Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Le rôle des vaisseaux lymphatiques et les ESL dans le foie n’est pas bien compris. Alors que les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte du foie¹ et augmentent au cours de la maladie², très peu est entendu au sujet de la fonction et du phénotype des ESL dans le foie. Avec la découverte de marqueurs que l'on trouve principalement sur ESL³, l’importance de ces cellules à l’intérieur des niches de différents tissus dans l’homéostasie et la maladie comblera une lacune importante dans notre compréhension. ESL ont un rôle majeur dans le maintien de la tolérance périphérique dans le ganglion lymphatique et dans des tumeurs métastatiques en interagissant directement avec les cellules des T^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. ESL dans le ganglion lymphatique peut favoriser l’immunité protectrice par l’intermédiaire de leurs interactions avec les cellules dendritiques migrateurs^14,15,16. Par conséquent, il y a des rôles multiples pour les ESL qui peut-être être spécifiques à des tissus et des interactions dans lesquelles ils sont présents. Toutefois, très peu est comprise sur ESL l’interaction avec les cellules immunitaires dans les tissus ou le fonctionnement des ESL dans différents organes ; ainsi, évaluer ESL sur une base par cellule dans le foie ou d’autres organes peut-être entraîner avances dans comment ESL programmer l’immunité tissulaire spécifique. Alors qu’une grande partie de la littérature qui se concentre sur l’ESL dans le foie utilise la microscopie pour visualiser les ESL à l’aide d’un ou deux marqueurs et morphologie¹⁷, très peu a été fait afin d’évaluer plus précisément ESL sur une base de la cellule par cellule à l’aide de cytométrie en flux, si une étude a fait évaluer les différences entre cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) et ESL¹⁸. Être capable d’analyser les populations ESL dans le foie par cytométrie en flux permet l’étude approfondie du phénotype LEC pendant homéostasie normale ou d’une maladie.

Evaluer ESL par cytométrie en flux, plusieurs marqueurs de surface sont nécessaires. En général, ESL sont visualisées par l’expression de prospero liés boîte homéotique 1 (Prox-1), le récepteur acide hyaluronique endothéliale de vaisseau lymphatique 1 (LYVE1) ou le récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 3 (VEGFR3) à l’aide de la microscopie. Toutefois, dans le foie, l’expression de ces marqueurs n’est pas limitée aux ESL. Prox-1 est largement exprimée par les hépatocytes pendant le développement du foie, régénération et blessures¹⁹, et LYVE1 et VEGFR3 sont exprimés par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques¹⁸. Dans le ganglion lymphatique, ESL sont identifiés comme des grappes de différenciation (CD) à l’aide de cytométrie CD45, CD31 + et podoplanin + (PDPN)¹⁶. Cependant, cette approche est trop minime pour isoler les ESL dans le foie comme cellules CD45 - CD31 + capturera les cellules endothéliales, et la population prédominante des cellules endothéliales vasculaires dans le foie est LSECs. Ainsi, les autres marqueurs sont nécessaires pour distinguer la population ESL rare de la population de LSEC abondante. CD16/32 (exprimées par mature LSECs¹⁸) et CD146 (un cellule endothéliale vasculaire marqueur commun qui est principalement exprimé dans les sinusoïdes du foie par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques²⁰ avec peu ou aucune expression de lymphatique les cellules endothéliales²¹) ont été les marqueurs candidats.

Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour isoler et visualisation des ESL dans le foie aide ci-dessus marqueurs, CD45, CD31, CD146, CD16/32 et PDPN pour la cytométrie en flux. Nous décrivons l’utilisation de collagénase IV, DNase 1 et séparation mécanique pour la digestion du tissu hépatique en une suspension de cellules individuelles. Nous décrivons également l’utilisation de gradient de densité d’iodixanol pour l’isolement de cellules non parenchymateuses (NPC) et d’éliminer les débris cellulaires. Enfin, à l’aide de plusieurs marqueurs, nous déterminons la stratégie de blocage de cytométrie en flux flux optimal pour identifier des ESL du foie avec PDPN comme marqueur prédominant.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Colorado Campus médical d’Anschutz.

