Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Klinisk protokollen produsere fettvev-avledet pancreatic for potensielle brusk gjenfødelse

Published: September 29, 2018 doi: 10.3791/58363
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2, 2, 2, 2
1Mipro Medical Clinic, 2National Leading Research Laboratory, Department of Biological Sciences, Myongji University
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å produsere en fettvev-avledet pancreatic og dens anvendelse å forbedre kneet funksjoner ved å regenererer brusk-lignende vev i menneskelige pasienter med slitasjegikt.

Abstract

Osteoarthritis (OA) er en av de vanligste ødeleggende lidelser. Nylig har mange forsøk blitt gjort å forbedre funksjonene i knærne ved hjelp av ulike former for stamceller (MSCs). I Korea, benmarg konsentrater og ledningen er blod-avledet stilk celler godkjent av koreansk Food and Drug Administration (KFDA) for brusk gjenfødelse. I tillegg har en fettvev-avledet pancreatic (sendinger) vært tillatt av KFDA for felles injeksjoner i menneskelige pasienter. Autologous fettvev-avledet sendinger inneholder ekstracellulær matrix (EFM) i tillegg til mesenchymal stamceller. ECM skiller ut ulike cytokiner som hyaluronic syre (HA) og blodplater-rich plasma (PRP) aktivert av veisalt, kan hjelpe MSCs å regenerere brusk og forbedre kneet funksjoner. I denne artikkelen presentert vi en protokoll for å forbedre kneet funksjoner ved å regenererer brusk-lignende vev i menneskelige pasienter med OA. Resultatet av protokollen ble først rapportert i 2011 etterfulgt av noen flere publikasjoner. Protokollen innebærer fettsuging for å få autologous lipoaspirates som blandes med collagenase. Denne lipoaspirates-collagenase blandingen er så kuttet og homogenisert for å fjerne store fibrøst vev som kan tette opp nålen under injeksjon. Etterpå er blandingen ruges for å få fettvev-avledet sendinger. Den resulterende fettvev-avledet sendinger, som inneholder både fettvev-avledet MSCs og restene av ECM, injiseres i knærne av pasienter, kombinert med HA og veisalt aktivert PRP. Inkludert er tre tilfeller av pasienter som ble behandlet med våre protokollen resulterer i forbedring av knesmerter, hevelse og bevegelsesutslag sammen med Mr bevis av hyaline brusk-lignende vev.

Introduction

Stamceller (MSCs) er kjent for å ha evne til å regenerere brusk1,2,3,4,5,6. De lett kan hentes fra forskjellige kilder: benmargen, ledningen blod og fettvev blant mange andre. Blant disse kildene er fettvev den eneste kilden der et tilstrekkelig antall MSCs kan fås uten noen kultur utvidelse å regenerere brusk i klinisk innstillinger7,8. Autologous bone margtransplantasjon pancreatic (sendinger) kan lett fås også. Antall stamceller finnes i ikke-kultur utvidet margen er imidlertid svært lav7,8. Ledningen blod kan inneholde et tilstrekkelig antall MSCs. Ledningen blod er imidlertid ikke en lett tilgjengelig kilde autologous sendinger.

Mange metoder for behandling fettvev hente sendinger er tilgjengelig for klinisk bruk. Blant disse metoden å skaffe MSCs fra fettvev bruker collagenase, utviklet og bekreftet av Zuk et al. 5 , 6, er godt akseptert. Denne metoden bruker collagenase er endret for klinisk bruk i ortopedi. For å brukes til klinisk innstillinger, må systemet være et lukket system å opprettholde sterilitet samtidig praktisk. En bestemt endring som presenteres i denne artikkelen omfatter homogenisering av lipoaspirates. Liten størrelse lipoaspirates er fordøyd relativt raskere enn de større som resulterer i ujevn nedbryting av fettvev. Videre kan disse større størrelse lipoaspirates gi fibrøst vev som kan tette opp sprøyter og sprøytespisser stund utfører felles injeksjoner9,10. For å unngå disse problemene, kan lipoaspirates være homogenisert ved skjæring og hakking lipoaspirates før inkubering med collagenase. Den resulterende fettvev-avledet sendinger kan inneholde mer ensartet ekstracellulær matrix (EFM) sammenlignet med lipoaspirates som ikke homogenisert11. Nedbrutte ECM i sendinger kan fungere som en stillaset12.

I 2009, har autologous fettvev-avledet sendinger vært tillatt av koreansk Food and Drug Administration (KFDA) når behandlet innen et medisinsk anlegg med minimal prosessering av en lege13. Etterpå blitt autologous fettvev-avledet sendinger benyttet som potensielle agent å forbedre kneet funksjoner i artrose (OA) pasienter ved potensielt regenererer brusk-lignende vev10,14,15 , 16 , 17 , 18 .

I 2011 viste Pak for første gang som fettvev-avledet stilk celler (ASCs) i fettvev-avledet-sendinger kan forbedre kneet funksjoner potensielt regenererende brusk-lignende vev i menneskelige OA pasienter når injisert med blodplater-rich plasma (PRP) 14. I tillegg rapportert Pak et al. sikkerhetsdata i 2013 som involverer 91 pasienter. Mener effekten hastigheten rapportert i denne sikkerhetsdata var 67%15. Deretter ytterligere studier av Pak et al. viste forbedret kneet funksjoner potensielt skyldes brusk-lignende vev gjenfødelse hos pasienter med en menisk rive og chondromalacia patellae10,16,17 ,18. Basert på artikler rapportert, er det kjent at antall stamceller finnes i 100 g fettvev behandlet av protokollen presenteres i denne artikkelen kan variere fra 1 000 000-40,000,000 avhengig av pasientenes egenskaper8, 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Her presenterer vi menneskelige kneet OA klinisk protokollen ved hjelp av autologous fettvev-avledet sendinger HA og PRP aktivert med veisalt. Den første versjonen av denne kliniske protokollen, som involverer en lukket, manuell for å opprettholde sterilitet, ble rapportert i 201114. Identiske protokollen ble optimalisert, opprettholde sterilitet, og ble rapportert i 2013 og 201610,15. Her presenteres optimalisert protokollen. Skjematisk oversikt over protokollen vises i figur 1.

