen till MCA territorium visas efter CCA fartyget reparation, vilket tyder på att CCA reparation får en ökad blodgenomströmning till ischemisk territorium jämfört med tillit på den Circle of Willis-ensam.
T2-viktade MRI användes för att bestämma den totala LV och DTI skanningar användes för att fastställa kärnan LV, 48 h efter MCAO. Figur 4A visar ingen signifikant skillnad i total- eller core LV mellan reparation och sammanskrivna förfarande grupper. Dock data variabiliteten för både totalt och core LV, som utvärderas med hjälp av Lavene's test för icke-parametriska eller F-test för parametriska data, minskade avsevärt inom gruppen CCA reparation. Den totala LV var uppdelade i kortikala och subkortikala LV, som visas i figur 4B. Den kortikala delen var betydligt mindre variabel i gruppen CCA reparation medan subkortikala portion av lesionen var opåverkad mellan de två formella grupperna.
En power-analys visade att färre djur per behandlingsgrupp skulle kunna påvisa en minskning på 30% av LV efter MCAO med hjälp av CCA reparation kontra det typiska CCA-sammanskrivna förfarandet, se tabell 1. Ett antagande om power 1-β = 0,8 och signifikansnivå α = 0,05 och en förutsägelse av 30% reduktion i LV mellan hypotetisk kontroll och test användes grupper för power analys. Dessutom antogs en lika varians mellan grupperna. Tabell 1 visar antalet djur krävs för testet och kontrollgrupperna när antingen den typiska CCA-sammanskrivna metoden används eller uppdaterade CCA reparation-metoden, som beskrivs här, används. Observera att testgruppen avser en hypotetisk behandlade grupp djur och kontrollgruppen refererar till en hypotetisk kontrollgrupp; båda grupperna skulle genomgå MCAO.
Figur 1: kombinerade analgesi behandling och utelämnandet av ECA ligatur på resultat efter MCAO. (A) kroppsvikt, visas som en procentsats av pre-MCAO vikt, minskade första 2 d efter MCAO för båda grupperna. ECA-unligated gruppen (analgesi-behandlade med ingen ECA ligatur på MCAO) visade en trend mot minskad vikt förlust på den andra dagen efter MCAO. (B) denna panel visar lesion volymen (mm3) mätt med standard triphenyltetrazolium klorid (TTC) färgning 48 h efter MCAO. De data som visas är medelvärde ± standardavvikelsen. ECA sammanskrivna: n = 17, ECA unligated: n = 10. Denna siffra har ändrats från Trotman-Lucas et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk visar standardmetoden CCA och alternativa CCA reparera metod efter MCAO. (A) Detta schema skildrar en permanent ligated CCA med icke-upplösningsbara suturer tillämpas på vardera sidan av CCA snittet, vilket resulterar i den permanenta ligering av rätt CCA. (B), detta schema skildrar den alternativa CCA reparation metoden. En liten vävnad pad belagda med fibrinogen och trombin tätningsmedel används för att täcka CCA snittet, tätning den för att tillåta full perfusionen av rätten CCA. Denna siffra har ändrats från Trotman-Lucas et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: regionala cerebrala blod flöde (rCBF) parametrar efter MCAO. RCBF ändras 5 min efter MCAO glödtråden avlägsnande för både CCA-sammanskrivna och CCA-repareras grupper (post-MCAO), i förhållande till rCBF mätt under MCAO. I denna panel visas rCBF data omedelbart före CCA fartyget reparation (före reparation) och 5 min efter CCA reparation (efter reparation). Betydande ökningar av rCBF visas 5 min efter glödtråden avlägsnande (post-MCAO) i båda grupperna. En ytterligare ökning av rCBF visas efter CCA reparation (efter reparation) i gruppen CCA reparation. Ingen skillnad i rCBF visas mellan 5 min post-MCAO och före reparation. De data som visas är kondenserad från de analyserade tidsförlopp data rapportering viktiga tidpunkter, här som medelvärde ± standardavvikelsen. CCA sammanskrivna: n = 10, CCA repareras: n = 10; P < 0,01, ***P < 0,001, ns: icke-signifikant. Denna siffra har ändrats från Trotman-Lucas et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: analys av lesion volymen erhålls genom MRI tekniker. (A) i denna panel visas volymen lesion (LV, mm3) på 48 h efter MCAO, totala LV tas från T2-vägd MRI-bilder (totala LV) och core LV tas från DTI skanningar och analys (Core LV). Representativa bilder visar den totala lesion volymen från en T2 skannad skiva bild med DTI core lesion volym masken tillämpas. Variationen inom grupperna minskade avsevärt för både totala LV (P = 0,015, CCA reparation: n = 10, CCA sammanskrivna: n = 10, F-test) och kärnan LV (P = 0.043, CCA reparation: n = 9, CCA sammanskrivna: n = 6, Lavene's test), utvärderas med hjälp av ett F-test för parametriska data eller Levene's test för icke-parametriska data. (B) i denna panel visas LV på 48 h efter MCAO, tagen från T2-vägd MRI-bilder och uppdelad i kortikala och subkortikala lesion områden. CCA reparation avsevärt minskat data variabiliteten (P = 0,03, F-testa) i kortikala delen av lesionen, men ingen effekt på data variabilitet i subkortikala delen av lesionen visades. CCA reparation: n = 10, CCA sammanskrivna: n = 10. De data som visas är medelvärde ± standardavvikelsen. # P < 0,05 (F-testa), xP < 0,05 (Lavene's test). Denna siffra har ändrats från Trotman-Lucas et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Tillvägagångssätt | Lesion volym (LV; mm3; medelvärde ± s.d.) |