1. préparation des matériaux

1. Préparer une solution de 5 mg/mL de DNase I dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Faire un mélange de digestion en ajoutant 5 000 U/mL de collagénase IV aux médias EHAA de clic.
3. Réchauffer le mélange de digestion à 37 ° C pendant 30 min avant de l’utiliser.
4. Faire un tampon d’isolement en ajoutant 4,8 % d’albumine sérique bovine (BSA) et l’acide éthylènediaminetétraacétique 2 mM (EDTA) à Hanks balanced solution saline (HBSS).
5. Faire un tampon de lyse des globules rouges (RBC) en ajoutant le chlorure d’ammonium 100 mM, 10 mM KHCO₃et 0,1 mM EDTA à eau distillée H₂O.

2. Elaboration d’une Suspension de cellules individuelles d’un foie de souris

1. Euthanasier la souris avec le CO₂ et de la dislocation cervicale.
2. Vaporiser vers le bas de la souris avec l’éthanol à 70 % pour mouiller sa fourrure. Broche de la souris pieds devant un Conseil de dissection.
3. Utiliser des ciseaux de dissection pour couper la peau environ 1 cm au-dessus de l’anus, en veillant à ne couper qu’à travers la peau (environ 1 mm). Tirez la peau du corps avec une pince crantée et insérer les ciseaux entre la peau et le péritoine. Ouvrez les ciseaux pour séparer la peau du péritoine et, ensuite, couper la peau de l’incision au cou.
4. Épinglez la peau à l’Office de la dissection à l’aide d’une broche sous chaque bras et au-dessus de chaque jambe. Tirer le sac péritonéal et couper vers le haut vers le cou. Saisir les lobes du foie et coupez juste en dessous du sternum.
   Remarque : Il faut si tout du foie sera utilisé pour l’immunohistochimie (IHC).
5. Couper autour du foie et retirez le foie de la souris et le placer dans 4 mL de médias EHAA de clic.
6. À l’aide d’un scalpel, couper le foie en ~ 1 mm de diamètre.
7. Ajouter 500 µL du mélange digestion et 500 µL de la DNase I (2 mg/mL) pour le foie.
8. Incuber le foie pendant 30 min à 37 ° C. Après 15 min, mélanger le liquide à l’aide d’une pipette de 5 mL.
9. Après 30 min d’incubation, transférer l’échantillon digéré à travers un tamis de 100 µm dans un tube conique de 50 mL.
10. Poussez délicatement les pièces restantes à travers le filtre avec le piston d’une seringue de 1 mL.
11. Laver le filtre avec 5 mL de tampon d’isolement et poussez doucement le tissu à travers la passoire avec le dos d’un piston d’une seringue de 1 mL. Répétez cette procédure jusqu'à ce que le filtre est lavé avec 25 mL de tampon d’isolement.
12. Centrifuger les cellules à 400 g pour 5 min. aspirer soigneusement éteint le surnageant.
13. Resuspendre le culot avec 4 mL de tampon de lyse de RBC. Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 min.
14. Laver les cellules avec 10 mL de tampon d’isolement et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
15. Compter les cellules sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre complet de foie.
16. Remettre en suspension des cellules dans 5 mL d’iodixanol de 20 % et leur couche avec 1 mL de PBS.
17. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 15 min sans un frein.
18. Enlever la couche entre le CPE et l’iodixanol et placez-les, à travers un filtre de 100 µm, dans un nouveau tube conique de 50 mL.
19. Laver les cellules avec 10 mL de tampon d’isolement et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
20. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules de 500 µL de PBS avec 2 % sérum fœtal (SVF).

