Article de méthode

Protocole clinique de produire des dérivés du tissu adipeux stroma vasculaire Fraction pour la régénération du Cartilage potentiels

DOI :

10.3791/58363

⸱

29 septembre 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mipro Medical Clinic, 2National Leading Research Laboratory, Department of Biological Sciences, Myongji University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole pour produire une fraction vasculaire stromale dérivées du tissu adipeux et son application pour améliorer des fonctions de genou de régénérer le tissu du cartilage chez des patients humains souffrant d’arthrose.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ostéoarthrite (OA) est l’un des troubles invalidants plus fréquents. Récemment, de nombreuses tentatives ont été faites pour améliorer les fonctions des genoux en utilisant différentes formes de cellules souches mésenchymateuses (CSM). En Corée, de la moelle osseuse concentrés et de cordon, cellules souches issues de sang ont été approuvés par les Korean Food Drug Administration (KFDA) pour la régénération du cartilage. En outre, une fraction vasculaire stromale dérivées du tissu adipeux (SVF) a été accordée par la KFDA mixtes injections chez des patients humains. Autologue SVF dérivées du tissu adipeux contient la matrice extracellulaire (MEC) en plus de cellules souches mésenchymateuses. ECM excrète diverses cytokines qui, ainsi que l’acide hyaluronique (HA) et le plasma riche en plaquettes (PRP) activé par le chlorure de calcium peut aider MSCs de régénération du cartilage et améliorer les fonctions de genou. Dans cet article, nous avons présenté un protocole pour améliorer les fonctions de genou de régénérer le tissu du cartilage chez des patients humains avec OA. Le résultat du protocole a été pour la première fois en 2011, suivie de quelques autres publications. Le protocole implique liposuccion pour obtenir lipoaspirates autologue qui sont mélangés avec la collagénase. Ce mélange de lipoaspirates-collagénase est ensuite coupé et homogénéisé pour enlever le gros tissu fibreux qui peut boucher l’aiguille pendant l’injection. Par la suite, le mélange est incubé pour obtenir SVF dérivées du tissu adipeux. La résultante SVF dérivées du tissu adipeux, contenant des dérivés du tissu adipeux MSCs et restes de ECM, est injecté dans les genoux des patients, combinés avec HA et chlorure de calcium activés PRP. Trois cas de patients ayant été traités avec notre protocole résultant dans l’amélioration de la douleur au genou, gonflement et amplitude de mouvement ainsi que des preuves de MRI des tissus comme le cartilage hyalin sont inclus.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont connus pour avoir la capacité de régénérer le cartilage1,2,3,4,5,6. Ils peuvent être facilement obtenus de diverses sources : moelle osseuse, sang de cordon ombilical et le tissu adipeux parmi tant d’autres. Parmi ces sources, le tissu adipeux est la seule source où un nombre suffisant de MSCs peut être obtenu sans toute expansion de la culture pour régénérer le cartilage en milieu clinique7,8. Autologue de moelle osseuse stroma vasculaire fraction (SVF) peut être facilement obtenue aussi bien. Cependant, le nombre de cellules souches contenues dans la moelle élargie sans culture est très faible7,8. Sang du cordon ombilical peut-être contenir un nombre suffisant de MSCs. Cependant, sang de cordon n’est pas une source facilement accessible de SVF autologue.