Figure 1
Figur 1: en skjematisk oversikt over protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkjenningen og samtykke til rapporter etter case rapporter ble fravikes ved Myongji University institusjonelle Review Board committee (MJUIRB). Videre var denne kliniske protokollen fulgt Helsinkideklarasjonen og regulering retningslinjene av KFDA. For prosedyrene, ble informert samtykker innhentet fra pasienter.

1. fettsuging

Merk: Utføre med steril teknikk.

  1. Bruk følgende inklusjonskriterier: (1) MRI bevis på etappe 3 OA; (2) enten mann eller kvinne. (3) over 18 år; (4) tilstrekkelig (100-110 g) fettvev for fettsuging; (5) uvilje mot å fortsette med kirurgiske inngrep; (6) svikt i konservative styring; og (7) pågående invalidiserende smerter.
  2. Bruk følgende utelukkelse kriterier: (1) aktiv inflammatorisk eller bindevev sykdom trodde å påvirke smerte tilstand (dvs., lupus, revmatoid artritt, fibromyalgi); (2) aktiv endokrin lidelse som kan påvirke smerte tilstand (dvs., hypotyreose, diabetes); (3) aktiv nevrologisk lidelse som kan påvirke smerte tilstand (dvs., Perifer nevropati, multippel sklerose); (4) aktiv lungesykdom krever medisinering bruk; og (5) ingen historie steroid felles injeksjoner siste 3 månedene.
  3. Bringe pasienten i en operasjonsstuen med biohazard klasse A hette og plassere ham (eller henne) i supine posisjon.
  4. Rengjør mageområdet av pasienten med 5% betadine (povidon-jod) og drapere pasienten ved hjelp av steril teknikk, utsette renset området av magen for fettsuging.
  5. Ca 5 cm infero-lateralt fra navlen, bedøve to steder (en på venstre og en på høyre side av navlen) i snitt å-være-laget med 2 mL 2% lidocaine uten adrenalin med en (25 måling, 1½ tommers) strikkes 5 mL sprøyter ved å injisere hvert område på epidermal nivå.
  6. Bedøve stedet for snitt å-være-gjort bruke 5 mL tumescent løsning (500 mL av normal saline, 40 mL 2% lidokain, 20 mL 0,5% bupivacaine, 0,5 mL 1:1000 adrenalin) i en 10-mL sprøyte med en nål (25 gauge, 1½ tommer).
  7. Gjøre 2 snitt på 0,5 cm ca 5 cm nedenfor navlen lateralt ved å knipe huden til å øke dybden av subkutan nivået.
  8. Med nei 11 blad, poke hevet huden trenge gjennom til subkutan nivå men ikke trenge gjennom bukveggen.
  9. Ved 20 cm 16-gauge kanyle bedøve subkutan nivået av hele underlivet, som er å-være-liposuctioned, med 700-800 mL tumescent løsningen.
  10. Etter endt infiltrasjon av hele nedre magen med tumescent solution forberede en fettsuging apparater ved å koble en 3.0 mm kanyle koblet til en 60 mL (eller en 30 mL) sprøyte for manuell fettsuging eller en spesialdesignet 3.0 mm kanyle koblet til en sentrifuger kit, lukket-systemet sprøyter for å holde sterilitet, koblet til en vakuum maskin for vakuum-assistert fettsuging.
  11. Utfør fettsuging for å få 100-110 g av fettvev unntatt tumescent løsning. Når du utfører fettsuging, oppnås fettvev med tumescent løsningen, hvilke burde være atskilt og fjernet.
  12. Separate tumescent løsningen, først av tyngdekraften, overføre fettvev i sentrifuge kit til en 60 mL sprøyte og Legg sprøyten ned (dvs. delen av sprøyten er nederst). Ved å vente 5-6 minutter, vil fettvev og tumescent væsken være atskilt. Fjern væsken nederst på sprøyten ved å trykke på den øverste delen av sprøytestempelet.
  13. Utføre trinnene ovenfor 1,9-1,11 til totalt 100-110 g av fettvev (lipoaspirates) per kneet er akkumulert.