3. cytométrie de cellules du foie

1. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et microscope, utilisant le bleu trypan exclusion pour mesurer les cellules viables. Ajouter 10 µL de cellules à 10 µL de bleu trypan et placez-les immédiatement sur un hémocytomètre et compter les cellules vivantes (pas bleus) sous un microscope. Ensuite, calculez le nombre de cellules par microlitre.
2. Aliquote environ 5 millions de cellules parenchymateuses restantes dans un seul puits d’une plaque de 96 puits.
3. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules 90 µL de PBS contenant 2 % FBS.
5. Ajouter anti-CD45 (1 : 200), anti-CD146 (1 : 200), anti-CD31 (1 : 200) et PDPN (1 : 200) diluée dans 10 µL de 10 x 2.4G2 ou anti-CD16/32 (1 : 200).
   Remarque : Aucun bloc de Fc (2.4G2) a été utilisé lorsqu’on utilise des anticorps anti-CD16/32-étiqueté.
6. Pour déterminer où les portes positives et négatives doivent être définies, inclure une fluorescence moins une tache (FMO) pour chaque couleur et un anticorps de contrôle isotype.
7. Pour déterminer les vivants contre les cellules mortes, détachant avec un marqueur de viabilité (p. ex., le fantôme rouge 780). Incuber les cellules à 4 ° C pendant 30 min.
8. Laver les cellules avec 100 µL de PBS contenant 2 % FBS.
9. Une petite aliquote de cellules permet d’ajuster les paramètres laser et de compensation sur le cytomètre en flux. Colorer les cellules avec un anticorps dirigé contre chaque fluorophore individuel et l’autre sans n’importe quel anticorps.
   Remarque : Selon le cytomètre en flux utilisé, une matrice de compensation devrait être établie pour éliminer le chevauchement spectrale.
10. Placer le tube d’échantillon sur la sonde cytomètre et recueillir et enregistrer tous les événements.

4. analyse des données

1. Regarder diffusion latérale aire vs attaquant-scatter, porte sur des cellules « vivantes » basé sur la taille et de granularité et de viabilité colorant marqueur.
2. Ensuite, à l’aide de CD45 brillant Violet 510 et CD31 PerCp Cy5.5, porte sur les cellules CD45 - CD31 + à l’aide de l’isotype contrôles et FMO afin de déterminer les populations positives et négatives.
3. Enfin, en utilisant CD146 v450 ou CD16/32 FITC et PDPN APC, prendre la CD146 - PDPN + ou CD16/32-PDPN + cellules, à l’aide de contrôles isotype et FMO, pour déterminer les populations positives et négatives. Ces cellules sont les ESL.

Des études analysant les vaisseaux lymphatiques du foie ont principalement utilisé immunohistochemistry pour quantifier la fréquence et le diamètre des vaisseaux lymphatiques dans le foie. Cependant, cette méthode ne permet pas pour l’évaluation d’ESL sur une base de la cellule par cellule, ou pour l’expression de multiples marqueurs, cytokines, chimiokines ou des facteurs de transcription. Par conséquent, nous avons demandé si foie ESL pouvait être isolées du foie et évaluées à l’aide de cytométrie en flux. Des travaux antérieurs, isoler le ganglion ESL a effectué un Liberase DL (collagénase i-II-et-a) et DNase 1 combiné avec la séparation mécanique du tissu ganglionnaire avec aiguilles14,16. Par conséquent, le même protocole de digestion sur tissu hépatique a été utilisé, ou collagénase IV et DNase 1 a été utilisé comme décrit précédemment, pour l’isolement de cellules immunitaires de la foie22 et suivie de la digestion avec une étape de séparation dégradé (iodixanol) de densité à Retirez les hépatocytes et augmenter la fréquence des autres types de cellules dans le foie (Figure 1 a). Suite à la digestion du foie et de la centrifugation avec le gradient de densité, les cellules ont été colorées avec CD45, CD31, PDPN et CD16/32. CD16/32 a été décrite pour être exprimées par les populations LSEC matures, mais pas ESL populations18. Ainsi, ESL étaient bloquées que CD45-, CD31 +, CD16/32-, PDPN + cellules, tandis que les LSECs ont été bloqués comme CD45-, CD31 +, CD16 / 32 + et PDPN-(Figure 1 a). Portes ont été mis sur des cellules vivantes (négatif fantôme rouge) et basés sur isotype contrôles et FMO coloration (Figure 1 a). LYVE-1 APC sur la population de l’ESL a également été confirmée (Figure 1 b). Les deux méthodes ont permis la visualisation de la population de l’ESL dans le foie ; Cependant, le profil de coloration des cellules a été visuellement mieux lors de l’utilisation de collagénase IV et DNase 1 à collagénase I-II-et-a (Figure 1). Par conséquent, toutes les manipulations futures ont été effectuées à l’aide de collagénase IV et DNase 1, tel que décrit dans le protocole. En moyenne, nous avons obtenu environ 1 300 ESL par gramme de tissu hépatique ou 2 200 ESL par naïve du foie, à l’aide de cette méthode de digestion.