De nombreuses méthodes de traitement le tissu adipeux pour obtenir SVF sont disponibles pour des applications cliniques. Parmi celles-ci, la méthode d’obtention MSCs du tissu adipeux à l’aide de collagénase, développé et confirmé par Zuk et al. 5 , 6, est très bien acceptée. Cette méthode d’utilisation de collagénase a été modifiée pour des applications cliniques en orthopédie. Pour être appliqué aux paramètres cliniques, le système doit être un système fermé de maintenir la stérilité tout en gardant le confort. Une modification particulière présentée dans cet article concerne l’homogénéisation de la lipoaspirates. Petites tailles lipoaspirates sont digérés relativement plus vite que les plus grands qui sont traduisent par l’inégale répartition du tissu adipeux. En outre, ces lipoaspirates de tailles plus grande et peut produire des tissus fibreux qui peuvent boucher les seringues et les aiguilles tout en effectuant des injections mixte9,10. Afin d’éviter ces problèmes, la lipoaspirates peut être homogénéisés par découpage et hacher la lipoaspirates avant l’incubation avec la collagénase. Le SVF dérivées du tissu adipeux qui en résulte peut contenir plus uniforme matrice extracellulaire (MEC) par rapport à lipoaspirates qui ne sont pas homogénéisé11. L’ECM indécrottable contenue dans le SVF peut fonctionner comme un échafaudage12.

En 2009, SVF de dérivés de tissu adipeux autologue a été autorisé par les Korean Food Drug Administration (KFDA) lors du traitement dans un établissement médical avec un traitement minimal par un médecin13. Par la suite, SVF de dérivés de tissu adipeux autologue a été utilisé comme agent potentiel pour améliorer les fonctions du genou chez les patients de l’ostéoarthrite (OA) par potentiellement régénération du cartilage tissu10,14,15 , 16 , 17 , 18 .

En 2011, Pak a montré pour la première fois que cellules de souches dérivées du tissu adipeux (ASCs) contenues dans le SVF dérivées du tissu adipeux peut améliorer les fonctions de genou potentiellement régénérateur tissulaire du cartilage-comme chez des patients humains OA lorsqu’elle est injectée avec riche en plaquettes plasma (PRP) 14. En outre, Pak et coll. ont signalé des signalétiques en 2013 sur des 91 patients. Le taux d’efficacité moyenne signalé dans cette signalétique était 67 %15. Par la suite, des études supplémentaires de Pak et coll. ont montré genou amélioré des fonctions potentiellement en raison de la régénération des tissus cartilagineux-comme chez les patients avec un ménisque larme et chondromalacie tibiales10,16,17 ,,18. Fondée sur les articles signalés, on sait que le nombre de cellules souches contenues dans 100 g de tissu adipeux, traité par le protocole présenté dans cet article peut varier de 1 000 000-40 000 000 selon caractéristiques8, des patients 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Nous présentons ici un protocole clinique du genou humain OA en utilisant SVF de dérivés de tissu adipeux autologue avec HA et PRP activés avec le chlorure de calcium. La première version de ce protocole clinique, impliquant un système fermé, manuel afin de maintenir la stérilité, a été signalée en 201114. Le protocole identique a été optimisé, maintien de la stérilité et a été signalé en 2013 et 201610,15. Ici, le protocole optimisé est présenté. L’aperçu schématique du protocole est présenté à la Figure 1.

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Figure 1 : la présentation schématique du protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’approbation et le consentement au rapport suivant des rapports de cas ont été écartés par le Comité de Myongji University Institutional Review Board (MJUIRB). De plus, ce protocole clinique était en conformité avec les directives de déclaration d’Helsinki et la réglementation de la KFDA. Pour les procédures, informed consent proviennent de patients.

1. la liposuccion

Remarque : Effectuez avec technique stérile.