Makt | Signifikansnivå | Anticiapted skillnad | Gruppens storlek krävs |
| CCA sammanskrivna (traditionella metoden) | 94.08 ± 53,79 | 0,8 | 0,05 | 30% | n = 58 |
| CCA repareras (ny metod) | 51.73 ± 22.78 | 0,8 | 0,05 | 30% | n = 35 |
Tabell 1: representativa makten analys jämför traditionella CCA ligering med alternativet CCA reparera metod förklaras här. Tabellen visar den power-analys som utförs för att beräkna förväntade gruppens storlek krävs för att upptäcka en betydande skillnad i LV mellan en kontrollgrupp, metoden traditionell eller alternativa (ny) och en testgrupp (förutspått). Tabellen visar gruppen storlekar som krävs om en effekt av 0,8 antas en signifikansnivå på 0,05 tillämpas och om de förutspådda testgruppen visar en 30% skillnad i LV jämfört med kontrollgruppen. Tabellen visar resultaten för båda MCAO strategier (den CCA-sammanskrivna och den CCA-repareras) att avgöra om det finns en skillnad i antalet djur som krävs för att få en 30% skillnad i LV. För båda metoderna antas en lika varians mellan testet och kontrollgruppen. Denna siffra har ändrats från Trotman-Lucas et al. 11.
Discussion
Glödtråden induktion av övergående MCAO hos gnagare är mest använda experimentell stroke modell, eftersom det tillåter reperfusion till det drabbade området, härma inträffar efter kliniska ischemisk stroke7. Redovisas här är ett kirurgiskt alternativ till den traditionella metoden att glödtråden-inducerad övergående MCAO i möss. Det alternativa tillvägagångssättet, som inbegriper analgesi behandling, ECA ligering undvikande och CCA snitt reparation, resulterar i en minskad LV variabilitet när utvärderas med hjälp av både MRT och histologiska färgning metoder11.
Traditionella metoder att framkalla MCAO i hög grad förlita sig på transection eller på minst ligatur, från revisionsrätten, som har visats, råttor, påverka dryckesbeteende och en ökning av viktminskning efter den MCAO14. Det protokoll som definieras här, i möss, med undvikande av ECA ligering och analgesi tillägg, föreslog en minskning av viktminskning efter MCAO med ingen effekt på volymen lesion. Användning av analgesi undviks, eller åtminstone inte rapporterats, i majoriteten av experimentell stroke studier, på grund av möjliga störande effekter på den experimentella resultaten. Dock undvika analgesi helt är inte alltid motiverat och det finns ett behov att balansera behovet av välfärd för djuren med uppnåendet av de vetenskapliga mål.
Skillnader i djurens storlek, stam och cerebrovaskulär anatomi, förutom glödtråden storlek och typ variationer, är alla föreslagna för att påverka stroke resultat23,24. Det alternativa tillvägagångssättet som beskrivs här undviker beroendet kon under reperfusion, vilket minskar, åtminstone delvis, variabiliteten sett mellan djur i lesionen volym. CoW anatomi är mycket varierande i möss, i synnerhet i C57BL /6 stam, som ofta används i experimentell stroke studier. 90% av C57BL/6 möss har en ofullständig ko på grund av en varierad bakre kommunicerande artären (PcomA) patency, som kan ha en effekt på volymen av ischemisk skada på grund av otillräcklig perfusionen av strukturer utanför den MCA territorium13, 25. reparation CCA i möss, som visas här, resultat i ren-establishment av blod flöde via CCA till det ischemiska området, som tidigare beskrivits i råttor15. De representativa uppgifterna här visar att reparation av CCA ökar reperfusion, även om blodflödet i CCA inte mättes direkt. Det är dock möjligt för kirurgen att visualisera den CCA reperfuse med blod efter fartyget reparation, som returneras till ett pulserande och full tillstånd längs stammen, proximala och distala till platsen för reparation. Här visuell bekräftelse, tillsammans med laser Doppler flowmetry avläsningar av det ischemiska området, kan användas för att bekräfta lyckad reparation av fartyget. Tiden mellan programmet vävnad pad och avlägsnande av fartyget klippet från CCA kan ha en inverkan på den resulterande patency av CCA, som att minska tiden mellan programmet vävnad pad och klipp bort förhindrar vävnad pad klibba till o pposite sida av CCA. Även om tekniskt utmanande, kräver den alternativa MCAO proceduren förklaras här inte någon ytterligare kompetens än de som krävs för att utföra kirurgiska induktion av MCAO hos möss.