Pour optimiser la stratégie de blocage et la combinaison des fluorophores et éliminer la contamination de LSECs, CD16/32 et CD146 ont été utilisés. CD16/32 est les récepteurs Fc gamma II et III et s’exprime sur LSECs matures mais pas sur ESL18. CD16/32 pourraient distinguer les PDPN + CD16/32-cellules de la PDPN-CD16 / 32 + cellules, surtout quand à l’aide de PDPN conjugué à l’APC ou PE et CD16/32 conjugué FITC (Figure 1 a), mais moins bien quand PDPN est conjugué aux PE-Cy7 (Figure 1). L’expression du CD16/32 ne se trouve pas sur ESL, mais se trouve sur LSECs. FC bloc utilise les anticorps CD16/32 pour minimiser la fixation aux récepteurs Fc et fixation spécifique nonantigen d’immunoglobulines sur les récepteurs Fc. Comme CD16/32 a été utilisé pour visualiser les LSECs, la liaison non spécifique des immunoglobulines était plus élevée et CD146 a été optimisé comme alternative à mesurer LSECs. Par conséquent, nous avons testé CD146 conjugué à V450, un marqueur des cellules endothéliales vasculaires exprimé fortement par les LSECs et autres cellules endothéliales vasculaires20 mais à faible ou aucune expression par ESL23. Tout d’abord, nous avons optimisé la coloration des CD146 utilisant FMO et isotype contrôles pour CD16/32 et le CD146 (Figure 2 a). Si nous avons ne évalué que le CD16 / 32 + cellules ou les CD16/32-cellules, le CD16 / 32 + cellules étaient tous CD146 + et PDPN - tandis que les cellules CD16/32 étaient principalement CD146 - et PDPN - ou PDPN + (Figure 2 b). Pour confirmer cette coloration, la FMO a été utilisé. En supprimant les PDPN de la tache, la population PDPN + a disparu (Figure 2). Fait intéressant, il n’y a aucune CD146 + PDPN + cellule, confirmant que CD146 n’est pas exprimée d’ou très humbles PDPN + ESL. Ainsi, nous sommes convaincus qu’une des ces marqueurs peuvent être utilisée pour porte sur les cellules endothéliales vasculaires dans le foie.

Afin de valider davantage que PDPN est un marqueur approprié pour les ESL, les sections du foie de souris ont été colorées avec PDPN (vert) et F4/80 (brun) (Figure 3 a). L’endothélium vasculaire ni macrophages exprimé PDPN dans le foie de souris. Nous avons également pu distinguer cholangiocytes, qui peuvent tacher positive pour PDPN, de vaisseaux lymphatiques, basé sur la structure nucléaire distincte des voies biliaires et de coloration de la cytokératine 7 (Figure 3 b; rouge : cytokératines 7, vert : PDPN). Étant donné que plusieurs marqueurs sont utilisés pour la cytométrie en flux, tels que CD31, qui n’est pas exprimée par cholangiocytes24, nous sommes confiants que nous retirons ces cellules de l’analyse, confirmant ainsi que les cellules du foie qui sont CD146 CD45-, CD31 +, lo/neg, CD16/32-, et PDPN + sont ESL. Enfin, pour fournir des preuves que les cellules colorées sont ESL, tri de cette population de cellules et PCR en temps réel qualitative permettant d’évaluer les expressions Vegfr3 et prox-1 . Les Vegfr3 et prox-1 ont été évaluées, comme ces transcriptions sont exprimées par les autres cellules du foie —prox1 par les hépatocytes et Vegfr3 de LSECS (entre autres), mais aucune autre cellule outre ESL n’expriment tous les deux. L’expression de ces deux marqueurs était significativement plus élevée dans la population triée que dans la lignée de cellules macrophages de souris cultivées (RAW264.7) qui n’exprime pas normalement ces marqueurs, mais est similaire dans l’expression aux ESL murins cultivés (Figure 3 ).