2. forberedelse av ASC/ECM blanding med sterilt lukket System

  1. Etter å skille tumescent løsningen av gravitasjon og samler 50-55 g lipoaspirates per hver 60 mL sentrifuge kit, et sterilt lukket system, sett 2 sentrifuge settene i en sentrifuge beholder bøtte og spinn på 1600 x g i 5 min, kondenserende de lipoaspirates og skille væske fra fettvev. I denne prosessen med ytterligere kondenserer, lipoaspirates kan produsere fatty oljer i visse tilfeller.
  2. Å være forsiktig med å riste, fjerne sikkerhet hetten og pluggen på bunnen av sentrifuger kit.
  3. Fjerne bunnen væsken ved langsomt å trykke ned på stempelet til sentrifuge kit.
  4. På separate 60 mL sprøyte, løses 10 mg collagenase (5 mg collagenase spesifikke for bindevev24 ) og 5 mg collagenase gjelder fettvev25med 50 mL av normal saline.
  5. Bland kondensert lipoaspirate ca 25-30 mL med oppløst collagenase (5 mg collagenase spesifikke for bindevev) og 5 mg collagenase gjelder fettvev i forholdet 1:1 (v: v) ved å koble den 60 mL sprøyten til en sentrifuge kit ved hjelp av en spesialisert kobling.
  6. Grundig blande kondensert lipoaspirate og collagenase ved å skyve innholdet mellom 60 mL sprøyte og sentrifuger settene med en stang eller en pusher.
  7. Overføre blanding av lipoaspirate og collagenase tilbake til 60 mL sprøyter.
  8. Koble hver 60 mL sprøyte som inneholder blandingen med en vev homogenizer som inneholder blad.
  9. Koble en tom 60 mL sprøyte til den andre enden av homogenizer.
  10. Presse blandingen til den andre 60 mL sprøyten gjennom homogenizer for 4 -6 ganger, skjæring og hakking av lipoaspirate.
  11. Overføre homogenisert lipoaspirate og collagenase blandingen tilbake til 60 mL sentrifuge kits gjennom en spesialisert kontakt
  12. Plass den sentrifuger kits i en beholder plasseres i en inkubator som har vært pre-oppvarmet på 37 ° C.
  13. Inkuber to sentrifuge settene med homogenisert blandingen ved 37 ° C i 40 min mens rotere på 45 rpm.
  14. Etter 40 min med inkubering, fjerne beholderen settefiskanlegg i et sterilt mote. Deretter fjerne den sentrifuger kits og plassere dem i en sentrifuge maskinen.
  15. Sentrifuge blandinger 800 x g i 5 min å skille fettvev-avledet-sendinger.
  16. Etter centrifuge fjerne nedbryting (som inkluderer collagenase og fordøyd fettvev) fra hver sentrifuge kits ved å fjerne sprøytehetten på stempelet og plassere en 30 mL sprøyte på stempelet åpne via sprøyte lås tilkobling.
  17. Langsomt trykk ned delen fat av 30 mL for nedbryting å fylle inn 30 mL sprøyte.
  18. Trykk ned 30 mL sprøytesylinderen helt ned til de siste 3-4 mL av bunnen av sentrifuger settet, slik at bare det siste 3-4 mL fettvev-avledet sendinger. Nedbryting forkastes.
  19. Fjerne 30 mL sprøyte fra toppen av stempelet og fyll sprøyten med 5% druesukker i lactated Ringer i løsning (D5LR).
  20. Ved å knytte 30 mL sprøyte fylt med D5LR på stempelet åpne, fylle det sentrifuge kits, som inneholder 3-4 mL fettvev-avledet sendinger, med D5LR opptil 55 mL.
  21. Fjerne 30 mL sprøyte, cap stempelet og sentrifuge sentrifuge Prosjektpakkene igjen på 300 x g for 4 min.
  22. Gjenta 2,17-2.21 totalt 4 vasker. De brukte collagenase er xenogenic. Derfor er de fleste collagenase fjernet av 4 vasker. Men for FDA-godkjenning, kan finjustering av protokollen være nødvendig å fjerne collagenase rester i det siste bindet, selv om mengden collagenase rester være ubetydelig nok for pasienter som ikke har noen klinisk bivirkninger.
  23. Etter de 4th sentrifugering, for å få den endelige sendinger for injeksjon, fjerne sikkerhet hetten og pluggen på bunnen åpningen i sentrifuge kit, uten riste eller snu sentrifuge kit.
  24. Knytte en 20 mL sprøyte sentrifuge kit nederst åpne ved å bruke en spesialdesignet kobling.
  25. Dra stempelet til sprøyten frem og tilbake flere ganger for å riste opp cellene som har avgjort på bunnen av sentrifuger kit.
  26. Fjerne ønsket totalvolumet sendinger som inneholder både ASCs og ECM sammen med andre celler og vev (vanligvis ca 3-4 mL hver sentrifuge Kit for kneet felles injeksjoner).

3. PRP forberedelse med steril teknikk

  1. Mens forberede ASCs og ECM, tegne 30 mL autologous blod med 2,5 mL antikoagulerende citrate druesukker.
  2. Overføre trukket blodet til 60 mL sentrifuge kits.
  3. Sentrifuge trukket blodet 730 x g i 5 min og fjerne nedbryting i en ny 60 mL sentrifuge kit. Sentrifuge nedbryting 1300 x g for 4 min, noe som resulterer i 3-4 mL PRP.
  4. Rett før injeksjon, legge 3% (w/v) veisalt i forholdet 10:2 (PRP: veisalt, v: v) å PRP å aktivere den.
  5. Legg til 0,5% (w/v) HA, som et stillas, PRP aktivert med veisalt. Disse ASCs med ECM, sammen med PRP, aktivert av veisalt og HA står for ASC/ECM blandingen.