  1. Les critères d’inclusion suivants : (1) la preuve MRI de stade 3 OA ; (2) soit mâle ou femelle ; (3) plus de 18 ans ; (4) le tissu adipeux (100-110 g) suffisant pour liposuccion ; (5) le refus de procéder à une intervention chirurgicale ; (6) le défaut de gestion conservatrice ; et des douleurs invalidantes en cours (7).
  2. Les critères d’exclusion suivants : (1) maladie inflammatoire ou tissu conjonctif active pensé à l’impact des conditions de douleur (c.-à-d., lupus, polyarthrite rhumatoïde, la fibromyalgie) ; (2) active désordre endocrinien qui peut influer sur les conditions de la douleur (p. ex., hypothyroïdie, diabète) ; (3) actif trouble neurologique qui peut influer sur les conditions de douleur (c.-à-d.,, une neuropathie périphérique, sclérose en plaques) ; (4) maladie pulmonaire active nécessitant l’utilisation de médicaments ; et (5) aucun antécédent d’injections de stéroïdes mixtes depuis 3 mois.
  3. Mettre le patient en salle d’opération avec une biohazard classe une hotte et placer lui (ou elle) en position couchée.
  4. Nettoyer la région abdominale du patient avec 5 % de Bétadine (povidone-iode) et drapez le patient en utilisant la technique de stérilisation, exposant l’endroit nettoyé de l’abdomen pour la liposuccion.
  5. Environ 5 cm s Inferno-latéralement de l’ombilic, anesthésier les deux sites (celui sur la gauche et l’autre sur le côté droit de l’ombilic) d’incision à-être-fait à l’aide de 2 mL de lidocaïne 2 % sans épinéphrine avec une aiguille (25 g, 1½ po) dans une seringue de 5 mL par l’injection de chaque site au niveau épidermique.
  6. Anesthésier le site d’incision à-être-fait à l’aide de 5 mL de solution tumescente (500 mL de normal saline, 40 mL de lidocaïne à 2 %, 20 mL de bupivacaïne 0,5 %, 0,5 mL d’adrénaline 1 : 1000) dans une seringue de 10 mL avec une aiguille (25 gauge, 1½ po).
  7. Faire 2 incisions de 0,5 cm environ de 5 cm au-dessous de l’ombilic latéralement en pinçant la peau pour augmenter la profondeur du niveau sous-cutané.
  8. En utilisant la lame n ° 11, piquez la peau soulevée à traverser au niveau sous-cutané mais ne pas de pénétrer à travers la paroi abdominale.
  9. À l’aide de canules de calibre 16 de 20 cm, anesthésier le niveau sous-cutané de la zone de l’abdomen entier inférieur, qui est to-be-liposuccion, avec 700 à 800 mL de la solution tumescente.
  10. Après finition infiltration du bas-ventre ensemble avec la solution tumescente, préparer un appareil de liposuccion en connectant une canule de 3,0 mm reliée à un 60 (ou un 30 mL) seringue pour liposuccion manuelle ou une canule spécialement conçu 3,0 mm raccordé à une kit de centrifugeuse, une seringue de système fermé dans le but de maintenir la stérilité, connecté à une machine sous vide vacuum-assisted liposuccion.
  11. Effectuer la liposuccion pour obtenir 100-110 g de tissu adipeux à l’exclusion de la solution tumescente. Lorsque vous effectuez la liposuccion, le tissu adipeux sera obtenu avec la solution tumescente, qui devrait être séparée et enlevée.
  12. Pour séparer la solution tumescente, tout d’abord par gravité, transférer le tissu adipeux dans le kit de centrifugeuse à une seringue de 60 mL et placer la seringue vers le bas (c'est-à-dire, que la partie de la seringue est en bas). En attendant que 5-6 min, le tissu adipeux et le liquide tumescent seront séparés. Retirer le liquide au fond de la seringue en appuyant sur la partie supérieure du piston de la seringue.
  13. Suivez les étapes ci-dessus 1,9-1.11 jusqu'à ce qu’un total de 100-110 g de tissu adipeux (lipoaspirates) par genou ont été accumulé.