Figure 1 : Analyse en cytométrie en flux représentatif de collagénase I-II-a et de tissu hépatique murin de la IV-digéré collagénase. (A), ce panneau indique la stratégie de blocage, fluorescence moins une coloration, et isotype contrôles pour la procédure. (B) ce panneau montre la LYVE-1 coloration du CD16/32-cellules PDPN +. (C), ce panneau montre la porte de cytométrie de flux final après digestion des foies de souris avec deux collagénase I-II-a (p. ex., Liberase DL) ou collagénase IV et évaluation CD16/32 X PerCP PDPN PE-Cy7 où ESL sont CD16/32- et PDPN +. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Identification des CD146 et PDPN comme marqueurs appropriées pour les cellules endothéliales lymphatiques hépatiques. (A), ce panneau affiche fluorescence moins seul et isotype contrôles pour CD16/32 (à gauche) et CD146 (à droite). (B) ce panneau montre des cellules positives ou négatives CD16/32 gated déterminés de panneau A. Montré est CD146XPDPN des deux populations. (C) ce panneau montre fluorescence moins un pour PDPN de démontrer que la coloration est absent lorsque l’anticorps n’est pas ajouté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Identification des flux PDPN + cellules endothéliales aussi lymphatique. Foie (A), ce panneau montre l’immunohistochimie représentatif d’une souris coloré avec le PDPN (bleu/vert) et F4/80 (brun). Le vaisseau lymphatique (LV), des vaisseaux sanguins (BV) et macrophages (MF) sont étiquetés. Echelle = 100 µm. des tissus fixés au formol paraffine était déparaffinées pendant 20 min dans le xylène. Les tissus étaient hydratés dans l’eau à travers un dégradé de l’éthanol, et recherche d’antigène a été réalisée à l’aide de tampon d’extraction d’antigène pH 6 dans un autocuiseur pour 15 min. de tissu a été bloqué à l’aide de 0,1 % de BSA et colorées à l’aide de anti-souris PDPN et anti-souris F4/80 pendant 1 h à la salle température. Anti-hamster IgG HRP et HRP d’IgG anti-lapin servaient d’anticorps secondaires. 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) + et Vina vert ont été utilisés pour détecter la F4/80 et PDPN, respectivement. Le tissu a été eosine à l’hématoxyline et imagé sur un Microscope. (B) ce panneau montre la même expérience réalisée comme panneau A, sauf ici, PDPN est indiquée en vert, cytokératine 7 en 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) en bleu et rouge. Echelle = 100 µm. le tissu a été bloqué à l’aide de l’âne de 5 % et 5 % de sérum de chèvre et colorées à l’aide de anti-souris PDPN (8.1.1) au 1/100 et anti-souris cytokératine 7 1 : 200 pendant 1 h à température ambiante. Anti-hamster IgG AF647 et anti-lapin IgG-PE était utilisés comme anticorps secondaires. Le tissu a été eosine au DAPI et imagé. Echelle = 100 µm. Le vaisseau lymphatique (LV), des vaisseaux sanguins (BV) et biliaires (BD) sont étiquetés. (C), ce panneau montre un pli journal changer dans expression Vegfr3 et prox-1 trié foie ESL basés sur la coloration dans le protocole (CD45 - CD31 +, CD146lo/neget PDPN +) comparativement aux cellules brutes ou primaire, ganglions murines ESL. Cellules triées étaient insérées dans une colonne de biopolymère-déchiquetage, l’ARN a été extrait à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN et ADNc a été effectuée à l’aide d’un kit de transcription inverse. Abondance de transcription a été normalisée pour le gène de l’entretien ménager, Gapdh, pour chaque échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.