Traditionellt förknippas med en hög variation i resultatåtgärder, kan experimentell stroke studier ha en tendens att vara underdimensionerad. Etik- och djurskyddsfrågor krav i kombination med ekonomiska och praktiska oro kan bidra till studier varelse underpowered. Genom att minska variabiliteten i resultatet, och därför producerar mer konsekvent lesion resultat över en experimentell grupp, kan effektivare power beräkningar utföras med det yttersta målet med studierna på lämpligt sätt ström.
Sammanfattningsvis, alternativa CCA reparationsproceduren, i möss, resulterar i mindre variabilitet i lesionen volym efter experimentell stroke och möjliggör mindre experimentella grupper krävs för att testa en behandlingseffekt när lämpliga power beräkningar används.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av nationellt centrum för ersättning, förfining och minskning av djur i forskningen (NC3Rs; NC/M000117/1 till CG). Författarna tacka personalen Division av biomedicinska tjänsterna, universitetet i Leicester, för deras vård av försöksdjur och Maria Viskaduraki för hennes statistiska råd. De representativa resultat är anpassade med tillstånd från Disease Models & mekanismer11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
| 7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
| 9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
| Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
| Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
| C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
| Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
| Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
| Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
| Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
| dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
| Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
| dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
| Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL |
| Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
| Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
| Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
| LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
| micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
| Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
| microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
| MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
| no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
| Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
| Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
| Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
| Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
| Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
| Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
| Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
| sterile Petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required. |
| Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
| Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
| White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |
References
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 Experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for Ischaemic Stroke: Translation from the Bench to the Bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Reeves, M. J., et al. Acute Stroke Care in the US: Results from 4 Pilot Prototypes of the Paul Coverdell National Acute Stroke Registry. Stroke. 36 (6), 1232-1240 (2005).
- Wardlaw, J. M., Murray, V., Berge, E., del Zoppo, G. J. Thrombolysis for acute ischaemic stroke. Cochrane Database of Systematic Reviews. (7), CD000213 (2014).
- Pangalos, M. N., Schechter, L. E., Hurko, O. Drug development for CNS disorders: strategies for balancing risk and reducing attrition. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (7), 521-532 (2007).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathologica. 47 (3), 213-227 (2009).
- Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-289 (1992).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRX. 2 (3), 396-409 (2005).
- Dirnagl, U. Bench to Bedside: The Quest for Quality in Experimental Stroke Research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (12), 1465-1478 (2006).
- Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6, 21086 (2016).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research - advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Research. 997 (1), 15-23 (2004).
- Trueman, R. C., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Translational Stroke Research. 2 (4), 651-661 (2011).
- Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Experimental Neurology. 195 (2), 372-378 (2005).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. Plos Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-479 (2010).
- Orsini, F., et al. Targeting Mannose-Binding Lectin Confers Long-Lasting Protection With a Surprisingly Wide Therapeutic Window in Cerebral Ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Simoni, M. G. D., et al. Neuroprotection by Complement (C1) Inhibitor in Mouse Transient Brain Ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (2), 232-239 (2003).
- Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline Treatment for Experimental Intracerebral Hemorrhage in Mice. Stroke. 29 (10), 2136-2140 (1998).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of Brain Edema on Infarct Volume in a Focal Cerebral-Ischemia Model in Rats. Stroke. 24 (1), 117-121 (1993).
- Loihl, A. K., Asensio, V., Campbell, I. L., Murphy, S. Expression of nitric oxide synthase (NOS)-2 following permanent focal ischemia and the role of nitric oxide in infarct generation in male, female and NOS-2 gene-deficient mice. Brain Research. 830 (1), 155-164 (1999).
- Connolly, E. S., Winfree, C. J., Stern, D. M., Solomon, R. A., Pinsky, D. J. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse Strain Differences in Susceptibility to Cerebral Ischemia are Related to Cerebral Vascular Anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral Ischemia after Bilateral Carotid Artery Occlusion and Intraluminal Suture Occlusion in Mice: Evaluation of the Patency of the Posterior Communicating Artery. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