2. préparation du mélange ASC/ECM avec stérile système fermé

  1. Après avoir séparé la solution tumescente de gravité et d’accumulation de 50-55 g de lipoaspirates par chaque kit de centrifugeuse de 60 mL, un système fermé stérile, placer les kits 2 centrifugeuse dans un seau contenant centrifugeuse et un essorage à 1600 x g pendant 5 min, condensant les lipoaspirates et séparation fluide du tissu adipeux. Dans ce processus, d’autres se condense, le lipoaspirates peut produire une huile grasse dans certains cas.
  2. Être prudent pas à secouer, enlever le bouchon de sécurité et de la prise en bas de la trousse de la centrifugeuse.
  3. Retirer le liquide de fond en appuyant doucement sur le dessus du piston du kit centrifugeuse.
  4. Sur la seringue séparée de 60 mL, dissoudre 10 mg de collagénase (5 mg de collagénase spécifique pour le tissu conjonctif24 ) et 5 mg de collagénase spécifique pour le tissu adipeux25avec 50 mL de sérum physiologique.
  5. Mélanger environ 25-30 mL de concentré lipoaspirate avec la collagénase dissous (5 mg de collagénase spécifique de tissu conjonctif) et 5 mg de collagénase spécifique pour le tissu adipeux à un ratio de 1:1 (v : v) en connectant la seringue de 60 mL dans une trousse de centrifugeuse à l’aide de un connecteur spécialisé.
  6. Bien mélanger le lipoaspirate condensée et la collagénase en poussant le contenu entre la seringue de 60 mL et les kits de centrifugeuse à l’aide d’une tige ou un poussoir.
  7. Transférer le mélange de la lipoaspirate et la collagénase à seringues 60 mL.
  8. Connectez chaque seringue de 60 mL contenant le mélange avec un homogénéisateur de tissu qui contient des lames.
  9. Connecter une seringue vide de 60 mL à l’autre bout de l’homogénéisateur.
  10. Poussez le mélange à la seringue de 60 mL d’autres par le biais de l’homogénéisateur pour 4 -6 fois, ce qui coupe et hacher de le lipoaspirate.
  11. Transférer la lipoaspirate homogénéisé et le mélange de collagénase retour aux kits de centrifugeuse de 60 mL par un connecteur spécialisé
  12. Placez les kits centrifugeuse dans un récipient pour être placé dans un incubateur qui a été préchauffé à 37 ° C.
  13. Incuber les kits deux centrifugeuse avec le mélange homogénéisé à 37 ° C pendant 40 min pendant la rotation à 45 tr/min.
  14. Après le 40 min d’incubation, retirez le récipient de l’incubateur de façon stérile. Ensuite, retirez les kits de la centrifugeuse et les placer dans une machine centrifuge.
  15. Centrifuger les mélanges à 800 x g pendant 5 min séparer le SVF dérivées du tissu adipeux.
  16. Après la centrifugation, retirez le surnageant (qui comprend la collagénase et digéré le tissu adipeux) de chaque trousse de centrifugeuse en retirant le capuchon de la seringue sur le dessus du piston et en plaçant une seringue de 30 mL sur le piston ouverture par serrure de seringue connexion.
  17. Abaissez lentement la partie du canon de la seringue de 30 mL pour le surnageant remplir la seringue de 30 mL.
  18. Enfoncez la seringue de 30 mL tout le chemin jusqu'à la dernière 3 à 4 mL du fond de la trousse de la centrifugeuse, laissant seulement le dernier 3-4 mL de SVF dérivées du tissu adipeux. Le surnageant est jeté.
  19. Retirez la seringue 30 mL sur le dessus du piston et remplir la seringue avec dextrose 5 % dans une solution de Ringer amorcez (D5LR).
  20. En attachant la seringue de 30 mL, remplie de D5LR sur le dessus du piston d’ouverture, remplir les trousses de centrifugeuse, contenant 3 à 4 mL de SVF dérivées du tissu adipeux, avec D5LR à 55 mL.
  21. Retirer la seringue de 30 mL, bouchon du piston et centrifuger les kits de centrifugeuse à 300 g pendant 4 min.
  22. Répétez les étapes 2.17-2.21 pour un total de 4 lavages. La collagénase utilisé est xénogénique. Par conséquent, la plupart collagénase est enlevée par 4 lavages. Toutefois, pour l’approbation de la FDA, mise au point du protocole peut être nécessaire d’enlever complètement les résidus de collagénase dans le dernier volume, bien que le montant actuel des résidus de collagénase peut être assez négligeable pour les patients qui n’ont pas toute clinique effets secondaires.
  23. Après la centrifugationth 4, afin d’obtenir le SVF final pour injection, enlever le bouchon de sécurité et le bouchon à l’ouverture du fond de la trousse de la centrifugeuse, sans agitation ou tournant le kit centrifugeuse.
  24. Fixer une seringue de 20 mL à la base de kit de centrifugeuse en utilisant un connecteur spécialement conçu.
  25. Tirez le piston de la seringue plusieurs fois en arrière pour secouer les cellules qui sont déposent sur le fond de la trousse de la centrifugeuse.
  26. Supprimer le volume total souhaité de la SVF contenant les CRA et ECM avec d’autres cellules et tissus (habituellement environ 3-4 mL de chaque kit centrifugeuse pour injections mixte du genou).