4. ASC/ECM blanding-basert behandling

  1. Rengjør kneet til pasienten med 5% betadine og drapere det i et sterilt måte.
  2. Palpate det fremre av kneet for felles avstanden mellom tibial og femur bein.
  3. Bedøve injeksjonsstedet overfladisk med fortynnet lidocaine (1 mL 1% lidocaine fortynnet med 4 mL av normal saline) fra huden for å like utenfor skjøten capsule.
  4. Bedøve innsiden av skjøten capsule med fortynnet ropivacaine (1 mL 0,75% ropivacaine fortynnet med 3 mL normal saline).
  5. Bland 2 mL av HA til 6-8 mL sendinger i en 20 mL sprøyte via sprøyten til sprøyten connector.
  6. Ved å bruke en sprøyte til sprøyten kobling, legge til 0,4 mL veisalt 3-4 mL av autologous PRP som allerede har blitt forberedt og være klar i en 5-mL sprøyte.
  7. Kombinere 3.5-4.5 mL PRP/veisalt i en 5 mL sprøyte med 8-10 mL HA/sendinger blandingen i en 20 mL sprøyte via sprøyten til sprøyten kobling.
  8. Umiddelbart injisere blandingen (ca 12-15 mL) sakte i fremre tibio-femoral felles av knærne med 38-18-gauge p med eller uten ultralyd veiledning.
  9. Etter injeksjon, bandasje injeksjonsstedet med press ved å sammenleggbar 4 x 4 bomull gasbind 4 ganger og plassere bånd over brettet 4 x 4 gasbind.
  10. Be pasienten om å forbli fremdeles for 60 min å tillate celle vedlegg.
  11. Be pasienten om å begrense aktiviteter for minimal 1 uke etter utskrivning fra klinikken.
  12. Gå tilbake til klinikken for tre ekstra injeksjoner PRP aktivert av veisalt over 3 uker.

5. etter behandling oppfølging

  1. Vurdere pasienten i uken 2, 4 og 16 (18 eller 22) for smerte forbedring visuell analog skala (VAS) og funksjon forbedring i fysioterapi parametere. Bestemme funksjonelle vurdering indeks (fr) og VAS området motion (ROM) som beskrevet tidligere26,27.
  2. Følg pasienten ved etter behandling MRI 3 måneder etter behandlingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre pasienter (en 87 år gammel kvinne med stage 3 OA, en 68-år gammel mann med stage 3 OA og en 60 år gammel kvinne med stage 3 OA) uten noen betydelig tidligere medisinsk historie presentert til klinikken med vedvarende kneet smerte og ønsket for potensielle autologous fettvev-avledet sendinger behandling. Alle tre pasienter hadde sine kne undersøkt av en ortopedisk kirurg og ble tilbudt til har totalt kneet erstatning (TKR) var motvillige til å ha kirurgi. Før prosedyren, hadde alle tre pasienter fått flere injeksjoner av steroider og HA uten noen langvarig forbedring.

87 år gamle koreanske kvinnelige pasienten, ved undersøkelse, klaget over sterke smerter (VAS score på 8; Figur 2A) mens resten. Hun beskrev smerte å være økende ([fr: 37; Figur 2A) Når du går opp og ned trapper. På fysisk eksamen, mild felles hevelse med redusert ROM og ømhet med refleksjoner (figur 2B) ble bemerket. Men ble ingen ligament slapphet verdsatt. Mcmurrays og Apleys tester var negative. En før behandling MRI vist en redusert størrelse mediale menisk deformasjon og maserasjon. (Figur 2C, 2E, 2 Gog 2I).

Andre pasienten, en 68 år gamle koreanske mann, klaget over alvorlig venstre knesmerter (VAS score: 7; Figur 3A) mens resten. Smerten (fre: 33; Figur 3A) ble beskrevet som øker når du går opp og ned trapper. Fysisk eksamen var det milde misdannelse med mild felles hevelse. ROM (figur 3B) ble redusert. Videre ble ingen ligament slapphet verdsatt. Mcmurrays og Apleys tester var negative. En før behandling Mr viste brusk tynning sammen med en redusert størrelse og deformert mediale menisk sekundært til den forrige meniscectomy (Figur 3 c, 3E, 3 Gog 3I). Pasienten ble diagnostisert å ha stage 3 OA.

Tredje pasienten, en 60-year-old koreansk kvinne, rapporterte også sterke smerter (VAS score: 8; Figur 4A) resten. Smerten (fre: 36; Figur 4A) ble beskrevet som øker når du går. Pasienten hadde også mild kneet hevelse og redusert ROM (figur 4B). Ingen ligament slapphet ble verdsatt. Mcmurrays og Apleys tester var negative. En før behandling MRI viste redusert størrelse mediale menisk deformasjon og maserasjon, og det var brusk tynning (figur 4C, 4E, 4 Gog 4I).

Behandlingsplan. Alle tre representant pasienter ble begrenset fra tar steroider, aspirin, ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) og asiatiske urte medisiner minst 1 uke før prosedyren. Etter Mr imaging studier, ble lipoaspirates innhentet og behandlet som refererte ovenfor. Etterpå ble den autologous fettvev-avledet sendinger som inneholder ASCs, ECM, HA og kalsium-klor-aktivert autologous PRP injisert til knærne på dag 0. Det var ingen problemer liposuctions og felles injeksjoner. Deretter tilbake pasientene til klinikken i en uke, deretter 2 uker, og deretter 3 uker for ekstra injeksjoner HA og autologous PRP aktivert med veisalt.

Utfallet. Etter den andre uken av ASC/ECM blanding injeksjon forbedret 87 år gamle kvinnelige pasientens smerter og ROM (figur 2A og 2B). Ved 16 uken, pasientens smerter og ROM betydelig forbedret med mer enn 70% (figur 2A og 2B). Etter behandling MRI tatt etter 16 uken viste økt tykkelse av hyaline brusk-lignende vev på medial side av kneet (figur 2D, 2F, 2tog 2J). Som en sammenligning var mener effekten hastigheten 67% dataene bruker denne kliniske protokollen som involverer 91 pasienter og rapportert i 201315.

Figure 2
Figur 2: utfallet av smerte målinger (A) og rekke bevegelse (B), og Mr sagittal (C-F) og Koronal (G-J) sekvensiell T2 utsikt over kneet fra pasienten tilfelle 1. * angir en statistisk signifikant finne (p < 0,05). Forbehandling Mr skanner (C: sekvensiell bilde, 5/20; E: 6/20; G: 10/20; og jeg: 11/20) Vis brusk lesjoner (piler). Etter behandling Mr skanner 16 uker (D: 6/20; F: 7/20; H: 10/20; og J: 11/20) Angi brusk-lignende vev gjenfødelse (pilspiss) som er blitt reparert av ASC/ECM blanding-basert behandling. Dette tallet er endret fra forrige rapporten fra Pak et al. 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

68 år gammel mannlig pasientens smerter og ROM forbedret etter den andre uken av ASC/ECM blanding injeksjon (figur 3A og 3B). Ved den 18th uken, hans smerte og ROM ytterligere forbedret til 80% (figur 3A og 3B). Gjentatt MRI tatt etter 18th uke viste en økning i høyden av hyaline brusk-lignende vev på fremre medial side av kneet (figur 3D, 3F, 3 H og 3J).

Figure 3
Figur 3 : Utfallet av smerte målinger (A) og rekke bevegelse (B), og Mr sagittal (C-F) og Koronal (G-J) sekvensiell T2 utsikt over kneet fra pasienten saken 2. * angir en statistisk signifikant finne (p < 0,05). Forbehandling Mr skanner (C: sekvensiell bilde 6/20; E: 7/20; G: 13/20; og jeg: 14/20) Vis brusk lesjoner (piler). Etter behandling Mr skanner 16 uker (D: 6/20; F: 7/20; H: 13/20; og J: 14/20) Angi brusk-lignende vev gjenfødelse (pilspiss) som er blitt reparert av ASC/ECM blanding-basert behandling. Dette tallet er endret fra forrige rapporten fra Pak et al. 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

60 år gammel kvinne pasientens smerter og ROM forbedret ca 50% etter den andre uken av ASC/ECM blanding injeksjon, (figur 4A og 4B). Ved den 22nd uken forbedret smerte og ROM over 80% (figur 4A og 4B). Gjentatte MRI tatt etter 22nd uken viste en økning i høyden av hyaline brusk-lignende vev på medial side av kneet (Figur 4 d, 4F, 4 Hog 4J).

Figure 4
Figur 4 : Utfallet av smerte målinger (A) og rekke bevegelse (B), og Mr sagittal (C-F) og Koronal (G-J) sekvensiell T2 utsikt over kneet fra pasienten saken 3. * angir en statistisk signifikant finne (p < 0,05). Forbehandling Mr skanner (C: sekvensiell bilde, 4/20; E: 5/20; G: 10/20; og jeg: 11/20) Vis brusk lesjoner (piler). Etter behandling Mr skanner 16 uker (D: 4/20; F: 5/20; H: 10/20; og J: 11/20) Angi brusk-lignende vev gjenfødelse (pilspiss) som er blitt reparert av ASC/ECM blanding-basert behandling. Dette tallet er endret fra forrige rapporten fra Pak et al. 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I 2001, Zuk et al. isolert stamceller fra fettvev ved å bryte ned kollagen matrisen med collagenase6. Gruppen viste etterpå at disse stamceller isolert fra fettvev kunne forvandle brusk og andre vev av mesoderm opprinnelse, beviser at disse stamcellene var mesenchymal opprinnelse.

Likeledes er fremgangsmåten i denne artikkelen en endret protokoll bruke metoden ligner menneskelige pasienter. Den viktigste endringen av protokollen er inkorporering av lukket system sprøyter i å skaffe og behandling av lipoaspirates for å minimere luft kontakten samtidig enkel å utføre prosedyren. Bruker slike lukket system sprøyter, ble fettvev innhentet via fettsuging. Lipoaspirates ble deretter blandet med collagenase i lukket system sprøyter. Etterpå ble collagenase fjernet fra blandingen av fortynne collagenase konsentrasjonen i lukket system sprøyter. Sluttresultatet er en steril fettvev-avledet sendinger med brukervennlighet prosessen.

Ved hjelp av samme metode, viste Pak i 2011, for første gang, og at autologous fettvev-avledet sendinger kan brukes til å behandle OA pasienter ved potensielt regenererer brusk-lignende vev. Senere, Pak et al. viste også kan at autologous fettvev-avledet sendinger brukes til å behandle menisk rive og chondromalacia av patellae ved regenererer brusk-lignende bindevev og hyaline brusk-lignende vev, henholdsvis. I 2013, Pak et al. rapportert en sikkerhet studie som involverer 91 pasienter behandlet med autologous fettvev-avledet sendinger. Mener effekten av studien rapporterte var 67%, banet veien til muligheten for å bruke autologous fettvev-avledet sendinger generelt pasienten befolkningen med brusk skade.

En av de vanligste bivirkningene rapportert av Pak et al. i 2013 sikkerhet studie var etter behandling kneet felles hevelse, som kan forklares med 1) stilk cellen død, 2) betennelse av RBCs finnes i PRP, og/eller 3) gjenværende collagenase som har vært i det siste bindet fettvev-avledet sendinger. Siden MSCs finnes i ECM fettvev11,12, er fordøye lipoaspirates med collagenase å bryte ned matrix å leie stamceller en obligatorisk prosessen12. Imidlertid etter bryte ned matrix å løslate stamceller, bør den gjenværende rester collagenase fullt fjernes fra siste volumet for å hindre noen potensielle betennelse som kan produseres av de gjenværende collagenase28. Selv om collagenase kan forårsake betennelse, kan en ubetydelig mengde collagenase i det siste bindet fettvev-avledet sendinger ikke utløse en hevelse i ledd. Så siste volum autologous fettvev-avledet sendinger med en ubetydelig mengde collagenase har brukt trygt for de siste årene for å behandle OA av kne ved regenererer brusk-lignende vev.