3. PRP préparation technique stérile

  1. Tout en préparant le CRA et l’ECM, attirer 30 mL de sang autologue avec 2,5 mL de solution de dextrose de citrate anticoagulante.
  2. Transférer le sang dessiné pour les kits de centrifugeuse de 60 mL.
  3. Centrifuger le sang dessiné à 730 x g pendant 5 min et retirer le surnageant dans un nouveau kit de centrifugeuse de 60 mL. Centrifuger le surnageant à 1300 x g pendant 4 min, ce qui entraîne 3-4 mL de PRP.
  4. Juste avant l’injection, ajouter 3 % (p/v) de chlorure de calcium à un ratio de 10:2 (PRP : chlorure de calcium, v : v) à la PRP pour l’activer.
  5. Ajouter 0,5 % (p/v) HA, comme un échafaudage, à la PRP activé avec le chlorure de calcium. Ces CRA avec ECM, ainsi que de la PRP, activé par le chlorure de calcium, et HA sont le mélange ASC/ECM.

4. traitement à base de mélange ASC/ECM

  1. Nettoyez le genou du patient avec betadine 5 % et il drape de façon stérile.
  2. Palper la partie antérieure du genou pour l’interligne articulaire entre les os tibiales et fémorales.
  3. Anesthésier le site d’injection superficiellement avec la lidocaïne diluée (1 mL de lidocaïne à 1 % diluée dans 4 mL de sérum physiologique) de la peau juste à l’extérieur de la capsule articulaire.
  4. Anesthésier l’intérieur de la capsule articulaire avec ropivacaïne dilué (0,75 % de ropivacaïne 1 mL dilué avec 3 mL de sérum physiologique).
  5. Mélanger 2 mL de HA pour le 6 à 8 mL de SVF contenue dans une seringue de 20 mL par le connecteur de la seringue-à-seringue.
  6. En utilisant un connecteur de seringue-à-seringue, ajouter 0,4 mL de chlorure de calcium pour le 3 à 4 mL d’autologue PRP qui a été déjà établie et d’être prêt dans une seringue de 5 mL.
  7. Combiner les 3,5 à 4,5 mL de chlorure de calcium/PRP dans une seringue de 5 mL avec 8 à 10 mL de mélange HA/SVF dans un connecteur de seringue 20 mL par seringue-à-seringue.
  8. Immédiatement, injecter lentement le mélange (environ 12-15 mL) dans l’articulation tibio-fémorale antérieure des genoux avec aiguille de calibre 18 38 mm avec ou sans le guidage échographique.
  9. Après l’injection, bandage du site d’injection avec pression en pliage gaze de 4x4 coton 4 fois et en plaçant des bandes sur la gaze pliée de 4x4.
  10. Demander au patient de rester immobile pendant 60 min pour la fixation des cellules.
  11. Demander au patient de limiter les activités pour un minimum de 1 semaine après la sortie de la clinique.
  12. Retourner à la clinique pour les trois injections supplémentaires de la PRP activés par le chlorure de calcium pendant 3 semaines.

5. après le traitement, suivi

  1. Évaluer le patient lors de la semaine du 2, 4 et 16 (18 ou 22) pour l’amélioration de la douleur en termes d’échelle analogique visuelle (VAS) et l’amélioration de la fonction en termes de paramètres de physiothérapie. Déterminer l’indice de cotation fonctionnelle (FRI), VAS et amplitude de mouvement (ROM) comme décrit précédemment26,27.
  2. Suivre le patient en post-traitement IRM 3 mois après le traitement.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trois patients (une femme de 87 ans avec stage 3 OA, un mâle âgé de 68 ans avec stage 3 OA, et une femme de 60 ans avec stage 3 OA) sans n’importe quel passé important antécédents médicaux présentés à la clinique avec une douleur persistante au genou et désiré pour potentiel traitement SVF dérivé de tissu adipeux autologue. Les trois patients avaient leur genou examiné par un chirurgien orthopédiste et étaient offerts à avoir de prothèse totale de genou (TKR) et étaient réticents à la chi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En 2001, Zuk et al. isolé des cellules souches du tissu adipeux en décomposant la matrice de collagène avec6de la collagénase. Par la suite, le groupe a montré que ces cellules souches isolées du tissu adipeux pourrait se transformer en cartilage et d’autres tissus du mésoderme en origine, prouvant que ces cellules souches étaient mésenchymateuses en origine.

De même, la procédure présentée dans cet article est un protocole modifié pour appliquer la méthode sim...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’auteur reconnaît l’appui du personnel de la clinique médicale Mipro et le design de la figure de khaled/David Lee. Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de la Bio & Medical Technology Development Program de la NRF, financée par le MSIT (numéro FRO-2017M3A9E4078014) ; et le National Research Foundation de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science et de la TIC (numéros FRO-2017R1A2B4002315 et 2016R1C1B2010308-NRF).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
< forte/forte>
5 % de bétadine (povidone iodée)  ;Firson Co., Ltd.
2 % de lidocaïne  ;Daehan Pharmaceutical Co.
Solution tumescente.Myungmoon Pharm. Co. Ltd.N01BB01La solution était composée de 500 ml de solution saline normale, de 40 ml de lidocaïne à 2 %, de 20 ml de marcaine à 0,5 % et de 0,5 ml d’épinéphrine 1:1000.
Liberase TL et TM note de recherche  ;Roche Applied Science5401020001
D5LRDahan Pharm. Co., Ltd.645101072Dextrose à 5 % dans une solution de Ringer lactate.
Solution anticoagulante de citrate de dextrose  ;Fenwal, Inc.NDC :0942-0641La solution était composée de 0,8 % d’acide citrique,
de citrate de sodium à 0,22 % et de 0,223 % de dextrose.
3 % (p/v) Chlorure de calcium  ;Choongwae Pharmaceutical Co.
0,5 % (p/v) HA (acide hyaluronique)Dongkwang pharm. Co., Ltd.
0,25 % RopivacaïneHuons Co., Ltd.670600150
<Équipement
3,0 mm/forte  ;WOOJU Medical Instruments Co.
seringue Luer-Lock BD de 60 ml(Becton Dickinson)
Kit de baril de centrifugeuse  ;CPL Co., Ltd.30-0827044
Homogénéisateur de tissus contenant des lamesCPL Co., Ltd.30-0827045
Mélangeur d’incubateur rotatifMedikan Co., LtdMS02060092
CentrifugeuseHanil Scientific Inc.CE1133
Imagerie par résonance magnétiquePhilips Medical Systems Inc.18068
Système d’imagerie par ultrasonsSamsung Medison co., LtdCT-LK-V10-ICM-09.05.2007
657400260670603480644902101645902030canule >ML30200309653

Références

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