To ikke-enzymatisk metoder for å skaffe fettvev-avledet sendinger har nylig blitt introdusert29,30. Disse metodene benytte enten mekanisk styrke eller ultralyd (vibrasjonsmedisin) kraft, i stedet for collagenase. I 2018, D'Ambrosi et al. rapporterte et resultat av behandling av fire osteochondral lesjoner av talus av ankelen med mikro-brukket, renset autologous fettvev som ble hentet ved hjelp av mekanisk kraft til sammenbrudd matrix29. Ingen collagenase ble brukt til å bryte ned matrix. Fire pasienter ble behandlet med mikro-brukket fettvev (dvs., mekanisk nedbrutte fettvev) for deres talus29. Alle disse fire pasienter viste klinisk forbedring seks måneder etter inngrepet. Ingen hadde noen komplikasjoner. Men på denne studien29var det ingen rapport om potensielle regenerering av brusk. En annen studie publisert i år med vibrasjonen energi viste at vibrasjonen energi i visse frekvens ikke var tilstrekkelig til å isolere stamceller30.

Som ovenfor, har forskjellige grupper forskjellige protokoller for å bruke en autologous fettvev for å behandle ulike degenerative lidelser. Protokollen kan variere fra størrelsen på kanyle brukte for fettsuging, mengden av fettvev brukes, typen og mengden av collagenase (hvis noen), injeksjoner og så videre. Siden MSCs finnes i ECM av fettvev, kan effekten av collagenase eller rensing metoden ved hjelp av mekaniske krefter, spille en viktig rolle. Spesielt, kan effekten av collagenase avhenge av faktorer som størrelsen av fettvev, mengden av fettvev, konsentrasjon collagenase, tid og temperatur med inkubering med collagenase og prosessen å fjerne leftover collagenase, som kan føre til celle skade28.

Det bør bemerkes at collagenase, som det er en viktig komponent i denne prosedyren for å produsere stilk cellen som inneholder fettvev-avledet sendinger, kan ha en negativ effekt på det siste bindet fettvev-avledet sendinger. I denne fremgangsmåten er collagenase blandet med kondensert lipoaspirates, homogenisert, ruges og deretter vasket. I denne prosessen utsatt stamceller for collagenase, som kan ha en skadelig effekt på overlevelse av stamceller28. For mye konsentrasjon eller langvarig eksponering av collagenase kan lavere stamcelleforskningen levedyktigheten i det siste bindet28. Videre, for mye av collagenase igjen i det siste bindet kan forårsake betennelse av siden collagenase kan bryte ned brusk matrise av felles injisert28.

I tillegg til de potensielle negative effektene av collagenase, kan fettsuging bære andre mulige komplikasjoner. For å få fettvev-avledet sendinger, må fettsuging utføres først. Utføre liposuctions, som andre medisinske prosedyrer, bærer noen potensielle komplikasjoner som ujevnheter i huden kontur, seromas, infeksjon, perforering av bukveggen, nekrotiserende fasciitis fett Slaglengde og lunge embolism. Blant disse komplikasjoner er hud kontur uregelmessigheter en svært vanlig bivirkning som kan lett forebygges ved hjelp av små cannulas og unngå overfladisk liposuctions31,32. Seromas, som er en samling av serous fluid i suges området, kan også være et resultat av aggressiv fettsuging33. Andre mulige komplikasjoner som infeksjoner, necrotizing fasciitis, perforering abdominal vegger, fett embolism eller lunge embolism er mulige. Disse komplikasjonene kan imidlertid også forebygges ved hjelp av strenge sterilt teknikker og forbedre tålmodig samsvar34.

Videre, alle tre pasienter i studien først presentert med en mild felles effusjon, et klart tegn på synovitis. Etter behandling med fettvev-avledet sendinger, alle disse pasientene felles hevelse forbedret. Derfor er det også rimelig å anta at forbedring av kliniske symptomer er ikke på grunn av mulig brusk fornyelse, men i stedet, på grunn av modulatory og anti-inflammatoriske effekten av stamceller og/eller PRP på synovial membran35 , 36. eventuelt symptom forbedring kan bidro til både modulatory og anti-inflammatoriske effekten av stamceller og/eller PRP på synovial membran med mulig fornyelse av brusk-lignende vev. Selv om mer forskning er nødvendig å avgrense sant mekanisme symptom forbedring, homogenisert denne PCI intra articular injeksjon av cellen terapi i form av autologous, fettvev-avledet sendinger med autologous PRP aktivert med veisalt og/eller HA kan tilby et alternativ behandling til gjeldende strategi for behandling av kneet OA.

Som for tillegg av autologous PRP er bekymret, det er allment akseptert at PRP inneholder ulike vekstfaktorer og differensierende faktorer for injisert MSCs å vokse og skille37,38,39. PRP har også vist for å ha en collagenase nøytralisere effekten40. Om tillegg av hyaluronsyre har (HA), HA vist å ha en mulig rolle som stillas materiale, på grunn av dens høy affinitet til brusk vev, og en mulig rolle å hjelpe stamceller i gjennomtrengende brusk matrise41.

Som flere nye prosesser for å oppnå fettvev-avledet sendinger er tilgjengelige, er en optimalisering av en metode for behandling av lipoaspirates nødvendig å standardisere prosessen. Imidlertid kan dette være en vanskelig oppgave på grunn av mulige variasjoner i prosessen med å innhente og behandle autologous fettvev-avledet sendinger. Forskjellene i teksturen av subkutan fettvev i hver enkelt pasient, på grunn av aldring eller graden av fedme, kan for eksempel ha forskjellige svar collagenase aktiviteter, noe som resulterer i et annet antall ASCs i autologous liggende under adipose vev-avledet sendinger42. Dessuten, avvike hvor mange stamceller i hvert gram av fettvev fra en pasient til en annen som vist av stor variasjon av rapporterte stilk cellen tallene i mange publikasjoner7,19,20, 21 , 22 , 23.

Denne protokollen presenteres i denne artikkelen er en roman, innovative prosedyre forsøker å forbedre den nåværende strategien for behandling av menneskelig kneet OA ved potensielt regenererer brusk-lignende vev med PCI injeksjoner av autologous fettvev-avledet SENDINGER. Riktig bruk av collagenase er en viktig og avgjørende skritt i denne protokollen. Bruke lukket system sprøyter holde sterilitet mens opprettholde bekvemmeligheten av utføre prosedyren er stor endring av protokollen utviklet av Zuk et al. 5 i tillegg for menneskelig program, gjenværende mengden collagenase i den endelige fettvev-avledet sendinger bør være ubetydelig å hindre noen felles betennelser. Det er begrensninger i denne protokollen: collagenase rester i det siste bindet (selv om dette kan være ubetydelig), ingen kontroll grupper som enkeltvis injisert PRP og HA, ingen biopsier, ingen bevis unntatt forbedring av kliniske symptomene skyldes PRP, små antall pasienter (pilotstudie), ingen trosset komponenter av fettvev-avledet sendinger og noen spesifikasjon av antall stamceller i alle 3 pasientene. Bruke fettvev-avledet sendinger for lidelser som en menisk tåre, chondromalacia patellae, ryggradmassasje lidelser, en forsinket helbredelse (eller ikke-healing) bein brudd, ikke-healing hud magesår, bryst gjenoppbygging, og andre medisinske lidelser kan forbedre kliniske utfallet. Selv om disse potensielle klinisk bruk fettvev-avledet sendinger, er mer grundig og energisk kliniske undersøkelser nødvendig for omfatter fettvev-avledet sendinger i klinisk innstillingene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatteren anerkjenner støtte fra ansatte på Mipro medisinsk klinikk og figur utformingen av Jaepil/David Lee. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Bio og medisinsk teknologi utviklingsprogram NRFs finansiert av MSIT (antall NRF-2017M3A9E4078014); og National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap og IKT (tall NRF-2017R1A2B4002315 og NRF-2016R1C1B2010308).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
5% Betadine (povidone-iodine)  Firson Co., Ltd. 657400260
2% Lidocaine  Daehan Pharmaceutical Co. 670603480
Tumescent solution  Myungmoon Pharm. Co. Ltd. N01BB01 The solution was composed of 500 mL normal saline, 40 mL 2% lidocaine, 20 mL 0.5% marcaine, and 0.5 mL epinephrine 1:1000.
Liberase TL and TM research grade  Roche Applied Science 5401020001
D5LR Dahan Pharm. Co., Ltd. 645101072 Dextrose 5% in lactated Ringer's solution 
Anticoagulant citrate dextrose solution  Fenwal, Inc. NDC:0942-0641 The solution was composed of 0.8% citric acid,
0.22% sodium citrate, and 0.223% dextrose.
3% (w/v) Calcium chloride  Choongwae Pharmaceutical Co. 644902101
0.5% (w/v) HA (Hyaluronic acid ) Dongkwang pharm. Co., Ltd. 645902030
0.25% Ropivacaine Huons Co., Ltd. 670600150
Equipment
3.0 mm Cannula  WOOJU Medical Instruments Co. ML30200
60-mL Luer-Lock syringe BD (Becton Dickinson)  309653
Centrifuge Barrel Kit  CPL Co., Ltd. 30-0827044
Tissue homogenizer that contains blades CPL Co., Ltd. 30-0827045
Rotating incubator mixer Medikan Co., Ltd MS02060092
Centrifuge Hanil Scientific Inc. CE1133
Magnetic Resonance Imaging Philips Medical Systems Inc. 18068
Ultrasound Imaging System Samsung Medison co., Ltd CT-LK-V10-ICM-09.05.2007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnoczky, S. P. Building a meniscus. Biologic considerations. Clinical Orthopaedics and Related Research. (367 Suppl), S244-S253 (1999).
  2. Barry, F. P. Mesenchymal stem cell therapy in joint disease. Novartis Foundation Symposium. 249, 86-241 (2003).
  3. Usuelli, F. G., et al. Adipose-derived stem cells in orthopaedic pathologies. British Medical Bulletin. 124 (1), 31-54 (2017).
  4. Zhang, H. N., Li, L., Leng, P., Wang, Y. Z., Lv, C. Y. Uninduced adipose-derived stem cells repair the defect of full-thickness hyaline cartilage. Chinese Journal of Traumatology. 12 (2), 92-97 (2009).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  8. Zhu, Y., et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell Biochemistry and Function. 26 (6), 664-675 (2008).
  9. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015 (2017).
  10. Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. Regeneration of Cartilage in Human Knee Osteoarthritis with Autologous Adipose Tissue-Derived Stem Cells and Autologous Extracellular Matrix. BioResearch Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).
  11. Alexander, R. W. Understanding Adipose-derived Stromal Vascular Fraction (AD-SVF) Cell Biology and Use on the Basis of Cellular, Chemical, Structural and Paracrine Components: A Concise Review. Journal of Prolotherapy. 4, e855-e869 (2012).
  12. Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
  13. Korean Food and Drug Administration (KFDA). Cell therapy: Rules and Regulations. KFDA. , (2009).
  14. Pak, J. Regeneration of human bones in hip osteonecrosis and human cartilage in knee osteoarthritis with autologous adipose-tissue-derived stem cells: a case series. Journal of Medical Case Reports. 5, 296 (2011).
  15. Pak, J., Chang, J. J., Lee, J. H., Lee, S. H. Safety reporting on implantation of autologous adipose tissue-derived stem cells with platelet-rich plasma into human articular joints. BMC Musculoskeletal Disorders. 14, 337 (2013).
  16. Pak, J., Lee, J. H., Kartolo, W. A., Lee, S. H. Cartilage Regeneration in Human with Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Current Status in Clinical Implications. BioMed Research International. 2016, 4702674 (2016).
  17. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. A novel biological approach to treat chondromalacia patellae. PLoS One. 8 (5), e64569 (2013).
  18. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. BioMed Research International. 2014, 436029 (2014).
  19. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  20. De Ugarte, D. A., et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs. 174 (3), 101-109 (2003).
  21. Guilak, F., et al. Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells. Journal of Cellular Physiology. 206 (1), 229-237 (2006).
  22. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  23. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  24. Liberase TL information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US (2018).
  25. Liberase TM information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/Libtmro?lang=en®ion=US (2018).
  26. Childs, J. D., Piva, S. R. Psychometric properties of the functional rating index in patients with low back pain. European Spine Journal. 14 (10), 1008-1012 (2005).
  27. Price, D. D., McGrath, P. A., Rafii, A., Buckingham, B. The validation of visual analogue scales as ratio scale measures for chronic and experimental pain. Pain. 17 (1), 45-56 (1983).
  28. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicine. 3 (5), 705-715 (2008).
  29. D'Ambrosi, R., Indino, C., Maccario, C., Manzi, L., Usuelli, F. G. Autologous Microfractured and Purified Adipose Tissue for Arthroscopic Management of Osteochondral Lesions of the Talus. Journal of Visualized Experiments. (131), e56395 (2018).
  30. Packer, J. D., Chang, W. T., Dragoo, J. L. The use of vibrational energy to isolate adipose-derived stem cells. Plastic Reconstructive Surgery-Global Open. 6 (1), e1620 (2018).
  31. Hanke, C. W., Bernstein, G., Bullock, S. Safety of tumescent liposuction in 15,336 patients. National survey results. Dermatologic Surgery. 21 (5), 459-462 (1995).
  32. Illouz, Y. G. Complications of liposuction. Clinics in Plastic Surgery. 33 (1), 129-163 (2006).
  33. Dixit, V. V., Wagh, M. S. Unfavourable outcomes of liposuction and their management. Indian Journal of Plastic Surgery. 46 (2), 377-392 (2013).
  34. Lehnhardt, M., et al. Major and lethal complications of liposuction: a review of 72 cases in Germany between 1998 and 2002. Plastic and Reconstructive Surgery. 121 (6), 396e-403e (2008).
  35. Iyer, S. S., Rojas, M. Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells: novel concept for future therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (5), 569-581 (2008).
  36. Zhang, J., Middleton, K. K., Fu, F. H., Im, H. J., Wang, J. H. HGF mediates the anti-inflammatory effects of PRP on injured tendons. PLoS One. 8 (6), e67303 (2013).
  37. Li, N. Y., Yuan, R. T., Chen, T., Chen, L. Q., Jin, X. M. Effect of platelet-rich plasma and latissimus dorsi muscle flap on osteogenesis and vascularization of tissue-engineered bone in dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 67 (9), 1850-1858 (2009).
  38. Parsons, P., et al. The biological effect of platelet rich-plasma on the fracture healing process. The Journal of bone and joint surgery. British volume. 91-B, 293 (2009).
  39. Wu, W., Chen, F., Liu, Y., Ma, Q., Mao, T. Autologous injectable tissue-engineered cartilage by using platelet-rich plasma: experimental study in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 65 (10), 1951-1957 (2007).
  40. Cooper, T. W., Eisen, A. Z., Stricklin, G. P., Welgus, H. G. Platelet-derived collagenase inhibitor: characterization and subcellular localization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2779-2783 (1985).
  41. Uzuki, M., Sawai, T. A. A comparison of the affinity of sodium hyaluronate of various molecular weights for degenerated cartilage: a histochemical study using hyaluronic acid binding protein. International Congress Series. 1223, 279-284 (2001).
  42. Pagano, C., et al. Molecular and morphometric description of adipose tissue during weight changes: a quantitative tool for assessment of tissue texture. International Journal of Molecular Medicine. 14 (5), 897-902 (2004).

Tags

Medisin problemet 139 medisin fettvev-avledet stilk celler ekstracellulær Matrix menneskelig brusk gjenfødelse slitasjegikt regenerativ medisin Mesenchymal stamceller
Klinisk protokollen produsere fettvev-avledet pancreatic for potensielle brusk gjenfødelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J.,… More

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J., Park, K. S., Jeon, J. H., Jeong, B. C., Lee, S. H. Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (139), e58363, doi:10.3791/58363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter